CN102940890B - 基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人源dcf1基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值和诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。本发明通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC-1染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对dcf1诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcf1通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，dcf1能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。<i/>

Description

基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用

技术领域

本发明涉及了一种人源dcf1的新用途。特别是人源dcf1基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用。

背景技术

脑胶质瘤（glioma）是由神经外胚层分化而来的胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等）发生的肿瘤。胶质瘤在颅内肿瘤中发病率位于第一位，约占45%左右。胶质瘤的治疗问题是神经外科中较为棘手的一个问题，由于其死亡率高，预后较差，无法控制的细胞增殖、细胞凋亡减慢，肿瘤细胞侵袭性强等使肿瘤的治疗面临巨大的困难，患病后手术加放化疗的平均生存期仅为8～11个月。目前肿瘤治疗主要有以下几种方法：手术治疗、化学药物、治疗放射治疗、光动力治疗。但这四种治疗方法对大脑损伤性大，易复发，对患者机体消耗大，也无法起到根治目的。

树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，dcf1）又名跨膜蛋白59（transmembrane protein 59，tmem59），是单次跨膜蛋白。根据基因芯片GDS2853分析显示，随着胶质瘤级别的升高，dcf1基因表达量呈现下调状态。同时，dcf1基因敲除小鼠基因芯片和蛋白芯片表明，敲除dcf1后，gfap（胶质细胞标记物）表达量上调。2008年Wang, L; et al研究证明，在神经干细胞中，过量表达dcf1，可维持神经干细胞未分化状态，而沉默dcf1则能促进神经干细胞的分化。2012年 Li, X; et al通过小分子microRNA-351，下调dcf1的表达后，神经干细胞系C17.2向胶质方向分化。以上结果都表明，dcf1表达量下调可能促进胶质细胞发生。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种人源dcf1基因在诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。

本发明的目的之二在于提供人源dcf1基因在抑制U251胶质瘤细胞系增值中的应用。

本发明的目的之三在于提供人源dcf1基因在抑制肿瘤生长中的应用。

技术方案：本发明通过培养U251胶质瘤细胞系，运用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent 阳离子脂质体转染法，在U251细胞中分别转染pEGFP-N2和pEGFP-N2-DCF1，使其分别表达EGFP绿色荧光蛋白和EGFP-DCF1融合蛋白，前者作为对照。发绿色荧光的融合蛋白可指示dcf1在细胞中的分布，进一步运用dcf1一抗和胶体金二抗，可在电镜下观察胶体金颗粒，从而确定其亚细胞定位。通过CCK8试剂盒，检测细胞增殖能力。JC-1染料检测细胞线粒体膜电位。电镜和原子力显微镜观察线粒体外观，判断线粒体是否发生病变。Western检测过表达dcf1后凋亡相关蛋白表达量是否发生变化，从而在凋亡机制上做初步探索。运用裸鼠肿瘤异位移植技术，在体内层面判断dcf1基因对胶质瘤的治疗作用。

本发明通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC-1染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对dcf1诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcf1通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，dcf1能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。

附图说明

图1为：dcf1基因扩增及重组质粒pEGFP-N2-DCF1酶切鉴定。A图为以Hela细胞cDNA为模板，通过PCR法扩增获得人源dcf1基因片段，全长972bp。图中最左边泳道为DNA Marker（SM#0311），泳道1为dcf1基因PCR后扩增产物。B图为重组质粒pEGFP-N2-DCF1酶切鉴定图。泳道1为空载pEGFP-N2经EcoRI单酶切，2-5为阳性克隆经EcoRI和BamHI双酶切后释放出目的条带dcf1(972bp)及空载片段(4700bp)。表明重组质粒pEGFP-N2-DCF1构建成功，经测序验证正确后用于后续实验方案。

图2为：U251细胞系中转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1。EGFP-DCF1融合蛋白（图A,C）呈现核外点状分布，B图为DAPI细胞核染色，E图DCF1蛋白免疫荧光，C图为A图与B图叠加。F图为D图与E图叠加。（放大倍数：200倍；标尺50um）

图3为：EGFP-DCF1融合蛋白与线粒体染料MitoTracker-Red共定位。EGFP-DCF1融合蛋白（图A）与线粒体（图B）存在共定位， C图为A图与B图的叠加。

图4为：dcf1基因可定位于线粒体。Western检测转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1的U251细胞系线粒体中有DCF1蛋白的存在（图A）。DCF1免疫电镜观察发现在转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1的U251细胞系线粒体处有少量胶体金被标记（图B）。（放大倍数：20000倍；标尺500nm）

图5为：在胶质瘤细胞系中过量表达dcf1可抑制细胞增殖能力。U251细胞系过量表达dcf1引起细胞增殖能力下降，细胞皱缩（图A），从左至右依次为对照组，转染空载质粒pEGFP-N2组，转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1。CCK8检测表明dcf1能极显著降低U251细胞增殖能力（图B），同时也表明dcf1能显著降低U87MG细胞系增殖能力，但其抑制效果比U251稍差（图C）。但dcf1基因过量表达对K562，H1299，Hek293T细胞系增殖能力未有影响。*,P<0.1;**,P<0.05,***,P<0.001。（放大倍数：100倍；标尺200um）

图6为：过量表达dcf1可引起U251细胞系线粒体膜电位下降。U251细胞系经线粒体电子传递链抑制剂CCCP处理后，线粒体膜电位下降，JC-1无法聚集，呈现绿色（图A）。对照组线粒体膜电位正常，JC-1聚集体呈红色（图B）。转染空载质粒pEGFP-N2组，JC-1也呈现红色，大块绿色为EGFP发光（图C）。转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1 48小时候，JC-1主要呈现绿色，与药物处理组相似（图D），说明过表达dcf1后，U251细胞线粒体膜电位发生下降。（放大倍数：100倍；标尺200um）

图7为：过表达dcf1引起U251细胞线粒体肿胀，最终引起细胞凋亡。（A,D,G）图为对照，（B,E,H）图为U251细胞转染空载对照pEGFP-N2，（C,F,I）图为U251细胞转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1。（A-C）图为透射电镜观察U251细胞结构。对照与空载组细胞结构完整，核仁清晰可见（图A,B）；实验组细胞核裂解，胞质中出现大量空泡状结构，并包含数个自噬体存在，呈现典型凋亡特征（图C）。（D-F）图为透射电镜观察细胞线粒体结构形态。对照与空载组线粒体结构完整，可见嵴结构存在（图D,E）；实验组中多个线粒体发生严重肿胀，嵴发生破裂，存在严重病变（图F）。（G-I）图为原子力显微镜观察抽提的U251细胞线粒体。对照与空载组线粒体尺寸在600nm左右，表面光滑（图G,H）；实验组线粒体发生肿胀，尺寸在1600nm左右，且线粒体外膜呈现多孔状结构，这与线粒体通透性孔开放有关，表明线粒体功能发生异常（图I）。

图8为：凋亡相关重要蛋白Western检测。结果表明，过表达dcf1后，凋亡关键蛋白procaspase-3酶被剪切成有活性的形式（17kD,19 kD），抑凋亡基因Bcl-2表达发生下调，促凋亡基因Bax表达上调。从机制上对dcf1引起U251细胞凋亡做出初步解释。

图9为：裸鼠成瘤实验结果表明dcf1能显著减小胶质瘤的体积，抑制肿瘤生长。A图为接种U251细胞裸鼠成瘤结果，B图为A图中肿瘤鼠解剖后所得肿瘤体积比较。从左至右分别为注射U251细胞，注射转染空载对照pEGFP-N2 U251细胞，注射转染重组质粒pEGFP-N2-DCF1 U251细胞。图中明显可见实验组肿瘤体积小于对照组，且在成瘤时间及肿瘤生长速度上也有明显差异。

具体实施方式

实施例一：dcf1基因扩增及重组质粒pEGFP-N2-DCF1酶切鉴定

1、以HeLa细胞的cDNA为模版进行PCR扩增，在dcf1引物两端分别引入EcoRI和BamHI酶切位点。上游引物为(5’-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGGAG-3’)，

下游引物为(5’-CGGGATCCGTAAAATTTCAGAATGAGCA-3’)，Tm为53摄氏度，30个循环后获得大小为972bp的目的片段（图1A）。

2、获得阳性重组质粒pEGFP-N2-DCF1后，对重组子进行双酶切鉴定。酶切体系中同时添加EcoRI和BamHI两种酶，对照采用pEGFP-N2 EcoRI单酶切，37摄氏度反应2小时，电泳鉴定酶切结果，在972bp处有条带释放，说明dcf1片段已插入到阳性重组质粒中（图1B）。

实施例二：质粒pEGFP-N2-DCF1转染

U251细胞系铺24孔板24小时后，采用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent阳离子脂质体转染法转染质粒pEGFP -N2-DCF1。每孔1ul lipo2000，1ug质粒pEGFP-

N2-DCF1分别溶于50ul无血清DMEM培养基，室温静置5分钟后，将两者混匀，室温静置20分钟。将孔板中培养基更换成400ul无血清DMEM，加入100ul上述混合产物。37摄氏度培养6小时后，将培养基换成含10%胎牛血清DMEM。转染后48小时检测荧光发光情况（图2A-C）。

实施例三：细胞免疫荧光

U251细胞转染后48小时，弃培养基，PBS洗三次。4%PFA固定10分钟，PBS洗三次。1‰Triton-X100通透10分钟，PBS洗三次。2%BSA-PBS室温封闭1小时。1%BSA-PBS稀释DCF1兔源多抗（1:700），37摄氏度孵育1小时，PBS洗三次。1%BSA-PBS稀释TRITC荧光二抗（1:300），避光37摄氏度孵育40分钟，PBS洗三次，荧光显微镜观察（图2D-F）。

实施例四：线粒体染料Mitotracker-Red染色

含10%胎牛血清DMEM培养基配制Mitotracker-Red工作液（1:1500），37摄氏度预热。弃培养基，PBS洗一次。加入预热Mitotracker-Red工作液，37摄氏度孵育30分钟。弃去染色液，加入预热的含10%胎牛血清DMEM，荧光显微镜观察（图3）。

实施例五：Western 

细胞培养于60mm培养皿，弃培养基，4摄氏度保存的PBS洗三次。置于冰上，加入100ul细胞蛋白裂解液。每隔15分钟枪头吹打混匀，反应1小时后将裂解液收集于1.5ml EP管中。4℃，12000rpm离心10分钟。上清即为细胞全蛋白，BCA法测定浓度。每孔蛋白上样量为25ug。电泳条件浓缩胶80V，30分钟；分离胶120V，90分钟。转膜条件20V，90分钟。一抗稀释比例1:3000，二抗稀释比例1:10000（图4A）。

实施例六：免疫电镜

取置于镍网上电镜切片，1%双氧水室温处理10分钟，PBS（pH7.4）洗三次。镍网浮于1%BSA－PBS（pH7.4）液滴上，室温孵育1小时，阻断非特异性吸附。镍网转移至1%BSA－PBS（pH7.4）稀释的一抗（1:700）液滴上，4℃孵育过夜。PBS（pH7.4）洗三次，PBS（pH8.2）洗三次。1％BSA-PBS（pH8.2）37℃孵育l 小时。胶体金二抗用1％BSA-PBS（pH8.2）稀释（1：50），淡红色为适宜稀释液，载网浮于该液滴上，室温孵育30分钟。PBS (pH8.2)洗三次，PBS (pH7.4)洗三次。吸干PBS后送样观察（图4B）。

实施例七：CCK8细胞增殖能力检测

于转染开始0小时，每隔12小时对细胞增殖能力进行检测。96孔板中，反应液为4ulCCK8+96ul无血清DMEM，37摄氏度避光反应30分钟。酶标仪测OD450nm处吸光值，绘制增殖曲线（图5）。

实施例八：JC-1检测线粒体膜电位

U251细胞转染48小时后，弃培养基，PBS洗一次。加入配制好的JC-1染色液（每1ml染色液=5ul JC-1+800ul ddH₂O+200ul 5X染色缓冲液），37摄氏度避光反应20分钟。弃染色液，JC-1染色缓冲液（1X）洗两次。荧光显微镜下拍照观察（图6）。

实施例九：裸鼠肿瘤移植

胰酶消化后分别收集转染pEGFP-N2、pEGFP-N2-DCF1 48小时后的U251细胞及只添加Lipo2000的U251细胞，数量为2*10⁷ 。注射于雄性6周BALB/c裸鼠右侧腋下，留针30秒，共三组，每组4只。观察裸鼠成瘤情况（图9）。

序列表

<110>  上海大学

<120>  基因在脑胶质瘤细胞的抑制与凋亡中的应用

<160>  2

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

CGGAA  TTCAT  GGCGG  CGCCG  AAGGG  GAG                        28  

 

 

<210>  2

<211>  28

<212>  RPA

<213>  人工序列

<400>  1

CGGGA  TCCGT  AAAAT  TTCAG  AATGA  GCA                         28

Claims (2)

1.人源dcf1基因在诱导U251胶质瘤细胞系凋亡中的应用。

2.人源dcf1基因在抑制U251胶质瘤细胞系增殖中的应用。

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