CN102925576B - 检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对及其应用。本发明所提供的引物对为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。实验证明，扩增出475bp、677bp和786bp三条带的小麦品种中，有98.29%为高脂肪氧化酶活性小麦品种；扩增出475bp和786bp两条带的小麦品种中，有80.06%为低脂肪氧化酶活性小麦品种；本发明所提供的检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的方法可靠、简便、实用，在小麦种质资源评价和育种标记的辅助选择中具有重要应用前景，同时为培育耐存储的小麦品种提供了参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对及其应用。
背景技术
小麦是我国的主要储粮作物之一，良好的储粮品质对粮食安全具有重要意义。在一般的储藏条件下，小麦从第二年开始逐渐陈化变质，南方高温高湿地区尤为明显。影响小麦储藏品质的因素较多，包括收获季节的气候条件、晾晒、运输、仓储等外在环境条件和脂肪氧化酶活性等内在因素，且脂肪氧化酶活性高低是直接影响小麦耐储藏性的主要内在原因。因此，开发LOX基因的分子标记，利用分子育种手段，培育耐存储的小麦品种，是解决粮食安全的重要途径之一。
1932年，Andre和Hou首次提出脂肪氧化酶（LOX或Lpx，lipoxygenase）的存在，在那以后LOX的研究取得快速的发展。研究者们先后在大豆、拟南芥、水稻、向日葵、黄瓜、亚麻、大麦和小麦等作物植株和籽粒中发现了LOX。目前，已有的研究表明，LOX活性低，有利于增强小麦等作物的耐储藏性。LOX基因在大麦中的研究较多，大麦LOX基因DNA序列已经发表（GenBank编号HVU83904）。在普通小麦中，对LOX的研究较少，王慧等研究发现，LOX活性在基因型间和环境间的差异皆达到极显著水平，且基因型对小麦LOX活性的效应大于环境及基因型与环境互作效应，认为基因型是影响小麦LOX活性的主要因素，但环境因素亦不可忽视。Hongwei Geng等在研究普通小麦的TaLox-B1时发现，TaLox-B1位点存在两个具有SNP的等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b，LOX活性较高的小麦品种含有TaLox-B1a，LOX活性较低的小麦品种含有TaLox-B1b。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对及其应用。
本发明所提供的检测小麦脂肪氧化酶活性的引物对，为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
其中，序列1由21个核苷酸组成；序列2由23个核苷酸组成。
所述检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对在检测小麦脂肪氧化酶活性中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测小麦脂肪氧化酶活性的方法。
本发明所提供的检测小麦脂肪氧化酶活性的方法具体可包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，以所述引物对进行PCR扩增，获得PCR
（2）检测步骤（1）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性：若所述PCR产物中含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中不含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
在上述方法中，所述检测步骤（1）所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示677bp的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上不显示677bp的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
本发明所提供的检测小麦脂肪氧化酶活性的方法具体也可包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，以所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
（2）检测步骤（1）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性：若所述PCR产物为大小分别是475bp、677bp和786bp的三个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中为大小分别是475bp和786bp的两个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
在上述方法中，所述检测步骤（1）所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示475bp、677bp和786bp三个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示475bp和786bp两个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
在上述两个检测小麦脂肪氧化酶活性的方法中，所述PCR扩增的退火温度具体为55℃。
所述检测小麦脂肪氧化酶活性的引物对，或所述检测小麦脂肪氧化酶活性的方法在如下（a）-（f）中的应用也属于本发明的保护范围：
（a）筛选脂肪氧化酶活性高的小麦品种；
（b）筛选脂肪氧化酶活性低的小麦品种；
（c）筛选耐储藏小麦品种；
（d）培育脂肪氧化酶活性高的小麦品种；
（e）培育脂肪氧化酶活性低的小麦品种；
（f）培育耐储藏小麦品种。
本发明的再一个目的是培育耐储藏小麦品种的方法。
本发明所提供的培育耐储藏小麦品种的方法具体可包括采用通过上述两个检测小麦脂肪氧化酶活性的方法中的任一个检测得到的所述脂肪氧化酶活性低的小麦品种作为亲本进行育种的步骤。
在本发明中，所有所述肪氧化酶活性高的小麦均为小麦籽粒脂肪氧化酶活性高于9.0nkat/g的小麦；所有所述肪氧化酶活性低的小麦均为小麦籽粒脂肪氧化酶活性低于7.1nkat/g的小麦。所述肪氧化酶活性的测定方法是以亚油酸为底物进行分光光度检测。
本发明对148份小麦品种的统计实验结果表明，扩增出475bp、677bp和786bp三条带的小麦品种中，有98.29%为高脂肪氧化酶活性小麦品种；扩增出475bp和786bp两条带的小麦品种中，有80.06%为低脂肪氧化酶活性小麦品种。本发明所提供的检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的方法可靠、简便、实用，在小麦种质资源评价和育种的标记的辅助选择中具有重要应用前景，同时为培育耐存储的小麦品种提供了参考依据。
附图说明
图1为引物LOX1-wp02对6个高LOX活性小麦品种和6个低LOX活性小麦品种PCR扩增的电泳结果。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道01为小麦品种内乡188；泳道02为小麦品种周麦11；泳道03为小麦品种蒿优9409；泳道04为小麦品种淮麦19；泳道05为小麦品种扬辐麦5242；泳道06为小麦品种安农9403；泳道07为小麦品种郑麦9405；泳道08为小麦品种济麦21；泳道09为小麦品种鲁麦22；泳道10为小麦品种周麦16；泳道11为小麦品种皖协497；泳道12为小麦品种鹤麦026。
图2为条带a、b、c（序列3、4、5）三条核酸序列的比较分析结果。其中，为引物序列，～～～～为内含子区域。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦品种（系）安农9267、宛抗18、安农95083-6-1、天禾0519、江白、Halberd、内白、Kanto107、Stardy、PH86-16、Gamenya、安农04144、徐州8913、华农139记载在“崔文礼，姚大年，张文明等.138个小麦品种(系)戊聚糖含量的研究[J].中国粮油学报,2010,25（2）:11-17”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种（系）安农95081-8、阜861-8记载在“王晓波，马传喜，何克勤等.小麦2D染色体上多酚氧化酶(PPO)基因STS标记的开发与应用[J].中国农业科学,2008,4(6):1583-1590”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种（系）石农88，固镇36-6-3-8记载在“郑文寅，王慧，崔文礼等.104个小麦品种(系)脂肪氧化酶活性的研究[J].中国农业科学，2011,44（9）：1798-1805”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种（系）扬06G86，07安徽03记载在“王慧，郑文寅，樊宏等.不同小麦品种籽粒中LOX活性及基因型和环境互作分析[J].中国粮油学报，2011,26（1）：11-14”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种（系）漯6112，豫展9804，阜98-46记载在“唐怀君，殷贵鸿，夏先春等.1BL·1RS特异性分子标记的筛选及其对不同来源小麦品种1RS易位染色体[J].作物学报，2009,35（11）：2107-2115”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
W1022，W1032是江苏白火麦和关东107的杂交后代，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
其余小麦品种为市面常售的商业化品种。
各小麦品种（系）于2010～2011年在安徽农业大学试验农场种植，所有品种(系)种在同一地块，田间管理按常规进行。
实施例1、小麦籽粒脂肪氧化酶活性相关分子标记的获得及其应用
一、小麦籽粒脂肪氧化酶活性性状的测定
以表1中148份小麦作为实验材料，参照Larisa Catod的分光光度计法，并加以适当改良后测定小麦籽粒中LOX活性。具体操作如下：
（1）底物配制：0.5ml吐温20溶解于10ml浓度为0.05mol/L的pH9.0的硼酸缓冲液（配方：取0.76g Na2BO4·10H2O，0.124g H3BO3，用双蒸水定容至200ml）中混匀，再逐滴加入0.5ml亚油酸，混匀成乳浊液后加入1.3ml浓度为1mol/L的NaOH水溶液至溶液澄清，然后加入90ml浓度为0.05mol/L的pH9.0的硼酸缓冲液，用HCl调节pH至7.0后定溶到200ml。
（2）酶提取液：称取0.5克待测小麦籽粒粉，加入2.5ml浓度为0.1mol/L的pH7.5的磷酸缓冲液（配方：取6g Na2HPO4·12H2O，0.52g NaH2PO4·2H2O，用双蒸水定容至200ml）在4℃条件下混匀30分钟后在8000r/min 4℃下离心10分钟，所得上清即为酶提取液。
（3）反应体系：9.5ml浓度为0.05mol/L的pH5.6醋酸钠缓冲液（配方：取3.73g无水醋酸钠，1.33ml醋酸，用双蒸水定容至1000ml），加入0.3ml步骤（1）配制的亚油酸底物，加入60μl步骤（2）制备的酶提取液，用UV-1100型分光光度计（上海美谱达公司生产）在234nm处用1cm光程的石英比色皿测定共轭过氧化物的吸光度，以空白的所述亚油酸底物作对照。每15秒记录一个数据，观察OD值的变化。
LOX活性计算公式：A=[OD(30S)-OD(15S)]/0.01
式中A为酶活性单位，
OD(30S)为反应30S的OD值，
OD(15S)为反应15S的OD值，
0.01为一个常数，即一分钟内3ml的反应体系在234nm吸光度下增加0.01作为一个酶活力单位。
（4）结果：148份小麦籽粒的LOX活性测定结果如表1所示。
表1小麦籽粒LOX活性的测定结果及LOX1-wp02扩增带型
| 编号 | 品种名称 | LOX活性(nkat/g) | LOX1-wp02扩增带型 |
| 1 | 鹤麦026 | 19.43 | abc |
| 2 | 内白 | 17.98 | abc |
| 3 | W1032 | 17.76 | abc |
| 4 | 郑麦9405 | 17.65 | abc |
| 5 | 鲁麦22 | 17.03 | abc |
| 6 | 江白 | 16.8 | ac |
| 7 | 安农糯1 | 16.33 | abc |
| 8 | ZWY-10 | 15.03 | abc |
| 9 | 周麦16 | 14.78 | abc |
| 10 | 皖协497 | 14.73 | abc |
| 11 | 烟农21 | 14.65 | abc |
| 12 | Halberd | 14.58 | abc |
| 13 | 温麦6号 | 14.38 | abc |
| 14 | 中优16 | 14.03 | abc |
| 15 | 百农矮抗56 | 13.93 | abc |
| 16 | 济麦21 | 13.9 | abc |
| 17 | 济宁12 | 13.59 | abc |
| 18 | 徐麦270 | 13.55 | abc |
| 19 | 鹤麦0521 | 13.52 | abc |
| 20 | 烟361 | 13.33 | abc |
| 21 | 烟2801 | 13.25 | abc |
| 22 | ZWY-8 | 13.17 | abc |
| 23 | 百农3217 | 13.15 | abc |
| 24 | 津强5号 | 13.13 | abc |
| 25 | 秦农142 | 13.07 | abc |
| 26 | 中优9507 | 13.05 | abc |
| 27 | 弘展9908 | 13.05 | abc |
| 28 | 矮抗58 | 13.03 | abc |
| 29 | 周98165 | 12.95 | abc |
| 30 | 丰抗2号 | 12.83 | abc |
| 31 | 鄂恩4号 | 12.75 | abc |
| 32 | 淮麦0566 | 12.72 | abc |
| 33 | ZWY-2 | 12.62 | abc |
| 34 | Gamenya | 12.58 | abc |
| 35 | 皖麦47 | 12.57 | abc |
| 36 | 温麦8号 | 12.47 | ac |
| 37 | 豫麦50 | 12.45 | abc |
| 38 | 烟农5158 | 12.43 | abc |
| 39 | 许农5号 | 12.43 | abc |
| 40 | 邯郸6172 | 12.38 | abc |
| 41 | 罗麦8号 | 12.23 | abc |
| 42 | 津强2号 | 12.23 | abc |
| 43 | ZWY-9 | 12.16 | abc |
| 44 | 花培212 | 12.07 | abc |
| 45 | 阳光58 | 12.03 | abc |
| 46 | 陕354 | 12.03 | abc |
| 47 | 偃展4110 | 12.02 | abc |
| 48 | 安徽3号 | 11.95 | abc |
| 49 | 郑农21 | 11.87 | abc |
| 50 | 烟农19 | 11.79 | abc |
| 51 | 安农8729-10 | 11.76 | abc |
| 52 | 豫展1号 | 11.75 | abc |
| 53 | PH86-16 | 11.67 | abc |
| 54 | 皖麦38 | 11.65 | abc |
| 55 | 豫麦34 | 11.64 | abc |
| 56 | 周麦18 | 11.63 | abc |
| 57 | 津强6号 | 11.5 | abc |
| 58 | 扬麦15 | 11.48 | abc |
| 59 | 阜861-8 | 11.48 | abc |
| 60 | 周麦22 | 11.47 | abc |
| 61 | 扬麦16 | 11.45 | abc |
| 62 | 偃展1号 | 11.45 | abc |
| 63 | 05中37 | 11.43 | abc |
| 64 | 连麦2号 | 11.39 | abc |
| 65 | 鄂恩1号 | 11.38 | abc |
| 66 | 安农95083-6-1 | 11.35 | abc |
| 67 | 皖麦48 | 11.28 | abc |
| 68 | 皖麦44 | 11.25 | abc |
| 69 | 周麦13 | 11.23 | abc |
| 70 | ZWY-6 | 11.19 | abc |
| 71 | 矮早781-64 | 11.18 | abc |
| 72 | 洲元9369 | 11.1 | abc |
| 73 | 安农9267 | 11.08 | abc |
| 74 | 漯6112 | 11.03 | abc |
| 75 | 漯9908 | 10.97 | abc |
| 76 | 烟农23 | 10.95 | abc |
| 77 | 皖麦41 | 10.93 | abc |
| 78 | 烟农475 | 10.92 | abc |
| 79 | 扬麦13 | 10.91 | abc |
| 80 | 周8425B | 10.9 | abc |
| 81 | 豫展9804 | 10.83 | abc |
| 82 | 阜98-46 | 10.81 | ac |
| 83 | 罗麦10 | 10.77 | abc |
| 84 | 天禾0519 | 10.75 | abc |
| 85 | 皖麦46 | 10.73 | abc |
| 86 | 郑麦9023 | 10.67 | abc |
| 87 | 阜麦936 | 10.58 | ac |
| 88 | 豫麦2号 | 10.53 | abc |
| 89 | 鄂麦19 | 10.48 | abc |
| 90 | 周9926 | 10.45 | abc |
| 91 | 周麦17 | 10.42 | abc |
| 92 | 淮阴9628 | 10.38 | abc |
| 93 | 阜麦9261 | 10.35 | abc |
| 94 | 安农9192 | 10.32 | abc |
| 95 | 周优102 | 10.31 | abc |
| 96 | 豫展10号 | 10.28 | abc |
| 97 | 安农8559 | 10.25 | abc |
| 98 | 淮麦20 | 10.23 | abc |
| 99 | 浏虎98 | 10.17 | abc |
| 100 | 宁麦11 | 10.17 | abc |
| 101 | 许科1号 | 10.07 | abc |
| 102 | 邯4564 | 10.03 | abc |
| 103 | 中国春 | 10.03 | abc |
| 104 | ZWY-5 | 10.03 | abc |
| 105 | 富志1号-1 | 10.02 | ac |
| 106 | 周9823 | 9.97 | abc |
| 107 | 华农139 | 9.65 | abc |
| 108 | 淮麦22 | 9.57 | abc |
| 109 | 徐州29 | 9.55 | abc |
| 110 | 徐州8913 | 9.54 | abc |
| 111 | 宛抗18 | 9.52 | ac |
| 112 | 皖麦19 | 9.33 | abc |
| 113 | 皖东麦1号-1 | 9.27 | ac |
| 114 | 苏麦3号 | 9.25 | abc |
| 115 | 百农金优32 | 9.23 | abc |
| 116 | 皖麦54 | 9.18 | abc |
| 117 | 安农04144 | 9.15 | abc |
| 118 | 川育8号 | 9.13 | abc |
| 119 | 京九麦10号 | 9.11 | abc |
| 120 | 皖9210 | 9.05 | abc |
| 121 | 固镇36-6-3-8 | 9.03 | abc |
| 122 | 太空35 | 7.03 | ac |
| 123 | 安农92484W | 6.93 | ac |
| 124 | 皖西8906 | 6.92 | ac |
| 125 | W1022 | 6.77 | ac |
| 126 | Stardy | 6.75 | ac |
| 127 | 周麦19 | 6.73 | abc |
| 128 | Kanto107 | 6.68 | ac |
| 129 | 安农9403 | 6.62 | ac |
| 130 | ZWY-7 | 6.54 | ac |
| 131 | 扬06G86 | 6.43 | ac |
| 132 | 07安徽03 | 6.43 | ac |
| 133 | 小冰33 | 6.38 | ac |
| 134 | 安农90202 | 6.35 | ac |
| 135 | 石农88 | 6.28 | ac |
| 136 | 周98100 | 6.17 | ac |
| 137 | 安农0305 | 6.17 | abc |
| 138 | 扬麦93111 | 5.95 | ac |
| 139 | 皖0202 | 5.93 | ac |
| 140 | 安农95081-8 | 5.84 | ac |
| 141 | 皖0606 | 5.8 | ac |
| 142 | 扬辐麦5242 | 5.77 | ac |
| 143 | 陕228 | 5.48 | ac |
| 144 | P206 | 5.23 | ac |
| 145 | 内乡188 | 5.15 | ac |
| 146 | 淮麦19 | 5.13 | ac |
| 147 | 蒿优9409 | 4.95 | ac |
| 148 | 周麦11 | 4.56 | ac |
统计表1中148份小麦品种籽粒脂肪氧化酶活性的测定结果，其中，编号1-121共121份小麦品种的LOX活性均高于9.0nkat/g，编号122-148共27份小麦品种的LOX活性均低于7.1nkat/g。故而，在本发明中，将籽粒LOX活性高于9.0nkat/g的小麦品种视为脂肪氧化酶活性高的小麦，将籽粒LOX活性低于7.1nkat/g的小麦品种视为脂肪氧化酶活性低的小麦。
二、小麦籽粒脂肪氧化酶活性相关分子标记的获得
从148份经实施例1测定脂肪氧化酶活性的小麦品种（表1）中选择6个高LOX活性小麦品种（鹤麦026、皖协491、周麦16、鲁麦22、济麦21和郑麦9405）和6个低LOX活性小麦品种（内乡188、周麦11、蒿优9409、淮麦19、扬辐麦5242和安农9403）作为实验材料，用于对分子标记引物的筛选。结果表明由序列表中序列1和序列2组成的引物（记作LOX1-wp02）在小麦籽粒LOX活性处于两极端的上述12份材料中表现出较强的多态性。具体如下：
1、小麦基因组DNA的提取
取2粒外观较为一致、饱满的小麦种子，用单籽粒磨粉机磨碎后放入2.0m1离心管中,加入1ml的SDS提取缓冲液（288mmo1/L的NaC1，200mmo1/L的Tris-HC1，25mmo1/L的EDTA，0.5g/100ml的SDS），用0.5m1酚+氯仿+异戊醇（体积比为25:24:1）抽提除去蛋白质，经异丙醇沉淀，75％（v/v）乙醇漂洗后，晾干，加适量TE缓冲液溶解，置于-20℃保存备用。
2、PCR扩增
反应体系（25μl）：含有10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/L的MgC12 2.5μl，10mmol/L的dNTP 0.5μl，10μmol/L的LOX1-wp02正向引物1μl，10μmol/L的LOX1-wp02反向引物1μl，0.5μg/μl的DNA模板0.5μl，Taq酶0.1μl（5U/μl）。其中，DNA模板为步骤1提取的小麦基因组DNA。
LOX1-wp02正向引物：5'-CTCCGACTTCCTGGGCTACTC-3'（序列1）；
LOX1-wp02反向引物：5'-CCAAACTTGCTAGGGTCCAGACT-3'（序列2）。
反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸45s，共循环30次；最后72℃延伸10min。
反应结束后，PCR扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，缓冲体系为1×TAE溶液，100V电压电泳1h，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统扫描并保存。
结果显示，籽粒LOX活性低的6个小麦品种均扩增出2条带a、c，籽粒LOX活性高的6个小麦品种均扩增出3条带a、b、c（图1）。结合实施例1的实验结果，可见条带b的有无与LOX活性大小有关。
3、目标条带的测序与分析
引物LOX1-wp02在LOX活性高低不同的材料中扩增出不同的条带，切取电泳条带a、b、c回收、测序。其中，条带a的序列如序列表中序列3所示，条带b的序列如序列表中序列4所示，条带c的序列如序列表中序列5所示。进一步对序列分析发现，在所扩增的基因序列中存在1个内含子，且符合内含子的GT-AG法则，3条序列的差异区段都分布在这个内含子之间（图2)。因此，本发明的发明人认为在普通六倍体小麦中LOX1基因存在3个位点，分别指定序列3（对应条带a）为LOX1.2位点，序列4（对应条带b）为LOX1.1位点，序列5（对应条带c）为LOX1.3位点。序列3、4、5所示的三个DNA分子即为本发明中所述的小麦籽粒脂肪氧化酶活性相关分子标记。
4、引物LOX1-wp02检测小麦脂肪氧化酶活性的方法总结
综合上述步骤2和3结果，得出用引物LOX1-wp02检测小麦脂肪氧化酶活性的方法，具体如下：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，以引物LOX1-wp02进行PCR扩增，获得PCR产物；
（2）检测步骤（1）所得PCR产物的大小，按照如下（a）或（b）的方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性：
（a）若所述PCR产物中含有大小为677bp的DNA片段（对应序列4，条带b），则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中不含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
（b）若所述PCR产物为大小分别是475bp（对应序列5，条带c）、677bp（对应序列4，条带b）和786bp（对应序列3，条带a）的三个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中为大小分别是475bp和677bp的两个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
三、引物LOX1-wp02用于检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的有效性验证
用引物LOX1-wp02对表1中共148份小麦品种(系)进行了PCR分析，操作方法同步骤二。根据PCR扩增产物的电泳结果，参照步骤二4中的结果判断标准对结果进行判断。
结果如表1所示，从结果中可以看出，在148份种质材料中，引物LOX1-wp02扩增出3条带（a、b、c）的材料有117个，其中115个小麦品种(系)的LOX活性高于9.0nkat/g，即引物LOX1-wp02扩增出3条带（a、b、c）的小麦品种(系)中有98.29%为脂肪氧化酶活性高的小麦品种(系)；剩下的31个材料全部扩增出了2条带（a、c），其中25个小麦品种(系)的LOX活性低于7.1nkat/g，即引物LOX1-wp02扩增出2条带（a、c）的小麦品种(系)中有80.06%为脂肪氧化酶活性低的小麦品种(系)。
Claims (8)
1.检测小麦脂肪氧化酶活性的引物对，为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对；
所述小麦为普通六倍体小麦。
2.权利要求1所述的引物对在检测小麦脂肪氧化酶活性中的应用；
所述小麦为普通六倍体小麦。
3.一种检测小麦脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，以权利要求1所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
（2）检测步骤（1）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性：若所述PCR产物中含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中不含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦；
所述小麦为普通六倍体小麦。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测步骤（1）所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示677bp之间的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上不显示677bp之间的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
5.一种检测小麦脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤：
（1）以待测小麦的基因组DNA为模板，以权利要求1所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
（2）检测步骤（1）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性：若所述PCR产物为大小分别是475bp、677bp和786bp的三个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中为大小分别是475bp和786bp的两个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦；
所述小麦为普通六倍体小麦。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测步骤（1）所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示大小为475bp、677bp和786bp的三个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示大小为475bp和786bp的两个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
7.权利要求1所述的引物对在如下（a）-（c）中的应用：
（a）筛选脂肪氧化酶活性高的小麦品种；
（b）筛选脂肪氧化酶活性低的小麦品种；
（c）筛选耐储藏小麦品种；
所述小麦品种为普通六倍体小麦品种。
8.权利要求3-6中任一所述的方法在如下（a）-（c）中的应用：
（a）筛选脂肪氧化酶活性高的小麦品种；
（b）筛选脂肪氧化酶活性低的小麦品种；
（c）筛选耐储藏小麦品种；
所述小麦品种为普通六倍体小麦品种。
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| CN102925576A (zh) | 2013-02-13 |
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