CN102921358B - 一种可调控释放速率的杀菌微胶囊悬浮剂及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杀菌微胶囊及其悬浮剂的制备和使用方法。该微胶囊的芯材活性成分为那他霉素，以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，采用层层组装（LBL）的方法制备。该微胶囊可根据防治植物真菌病害速效性和持效性的要求调节释放速率，具有杀菌谱广、用量低、杀菌效果好、不易获得抗性等特点。

Description

一种可调控释放速率的杀菌微胶囊悬浮剂及其制备和使用方法

技术领域

本发明属于生物农药加工与应用技术领域，具体涉及一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊及其悬浮剂以及它们的制备和使用方法。 

背景技术

那他霉素（Natamycin，NA）是纳他链霉菌（Streptomycesnatalensis）、利迪链霉菌A01(Sotrytis lydicus)（中国专利：200710187435.1）等链霉菌的次生代谢产物，属于抗生素类抗真菌剂。NA具有广谱、高效、安全、不易获得抗性等优点，目前已在饮料、饲料、食品及医药领域广泛应用，但在农业生产上仅限于防治棉花和豆类的种菌病害。这是由于NA的分子结构属于多烯大环内酯，其在水溶液中易受紫外线影响而光解，从而限制了它在防治植物地上部病害的应用（卢向阳等.6种光稳定剂对那他霉素抗光解的影响.农药,2011,50(8):570-572）。 

目前，国内外克服药物光解的主要方法有分子结构改造、添加光稳定剂和微胶囊化，但前者耗资耗时巨大，而添加光稳定剂的方法也不够理想。微胶囊（MC）技术是一种用成膜材料将活性物质作为囊芯包覆起来形成微小粒子的技术，在医药、涂料、食品、纺织、日化、农业等行业中已被广泛应用（宋健等，微胶囊化技术及应用.化学工业出版社,2001,234-379）。MC具有抑制因环境因素(如光、热、空气、雨水、土壤、微生物)造成囊芯活性成分的分解和流失，提高药剂本身稳定性的功能（高德霖，微胶囊技术在农药剂型中的应用，现代化工,2000,20(2):10-14）。鉴于以上情况，以微胶囊化来解决NA的光解问题具有较大潜力。郑雅婧等证实复凝聚法制备的那他霉素MC具有良好的抗光解作用（郑雅婧等.那他霉素微胶囊的制备及性能测试.农药2012,51(4):267-269），但是复凝聚法所制备的MC释放速率快慢难以调控，不能针对植物病害速效性或持效性的要求加以调节，从而造成 病害不能及时控制或控制时间较短的问题。为此研制一种可调控释放速率MC的制备方法十分必要，而采用层层组装（LBL）微胶囊的方法正是解决这一问题的良好途径。Caruso等最早利用LBL实现了小分子量物质的包囊（CARUSO F,YANG W,TRAU D.Microencapsulation ofUncharged Low Molecular Weight Organic Materials by PolyelectrolyteMultilayer Self-assembly[J].Langmui,2000,16:8932-8936）。经典的LBL技术是以静电作用为驱动力的。LBL可以通过控制囊壁的层数等手段来调控农药的释放行为。目前，LBL已被应用于一些农药（如阿维菌素、吡虫啉等）的微胶囊化研究，但尚缺乏LBL组装体系繁杂影响因素的系统研究，组装体系最佳条件的确定比较困难。另外，LBL技术应用于诸如那他霉素这类具有两性分子特性的生物农药未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊及其悬浮剂以及它们的制备和使用方法，以天然阴离子电解质海藻酸钠和天然阳离子电解质壳聚糖为壁材，通过LBL技术将芯材那他霉素包覆起来。由于在制备过程中可以通过组装层数来调控MC的释放速率，因此较其它MC制备方法具有理想的释放速率，能满足药剂所需的速效性和持效性，获得更好的防病效果。同时也能较好地克服那他霉素的光下易分解的问题，达到可用于防治植物表面真菌病害的作用。 

本发明提供了NA微胶囊的制备方法。为了利用LBL技术实现多层微胶囊的高质量组装及连续组装，本发明采用正交试验对MC的最内层（第一层）、第二层（或偶数层）和第三层（或奇数层）的反应体系条件进行了探索，获得了制备NA微胶囊的优化工艺条件。采用本发明制备的NA微胶囊具有较高的载药量，4层MC载药量可达76.46%(质量比)，8层MC载药量可达73.54%(质量比)；以纯水为释放介质，释放72h后NA原粉、4层MC、8层MC的累积释放率分别为5.96%、4.10%和1.95%（质量百分比），与NA原粉相比，4层MC和8层MC的累积释放率分别降低0.45倍和2.06倍，具良好的缓释性能。与同浓度的NA浓缩液相比，4层MC和8层MC加药48h对灰霉病菌的相对活性分别为94.1%和92.9%(以浓缩液活性100%计)，说明4层MC和8层MC具有良好的通透性和速效性；在紫外光下，4层MC 和8层MC相对活性下降50%的时间分别为83.57和84.09min，较NA浓缩液分别提高了3.19和3.21倍，说明它们具有良好的抗光解性能。 

一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊的制备方法，微胶囊的组装层数可以根据防治对象或使用方法各不相同，可以从1层到数十层，甚至更多层；组装步骤如下： 

1）将那他霉素分散于去离子水中制得悬浮液，将悬浮液超声波细化处理5-10min，获得20-40g/L的那他霉素均匀水悬浮液A； 

2）组装第一层：在搅拌下向步骤1）获得的悬浮液A中加入海藻酸钠溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，海藻酸钠含量为0.75-1.75g/L，Tween-80的含量为7.5-12.5g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3.5-5.5，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A1； 

3）组装第二层：用3g/L乙酸配制出浓度为1.5-3.5g/L的壳聚糖溶液，在搅拌下向步骤2）获得的悬浮液A1中加入上述壳聚糖溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，壳聚糖含量为0.75-1.75g/L，Tween-80的含量为2-3g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至2.0-4.0，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A2； 

4）组装第三层：在搅拌下向步骤3）获得的悬浮液A2中加入海藻酸钠溶液、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，海藻酸钠含量为1.25-3g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3.5-5.5，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A3； 

重复上述步骤，逐层吸附海藻酸钠和壳聚糖，直至分别得到所需包裹层数的那他霉素微胶囊，继续组装时，偶数层按照步骤3）的条件操作，奇数层按照步骤4）的条件操作，从第二层开始均使用上一步骤 获得的那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液来提供那他霉素，从而进行交替组装和包覆，直至组装到需要的层数，组装完成后保存最终的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液备用。 

本发明还提供了那他霉素微胶囊悬浮剂（NACS）的制备和使用方法。药效试验表明，不同组装层数的微胶囊持效期不同，与不施药的对照组相比，采用8层NA微胶囊剂和4层NA微胶囊剂各100mg/L防治番茄灰霉病，用药后21天的防效分别为68.14%和53.80%，两种NACS的防治效果均优于未经包囊的NA浓缩液（防效为11.17%）和复凝聚法制备的微胶囊剂（防效为46.65%）。抑菌试验表明，NA具有广谱杀菌性，可以有效地防治植物的20余种真菌病害。 

所述的那他霉素微胶囊悬浮剂的制备方法为，微胶囊组装完成后，取微胶囊均匀水悬浮液，添加农药助剂后搅拌均匀即得到那他霉素微胶囊悬浮剂，悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的成分：那他霉素0.5%～5.4%；微胶囊壁材海藻酸钠0.1%～3.0%；微胶囊壁材壳聚糖0.1%～3.0%；抗沉剂0.5%～10%；表面活性剂0.5%～10%；余量为水。 

所述抗沉剂（又称增稠剂或悬浮稳定剂）选自聚丙烯酸钠、膨润土、硅酸镁铝中的一种或多种。 

所述表面活性剂选自OP-10、TX-10、Tween-20和Tween-80的一种或多种。 

微胶囊悬浮剂的组分还包括如下组分中的一种或多种，分散剂、防冻剂、消泡剂和pH调节剂，其使用剂量为本领域常规剂量。其中，分散剂选自木质素磺酸钠、NNO、MF等；防冻剂选自乙二醇、丙二醇、甘油、尿素等；消泡剂选自消泡剂GPE（敌泡）、聚醚类消泡剂7010等、有机硅酮类、C8～10的脂肪醇、C10～20饱和脂肪酸及其酯类、酯-醚型化合物等；pH调节剂选自醋酸、盐酸、氢氧化钠等。 

所述NACS优选包含下列质量百分比的组分：那他霉素1%～5%；海藻酸钠0.2%～2%；壳聚糖0.2%～2%；抗沉剂1%～8%；表面活性剂1%～5%；余量为水。 

所述NACS的防治对象为真菌病害，所述病害为番茄灰霉病（Botrytis cinerea）、辣椒灰霉病（Botrytis cinerea）、茄子灰霉病（Botrytis cinerea)、葡萄灰霉病（Botrytis cinerea）、玉米大斑病（Exserohilumturcicum）、瓜果腐霉病（Pythium aphanidermatum）、茄子早疫病（Alternaria solani）、小麦纹枯病（Rhizoctonia cerealis）、小麦赤霉病（Fusarium graminearum）、稻瘟病（Pyricularia oryzae）、豌豆根腐病（Fusarium solani f.sp.pisi）、番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）、西瓜枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）、黄瓜枯萎病（Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum）、百合根腐病（Rhizoctonia solani）、李子褐腐病（Monilinia fructicola）、桃褐腐病（Monilinia fructicola）、桃枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.persica）、芹菜斑枯病（Septoriaapii）、辣椒炭疽病（Colletotrichum capsici）、甘蓝枯萎病（Fusariumoxysporum Schl.f.sp.conglutinans）、苹果轮斑病（Alternaria mali）、棉花黄萎病（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病（Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum）等，但不局限于上述真菌病害。 

本发明所述那他霉素微胶囊悬浮剂的使用方法，具体操作步骤如下：在植物发病之前或发病初期，按NA的使用浓度25～250mg/L，将微胶囊悬浮剂兑水配制成稀释液，采用喷雾法将其喷洒于植物表面。 

上述的植物表面是指植物的叶、茎和果实的表面等地上部组织。 

本发明具有以下优点： 

（1）采用LBL法制备的NA微胶囊，组装层数任意可调，可以制备出任何释放速率快慢的微胶囊。 

（2）制备反应条件温和，不会造成活性成分NA因高温而分解失效； 

（3）具有良好的抗光解作用，与未经包囊的NA浓缩液相比，组装4层的MC和组装8层的MC分别可提高抗光解能力3.19倍和3.21倍，因此在紫外光照下可显著提高防病效果； 

（4）微胶囊内的活性成分具有良好的缓释作用，较常规制剂具有较长的持效性； 

（5）微胶囊囊壁具有良好的通透性，较合成高分子化合物作囊壁的微胶囊具有更好的抑菌速效性； 

（6）制备出的微胶囊产品粒径较复凝聚法小，90%颗粒粒径在1～20微米，有利于制备出良好物理性能的农药制剂，并适宜于农药的喷雾要求。 

（7）为作物生产，尤其是蔬菜生产，提供了安全的生物农药品种，保障了人民的身体健康。 

附图说明

图1为那他霉素层层组装电势反转示意图 

图2为NA浓度与吸光值的标准曲线 

图3不同组装层数那他霉素微胶囊在水中的释放曲线 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。 

以下是实施例中涉及的菌种、原料、试剂、药剂和设备： 

1、供试菌株 

植物病原真菌：棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）、辣椒灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子灰霉病菌（Botrytiscinerea)、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、玉米大斑病菌（Exserohilumturcicum）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、茄子早疫病菌（Alternaria solani）、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、豌豆根腐病菌（Fusarium solani f.sp.pisi）、番茄叶霉病菌（Cladosporiumfulvum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、百合根腐病菌（Rhizoctonia solani）、李子褐腐病菌（Monilinia fructicola）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、桃枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.persica）、芹菜斑枯病菌（Septoria apii）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichumcapsici）、甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans）、苹果轮斑病菌（Alternaria mali）。 

酵母菌：啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。 

以上植物病原真菌是由中国农业大学植物病理学系和北京市农林科学院植环所提供，啤酒酵母菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）。 

2、供试培养基 

PDA培养基：马铃薯200g，洗净切成1cm3小块煮沸约30min后用四层纱布过滤，滤液用蒸馏水补足至1000ml，加葡萄糖20g，琼脂15g，121°C灭菌30min。 

3、供试药剂和试剂 

药剂：91.7%那他霉素标准品（USP）；1.408g/L NA浓缩液（利迪链霉菌次生代谢产物，制备方法参照中国专利：200710187435.1）；纯度为95.8%（质量比）那他霉素原药（原粉）（北京东方瑞德生物技术有限公司），1.4%NA微胶囊悬浮剂（复凝聚法制备方法见中国专利：201110388140.7，简称NACS-复）。 

试剂：海藻酸钠（CP，温州助剂厂）；壳聚糖（CP）、甲醇（AR）（国药集团化学试剂有限公司）；99.8%NaCl。 

4、农药助剂：抗沉剂羧甲基纤维素（CMC）、聚丙烯酸钠（分子量3×107）、硅酸镁铝；表面活性剂：Tween-20、Tween-80、OP-10、TX-10；分散剂：木质素磺酸钠、萘磺酸甲醛缩合物（如NNO、MF等）；抗冻剂：乙二醇、丙二醇、甘油、尿素；消泡剂：敌泡、7010。 

5、仪器和设备 

DU800可见-紫外分光光度计（美国BECKMAN）、JY92-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司）、800型台式离心机（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、生物显微镜（日本OLYMPUS）、STARTER-3C pH计（上海奥豪斯仪器有限公司）、超净工作台（带20W紫外灯）、1.5升喷雾器；TES-1339型照度计（泰仕电子工业股份有限公司）、透析袋MD55-14（截留分子量14000）；THZ-300型恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；JS94H型微电泳仪（Zeta电位仪）（上海中晨数字技术设备有限公司）。 

6、供试植物品种：番茄佳粉十八（北京市农林科学院蔬菜所提供）。 

试验例1：那他霉素的抑菌谱测定 

采用抑菌圈法。供试植物病原真菌在PDA斜面上28°C恒温培养7天后，刮取其分生孢子和菌丝体置盛有无菌玻璃珠（直径2.5mm）和无菌水的三角瓶中用力充分振荡，配成106CFU/mL的菌悬液；取200μL菌悬液均匀涂布在PDA平板（直径9cm）上，用直径0.7cm的无 菌不锈钢打孔器等距离打制三个孔，然后向每孔内注入100mg/L NA浓缩液100μL，25°C恒温培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的直径；供试啤酒酵母菌测定方法按实施例3进行。每个处理3次重复。 

从表1中可以看出，除了对啤酒酵母菌的抑菌圈直径在3.00cm以下外，对其他病原真菌的抑菌圈直径均达到了3.00cm以上，最强的抑菌效果是对小麦纹枯病菌（R.cerealis）和李子褐腐病菌（M.fructicola），直径达4.77cm。由此说明NA具有抑制真菌的广谱性。 

表1那他霉素抑菌测定结果 

实施例1：LBL组装NA微胶囊及性能测试 

（1）LBL组装NA微胶囊 

1）将那他霉素分散于去离子水中制得悬浮液，将悬浮液超声波细化处理5-10min，获得30g/L的那他霉素均匀水悬浮液A； 

2）组装第一层：在搅拌下向步骤1）获得的悬浮液A中加入海藻酸钠溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为15g/L，海藻酸钠含量为1g/L，Tween-80的含量为10g/L，氯化钠含量为14.6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至4.5，反应15-20min后，离心和用水洗涤3次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为30g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A1； 

3）组装第二层：用3g/L乙酸配制出浓度为2g/L的壳聚糖溶液，在搅拌下向步骤2）获得的悬浮液A1中加入上述壳聚糖溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为15g/L，壳聚糖含量为1g/L，Tween-80的含量为2.5g/L，氯化钠含量为14.6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3.0，反应15-20min后，离心和用水洗涤3次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为30g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A2； 

4）组装第三层：在搅拌下向步骤3）获得的悬浮液A2中加入海藻酸钠溶液、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为15g/L，海藻酸钠含量为2g/L，氯化钠含量为14.6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至4.5，反应15-20min后，离心和用水洗涤3次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为30g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A3； 

重复上述步骤，逐层吸附海藻酸钠和壳聚糖，直至分别得到4层和8层包裹的那他霉素微胶囊，继续组装时，偶数层按照步骤3）的条件操作，奇数层按照步骤4）的条件操作，从第二层开始均使用上一步骤获得的那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液来提供那他霉素，从而进行交替组装和包覆，直至组装到需要的层数，组装完成后保存最终的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液备用。 

（2）NA微胶囊组装工艺条件的筛选和优化 

为了明确反应体系pH、外加盐浓度、壁材浓度和分散剂或表面活性剂浓度等因素对组装NA各层的影响，筛选出反应体系各因素的最佳值，依照实施例1中的基本工艺，采用L9（34）正交试验进行试验。因为只有三种不同内层的情况：NA颗粒表面、海藻酸钠吸附层和壳聚糖吸附层，因此只需要做三个正交试验即可确定各层的组装工艺条件，试验设4个因素，分别为：A=pH，B=NaCl浓度，C=海藻酸钠浓度（ALG）或壳聚糖浓度（CHI），D=Tween-80浓度。每个因素设三个水平（见表2-4），各个水平以最终体系中的实际浓度为准。 

结果表明，表2-4中组装后测得的电势均非最大值，甚至有的组装后电势根本就没有反转。组装1-3层反应体系的最佳条件见表5。根据第一层最佳反应体系条件组装后那他霉素颗粒的电势为-36.31。组装第二层后，那他霉素颗粒的电势为+31.66。组装第三层后，测得颗粒的电势为-28.9。这3个电势值分别大于表2-4中最右边的9个电势值，说明所确定的反应体系最佳条件可靠无误。 

本研究按上述方法分别对NA进行了4层和8层组装，并对组装前后NA颗粒的电势进行了测定。在组装前那他霉素颗粒的电势为+35.84；组装包被1-8层后的电势分别为-36.31、31.66、-28.90、27.65、-26.43、28.18、-28.45和27.48。每一层组装均引起电势的大幅度反转（见图1所示），这不仅充分说明组装囊壁已获成功，而且反转的电势越高越有利于下一层壁材的组装。 

从显微镜下观察，利用本技术制备出的微胶囊的外观保持原有NA颗粒的形状，为无规则晶体形，囊内含芯材为那他霉素微晶1个，90%的那他霉素微胶囊的粒径范围在1～20μm。 

表2那他霉素LBL法第一层组装L₉（3⁴）正交试验和电势测得值 

注：K_i，j（i=1，2，3；j=A，B，C，D）为因素j在水平i下所得微胶囊包封率的累计值；R_j(j=A；B；C；D）为因素j的包埋率的极差，R_j＝K_j(max)-K_j(min)。 

表3那他霉素LBL法第二层（偶数层）组装L₉（3⁴）正交试验和电势测得值 

表4那他霉素LBL法第三层（奇数层）组装L₉（3⁴）正交试验和电势测得值 

表5组装第一层、奇数层和偶数层反应体系最佳条件 

（3）LBL法组装NA微胶囊包囊效果测定 

NA标准曲线制定：以甲醇为溶剂，用那他霉素标准品配制出1、2、4、6、8mg/L NA标准溶液，以甲醇溶液作空白对照。用紫外分光光度计测定溶液的吸光度（测定波长303nm）。以NA浓度为横座标，吸光值（Abs）为纵坐标，绘制出标准曲线，并得出浓度（x）与吸光值（y）的直线回归方程。 

样品的洗涤与干燥：取实施例1制备的微胶囊悬浮液10g于离心管内，4000r/min离心10min，弃去上清液后，再洗涤和离心3次，每次用去离子水6mL。最后留沉淀于离心管内，置于真空干燥箱内，40℃干燥24h。 

样品溶液制备：称取烘干样品0.0050g（精确至±0.0001），并将样品转移到25mL的三角瓶中，称取0.20g硅酸镁铝加入瓶中，再加入20mL甲醇，轻摇混匀后放入超声波细胞粉碎机中破囊，破碎后倒入离心管中，4000r/min离心10min，取上清液于25ml容量瓶定容，经进一步稀释后，用紫外分光光度计（波长303nm）测定吸光度，根据吸光度计算出NA浓度以及微胶囊的载药量。载药量根据以下公式计算： 

结果表明，NA浓度与吸光值具有良好的线性关系，相关系数为r=0.9995（见图2）；组装4层、8层NA微胶囊的载药量分别为76.46%和73.54%，这说明LBL法载药量较高，随着组装层数的增加，载药量略有下降。 

（4）LBL法组装NA微胶囊释放速率的测定 

设组装4层微胶囊（MC-4）、组装8层微胶囊（MC-8）及未包囊的NA原粉3种处理。称取经洗涤和干燥的微胶囊干粉和NA原粉各0.1g（精确至±0.0001），置于长度为10cm的透析袋中，两端用细绳扎紧，再将透析袋置于三角瓶内，加去离子水200mL，使透析袋完全没入水中，并加盖防止水份蒸发。每个处理重复3次。将三角瓶置于温度25℃，转速150r/min的摇床，定时取2mL释放液，同时补充2mL同温度下的相同释放介质。取出的样品用可见-紫外分光光度计测其吸光值，按下式计算累积释放率，并绘制累积释放率-时间的释放曲线。 

式中：Cn为各时间点取出样品的质量浓度，M为微胶囊含有NA的总质量。 

试验结果表明，组装层数越多，释放越慢。释放快慢的次序为NA原粉>4层>8层（见图3）。以释放72h为例，NA原粉、MC-4和MC-8 的累积释放率分别为5.96%、4.10%和1.95%。与NA原粉相比，MC-4和MC-8的累积释放率分别降低0.45和2.06倍。 

（5）药剂的抗光解性能测试 

分别称取MC-4、MC-8及那他霉素浓缩液（对照），用去离子水配制至成NA有效浓度为100mg/L的稀释液，取稀释液8mL于直径9cm的培养皿中，敞口放置在超净工作台上，垂直距离紫外灯（20w）32cm进行光照处理。照射时间分别设定为0、5、10、15、20、30、40、50、65、80、95、110、130min。光照后药液的相对活性采用抑菌圈法，方法是将供试啤酒酵母菌在PDA上培养2天后，用无菌生理盐水配成104CFU/ml浓度的菌悬液，取5ml菌悬液与100ml冷却至45℃左右的PDA培养基混匀后倒制平板，每个培养皿（直径9cm）倒入30ml混合液，待凝固后，用直径0.7cm无菌不锈钢打孔器等距离打制4个孔，向每孔内注入处理后的NA微胶囊悬浮剂稀释液100μL待测药液，28℃恒温培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的直径。每个处理3次重复。各处理药液的相对活性根据以下公式计算： 

微胶囊的速效性在加药48h后测定，以无光照条件的同浓度NA浓缩液的相对活性为基准来比较。 

由表6可见，NA浓缩液在紫外光照65min后完全丧失抑菌活性；而NA微胶囊的抗光解性能则有显著提高，在光照110min后MC-4和MC-8的相对活性分别为42.5%和44.0，直至光照130min后抑菌活性才完全丧失。 

将紫外时间转换成对数，相对活性换成机率值作线性回归（见表7），并以相对活性下降50%时的光照时间T50为评价指标，可以直观地看出NA微胶囊较其浓缩液和悬乳剂抗光解性能显著增加。经计算，NA浓缩液、MC-4和MC-8的T50分别为19.93、83.57和84.09min，MC-4和MC-8较未包囊的NA浓缩液的T50分别提高3.19倍和3.21倍，MC-4和MC-8抗光解的性能十分相当，也与复凝聚法制备的微胶 囊的抗光解的性能相近，但远远高于添加光稳定剂的效果（参见郑雅婧等，2012）。 

在未经紫外光照的条件下，加药48h后NA微胶囊与同浓度的NA浓缩液相比，MC-4和MC-8的相对活性均为94.1%，说明微胶囊具有良好的速效性，囊壁具有良好的通透性（见表6）。 

表6紫外光照测定结果 

表7线性回归分析结果 

*T₅₀为相对活性下降50%时紫外光照时间。 

实施例2微胶囊悬浮剂的制备 

将实施例1制备的微胶囊悬浮液经静置后弃去不同数量的上清液，分别得到NA含量为20g/L和60g/L的微胶囊悬浮液，然后按表8-9的组分和质量配比称取各组分配制微胶囊悬浮剂。方法为先称取抗沉剂，加适量水充分化开，调成浆糊状，再加入经称量的微胶囊悬浮液， 然后加入其它成分，在搅拌机转速800～1000rpm条件下充分搅拌均匀，即得那他霉素微胶囊悬浮剂（NACS）。分别制备组装4层和组装8层的微胶囊悬浮剂，代号分别为NACS-4和NACS-8。 

表8那他霉素微胶囊悬浮剂（NACS-4）的各组分质量配比（一） 

表9那他霉素微胶囊悬浮剂（NACS-8）的各组分质量配比（二） 

实施例3微胶囊药效试验 

试验方法：试验处理设NA浓缩液、NACS-4（4层微胶囊悬浮剂，见表8配方②）、NACS-8（8层微胶囊悬浮剂，见表8配方⑧）、NACS-复[复凝聚法制备的微胶囊悬浮剂（见中国专利：201110388140.7，表2配方②）和不施药对照，施药浓度均为100mg/L。在大棚内将番茄苗 育成8～10㎝高的壮苗，然后移入高15㎝，直径13㎝的塑料花盆内（每盆1株），培养至番茄初花期施药。每个处理20棵苗，各处理间随机排列。施药采用喷雾器，每株苗喷雾容量为33.3mL，随机区组排列。喷药后置于大棚内1.5h，使各处理药剂接受阳光照射，平均光照强度为18740LX。光照后再接种，接种采用喷雾器，将灰霉病菌悬浮液（孢子浓度为107～108CFU）喷于番茄苗上，每盆喷雾容量为20mL。接种后置20°C温室，用塑料薄膜遮盖保湿48h，保持湿度为85%～90%。药后7d和21天调查全部植株的发病情况，根据下列公式计算发病率和防效。 

发病率（%）=发病叶数/调查总叶数×100 

防效（％）=（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数×100 

表10药效试验结果 

注：2012年2月5日接种和施药，2月12日第一次考察，2月26日第二次考察。 

试验结果：从表10可见，未包囊的NA浓缩液处理无论是防治初期（药后7天），还是防治后期（药后21天）效果均较差，这是因为未包囊的NA浓缩液会受阳光照射影响，有效成分容易降解而失效。在防治初期，8层微胶囊的效果与NACS-复、4层微胶囊十分相近。但防治后期8层微胶囊的效果明显高于NACS-复、4层微胶囊，与不施药的对照相比，它们的防治效果依次为68.14%、46.65%和53.08%。以上结果说明，NACS-复和4层微胶囊释放速率较快，适用于所需持效期较短的病害防治，以本例来说，防治番茄灰霉病以包囊8层的微胶囊较好。通过不同释放速率微胶囊药效的试验，可以明确微胶囊的释放速率多少才适合，同时可以根据病害需要选择微胶囊包裹层数，有利于病害的有效防控，同时减少农作物的经济损失和节约农药生产成本。 

Claims (11)

1.一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊的制备方法，采用层层组装法制备，步骤如下：

1）将那他霉素分散于去离子水中制得悬浮液，将悬浮液超声波细化处理5-10min，获得20-40g/L的那他霉素均匀水悬浮液A；

2）组装第一层：在搅拌下向步骤1）获得的悬浮液A中加入海藻酸钠溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，海藻酸钠含量为0.75-1.75g/L，Tween-80的含量为7.5-12.5g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3.5-5.5，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A1；

3）组装第二层：用3g/L乙酸配制出浓度为1.5-3.5g/L的壳聚糖溶液，在搅拌下向步骤2）获得的悬浮液A1中加入上述壳聚糖溶液、Tween-80、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，壳聚糖含量为0.75-1.75g/L，Tween-80的含量为2-3g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至2.0-4.0，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A2；

4）组装第三层：在搅拌下向步骤3）获得的悬浮液A2中加入海藻酸钠溶液、氯化钠和去离子水，使得反应体系中那他霉素含量为10-20g/L，海藻酸钠含量为1.25-3g/L，氯化钠含量为10-18g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3.5-5.5，反应15-20min后，离心和用水洗涤2-4次，最后将沉淀重新悬浮于去离子水中，获得那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液A3；

重复上述步骤，逐层吸附海藻酸钠和壳聚糖，直至分别得到所需包裹层数的那他霉素微胶囊，继续组装时，偶数层按照步骤3）的条件操作，奇数层按照步骤4）的条件操作，从第二层开始均使用上一步骤获得的那他霉素含量为20-40g/L的那他霉素微胶囊均匀水悬浮液来提供那他霉素，从而进行交替组装和包覆，直至组装到需要的层数，即获得那他霉素微胶囊。

2.根据权利要求1所述的那他霉素微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤2）中海藻酸钠含量为1g/L，Tween-80的含量为10g/L，氯化钠含量为14.6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至4.5。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中壳聚糖含量为1g/L，Tween-80的含量为2.5g/L，氯化钠含量为14.6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至3.0。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中海藻酸钠含量为2g/L，氯化钠含量为14.6g/L，添加完毕后立即调节体系pH至4.5。

5.一种可调控释放速率的那他霉素微胶囊悬浮剂，其特征在于，其中的微胶囊由权利要求1-4任一项所述的方法制备；悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的成分：那他霉素0.5%～5.4%；海藻酸钠0.1%～3.0%；壳聚糖0.1%～3.0%；抗沉剂0.5%～10%；表面活性剂0.5%～10%；余量为水。

6.根据权利要求5所述的那他霉素微胶囊悬浮剂，悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的组分：那他霉素1%～5%；海藻酸钠0.2%～2%；壳聚糖0.2%～2%；抗沉剂1%～8%；表面活性剂1%～5%；余量为水。

7.根据权利要求5或6所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，所述微胶囊悬浮剂还含有如下组分中的一种或多种：分散剂、防冻剂、消泡剂和pH调节剂。

8.根据权利要求5或6所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，所述表面活性剂选自OP-10、TX-10、Tween-20和Tween-80中的一种或多种；所述抗沉剂选自聚丙烯酸钠、硅酸镁铝和膨润土中的一种或多种。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，所述微胶囊悬浮剂用于防治真菌病害。

10.根据权利要求9所述的微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，在植物发生真菌病害之前或发病初期，按活性成分那他霉素的使用浓度25～250mg/L，将微胶囊悬浮剂兑水配制成稀释液，采用喷雾法将其喷洒于植物表面。

11.根据权利要求10所述的微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，在植物发生真菌病害之前或发病初期，按活性成分那他霉素的使用浓度为100mg/L。

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