CN102920522B - 一种人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型的构建方法，包括如下步骤：移植前采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对受体小鼠(NOD/SCID)进行腹腔注射，同时给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的饮水，将人的干细胞移植后，继续给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸的饮水，即得该人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型。本发明成功建立了NOD/SCID小鼠移植的优化模型，通过本发明的方法，无论是在尾静脉还是髓腔移植时都有效的提高了人干细胞的植入率，移植过程中小鼠死亡率低，状态佳，可以长期存活。该方法简单，新颖，易实施，对小鼠的创伤小，且该方法使用的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸价格低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术方法，尤其是一种提高人的干细胞(HSCs)在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型的构建方法。
背景技术
NOD/SCID(Non-obesediabeticseverecombinedimmunodeficiency)即非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷鼠，是SCID(重症联合免疫缺陷)鼠与NOD(非肥胖性糖尿病)鼠反交产生的免疫缺陷鼠。是目前最为普遍使用的免疫缺陷鼠模型，该鼠既拥有SCID鼠的特征，缺乏功能性的T、B淋巴细胞，细胞和体液双重免疫缺陷，同时又拥有NOD鼠具备的多种固有免疫缺陷，包括NK细胞及补体活性低下，髓系细胞的发展和功能受限等特点，因此适宜人源细胞的移植。
NOD/SCID小鼠模型在人类血液病以及干细胞移植研究中发挥了重要的作用，通过将人的干细胞移植于经过预处理的NOD/SCID小鼠体内，来检测移植成功与否，为临床和科学研究提供了重要依据。但是，NOD/SCID鼠也有许多缺点：(1)仍有低水平的NK细胞活性，不同的主要组织相容性位点，完整的融细胞功能如NK细胞穿孔素分子的功能表达，不到10％的NOD/SCID鼠会发生免疫逃逸，产生B淋巴细胞和T淋巴细胞，这些残存的免疫反应将不利于人细胞的植入；(2)NOD/SCID小鼠中人造血干细胞移植的微环境并不清楚，大部分为小鼠源性的，人干细胞由于缺乏对小鼠细胞因子的交叉反应不能利用小鼠的造血细胞因子，同时缺乏与合适的黏附分之间的相互作用将继续阻碍人造血干细胞的植入和生存。这些因素都使得该小鼠模型中人干细胞的植入率较低，使其应用受到了很多的局限性。
近年来，为了提高人干细胞的植入率，研究者们做出了很多努力，包括：(1)给受体小鼠注射CD122抗体减少NOD/SCID小鼠体内残留的NK细胞活性；(2)将较大剂量的人骨髓细胞和细胞因子同时移植；(3)采用髓腔移植的方法进行移植。但是这些方法除了对小鼠的创伤较大以外，所用的抗体和细胞因子的价格都比较昂贵，仅能局限于一些科研实验室的研究，不适宜临床和科研实验的广泛应用。
通过流式细胞仪检测发现，NOD/SCID小鼠与其它普通品系的小鼠相比，骨髓细胞中的活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)水平较高(如图1所示)。活性氧是氧的某些代谢产物和一些反应的含氧物，是体内重要的自由基，主要包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH·)和过氧化氢(H2O2)等。在细胞内的一系列生理活动如调控细胞的增殖、分化、衰老及凋亡中发挥信号分子的作用。近年来，大量的研究结果表明，过多聚积的活性氧可通过多途径诱发膜脂质过氧化链式反应，造成生物膜和DNA的损伤，从而诱导细胞凋亡。
HSCs能够维持在细胞周期的静止期(G0期)，保持其非分裂状态，与其所处的微环境(niche)有重要的联系。最近的研究报道显示，HSCs大都位于低氧的微环境中，这对于HSCs各种功能(如自我更新、G0期的维持)至关重要。NOD/SCID小鼠骨髓微环境中过多聚积的ROS不利于人HSCs的植入，因此，本发明在移植前对受体小鼠进行抗氧化处理，降低其体内的ROS水平，给人的HSCs的植入提供更多和更适宜的微环境以提高HSCs的植入率。
发明内容
本发明针对移植的受体小鼠(NOD/SCID)骨髓微环境中氧代谢的特征，采用抗氧化的方法建立了一种提高人干细胞在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的人干细胞的免疫缺陷鼠模型的构建方法，这种方法明显的提高了人HSCs的植入率，成功率高，小鼠受创较小，费用低廉，简单易实施，降低了NOD/SCID广泛应用于移植实验的各种障碍，为提高人造血干细胞移植的临床效果提供了新的思路。
本发明采用的技术方案是：
一种人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的构建方法，包括如下步骤：移植前采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对受体小鼠(NOD/SCID)进行腹腔注射，同时给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的饮水，将人的干细胞移植后，继续给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸的饮水，即得该人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型。
优选地，所述对受体小鼠进行腹腔注射的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸的使用浓度为50-200mg/kg，更优选为100mg/kg。
优选地，所述抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸腹腔注射处理的时间点为移植前14天，方式为每隔一天一次。
优选地，所述含N-乙酰半胱氨酸的饮水中N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5-5mg/ml，更优选为1mg/ml。
优选地，所述的干细胞移植为将人的干细胞通过受体小鼠的尾静脉或胫骨的髓腔进行移植。
更具体地，该人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的构建方法，包括如下步骤：在移植人的干细胞前14天用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对受体小鼠(NOD/SCID)进行腹腔注射，N-乙酰半胱氨酸使用浓度为100mg/kg，每隔一天一次，同时给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸1mg/ml的饮水，以降低受体小鼠骨髓中的活性氧水平；对受体小鼠进行137Cs源亚致死剂量照射，剂量2.0Gy，剂量率为0.7Gy/min，照射后24小时内将人的干细胞通过受体小鼠的尾静脉或胫骨的髓腔进行移植，移植后继续给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸1mg/ml的饮水，即得该人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型。
本发明还提供了应用上述方法构建的人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型，该模型应属于本发明的保护范围之内。
本发明还提供了上述人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型在人干细胞移植研究中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明针对移植的受体小鼠(NOD/SCID)骨髓微环境中氧代谢的特征(ROS水平较高)，采用抗氧化的方法优化人干细胞植入的微环境，方法新颖，有针对性；采用的腹腔注射抗氧化剂和在小鼠饮水中加入抗氧化剂的方法降低小鼠体内的活性氧水平，改善了以往人们为提高人HSCs植入率使用的一些过程比较复杂的方式。
本发明成功建立了NOD/SCID小鼠移植的优化模型，通过本发明的方法，使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸适度清除NOD/SCID小鼠体内的ROS，无论是在尾静脉还是髓腔移植时都有效的提高了人干细胞的植入率，移植过程中小鼠死亡率低，状态佳，可以长期存活。该方法简单，新颖，易实施，对小鼠的创伤小，且该方法使用的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸价格低廉，该方法把人的造血干细胞的研究引入了更深的层次，从而更快的促进人的造血干细胞移植方面的研究，也为今后NOD/SCID小鼠移植模型广泛的应用于临床和科学研究提供了新的思路。
附图说明
图1是实施例4中NOD/SCID小鼠经NAC处理组与对照组NOD/SCID小鼠未经NAC处理组、普通品系的小鼠B6.SJL和BALB/C，检测到的小鼠骨髓细胞中的活性氧水平的对比图。
图2是本发明采用尾静脉移植的方法，对使用抗氧化剂处理后(NAC+)和不使用抗氧化剂处理(NAC-)的NOD/SCID小鼠检测到的人干细胞在小鼠骨髓和脾脏中的植入率的流式图。
图3是本发明采用髓腔移植的方法，对使用抗氧化剂处理后(NAC+)和不使用抗氧化剂处理(NAC-)的NOD/SCID小鼠检测到的人干细胞在小鼠注射侧胫骨骨髓(IT)，对侧骨髓(BM)和脾脏(SP)中的植入率的流式图。
图4是本发明采用极限稀释的方法，在使用抗氧化剂处理NOD/SCID小鼠后检测到的人干细胞在小鼠骨髓和脾脏中的植入率的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一种人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的构建方法(提高人干细胞在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的方法)，包括如下步骤：
1)取NOD/SCID小鼠8周龄，雌性，饲养于SPF级无菌室内，饲料、饮水及垫料均高压灭菌，移植前14天用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(100mg/kg)对实验组小鼠进行腹腔注射，每隔一天一次，同时在实验组小鼠的饮水中加入N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mg/ml，以降低小鼠骨髓中的活性氧水平，对受体小鼠进行137Cs源亚致死剂量照射，剂量2.0Gy，剂量率为0.7Gy/min，小鼠照射后24小时内将收集到的人CD34+细胞通过小鼠的尾静脉移植，移植细胞数量为：5.0-6.7×105个/只。移植后继续给予实验组小鼠含N-乙酰半胱氨酸1mg/ml的饮水；即得人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型。
移植后12至14周用流式细胞术检测小鼠骨髓和脾脏中人CD45+、CD45+CD33+、CD45+CD19+细胞的百分比。
对比例1
实施例1的对照组：NOD/SCID小鼠在移植前14天，腹腔注射磷酸盐缓冲液，每隔一天一次，同时给予普通无菌水饮水，人干细胞移植后，仍给予普通无菌水饮水。其他条件同实施例1的条件。
实施例1、对比例1尾静脉移植后的检测方法及结果如下：
移植后12至14周，将小鼠脱颈处死，分别收集小鼠骨髓和脾脏细胞1×106个，用染色缓冲液洗涤后重悬，加入人抗体：CD45-PE-Cy7，CD33-Percp-Cy5.5，CD19-PE，4℃避光孵育30分钟，用2ml染色缓冲液洗涤1遍，用流式细胞术检测并比较两组小鼠骨髓和脾脏中人CD45+、CD45+CD33+、CD45+CD19+细胞的百分比。结果如图2所示，从图2中可以看出，实施例1实验组(NAC+)小鼠骨髓和脾脏中人干细胞的植入率较对比例1对照组(NAC-)明显提高：骨髓(NAC-组：11.04±3.11％，NAC+组：23.21±4.0％，p=0.0224；n=20)；脾脏(NAC-组：2.63±0.74％，NAC+组：8.56±1.82％，p=0.0055；n=20)，实验组小鼠骨髓和脾脏的植入率较对照组分别高2.1和3.3倍，各组移植的人CD34+细胞植入受体小鼠后均能够多向分化为髓系细胞(CD45+CD33+)和淋巴系细胞(CD45+CD19+)，且大部分偏向B淋巴系分化。
实施例2
一种人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的构建方法(提高人干细胞在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的方法)，包括如下步骤：
1)取NOD/SCID小鼠8周龄，雌性，饲养于SPF级无菌室内，饲料、饮水及垫料均高压灭菌，移植前14天用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(100mg/kg)对实验组小鼠进行腹腔注射，每隔一天一次，同时在实验组小鼠的饮水中加入N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mg/ml，以降低小鼠骨髓中的活性氧水平，对受体小鼠进行137Cs源亚致死剂量照射，剂量2.0Gy，剂量率为0.7Gy/min，小鼠照射后24小时内采用腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)的方法麻醉小鼠，将流式分选的人
Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow干细胞通过小鼠的胫骨进行髓腔移植，移植细胞数量为100，50，20，10个/组。
移植后继续给予小鼠N-乙酰半胱氨酸饮水(1mg/ml)，即得人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型。
移植后12至14周用流式细胞术检测检测小鼠骨髓和脾脏中人CD45+、CD45+CD33+、CD45+CD19+细胞的百分比。
对比例2
实施例2的对照组：NOD/SCID小鼠在移植前14天，腹腔注射磷酸盐缓冲液，每隔一天一次，同时给予普通无菌水饮水，人干细胞移植后，仍给予普通无菌水饮水。其他条件同实施例2的条件。
实施例2、对比例2髓腔移植后的检测方法及结果如下：
移植后12至14周，将小鼠脱颈处死，分别收集小鼠注射侧胫骨骨髓(IT)，对侧骨髓(BM)和脾脏(SP)细胞1×106个，用染色缓冲液洗涤后重悬，加入人抗体：CD45-PE-Cy7，CD33-Percp-Cy5.5，CD19-PE，4℃避光孵育30分钟，用2ml染色缓冲液洗涤1遍，用流式细胞术检测并比较两组小鼠中人CD45+、CD45+CD33+、CD45+CD19+细胞的百分比。结果如图3所示，从图3中可以看出，采用髓腔移植的方法移植人的Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow干细胞，实施例2实验组(NAC+)小鼠注射侧胫骨骨髓(IT)，对侧骨髓(BM)和脾脏(SP)中人干细胞的植入率较对比例2的对照组(NAC-)明显提高：IT(NAC-组：2.3±0.89％，NAC+组：5.85±1.48％，p=0.0436；n=29)；BM(NAC-组：0.78±0.4％，NAC+组：2.75±0.8％，p=0.0352；n=29)；SP(NAC-组：0.17±0.11％，NAC+组：0.96±0.34％，p=0.0317；n=29)，实施例2实验组小鼠IT，BM和SP中的植入率分别较对比例2对照组高2.5，3.5和5.7倍，各组移植的人Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow干细胞植入受体小鼠后均能够多向分化为髓系细胞(CD45+CD33+)和B淋巴系细胞(CD45+CD19+)，且大部分偏向B淋系分化。
实施例3
采用极限稀释的方法，改变实施例2、对比例2中的移植细胞数量，其他条件不变，移植细胞数量为：100，50，20，10个/组。如图4所示，根据泊松分布的原理计算出在使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸处理后，NOD/SCID小鼠注射侧胫骨骨髓(IT)，对侧骨髓(BM)和脾脏(SP)中人SCID再植细胞(SCID-repopulatingcell，SRC)出现的概率分别为：1/36，1/50，1/57；对照组分别为：1/108，1/203，1/448。说明在使用抗氧化剂处理后的NOD/SCID小鼠对于检测人SCID再植细胞的敏感度分别提高3.0，4.1和7.9倍。
实施例4NOD/SCID小鼠骨髓细胞活性氧水平检测
NOD/SCID、B6.SJL和BALB/C小鼠8周龄，雌性，饲养于SPF级无菌室内，饲料、饮水及垫料均高压灭菌。
实验组(NOD/SCIDNAC处理组)：用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(100mg/kg)对NOD/SCID小鼠进行腹腔注射，每隔一天一次，同时在小鼠的饮水中加入N-乙酰半胱氨酸(1mg/ml)，以降低小鼠骨髓中的活性氧水平。
对照组包括三组：B6.SJL、BALB/C、NOD/SCID。
对照组小鼠腹腔注射PBS缓冲液，每隔一天一次，小鼠给予普通无菌水作为饮水。
两周后将小鼠脱颈处死，冲出骨髓细胞，收集1×106细胞用PBS洗涤后，加入双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)液，终浓度5μM，37℃避光孵育20分钟，PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测，DCFH-DA自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在的情况下被氧化成DCF，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正比，因此各组小鼠骨髓细胞中DCF的平均荧光强度，即为活性氧水平，DCF激发波长488nm，吸收波长525nm。
如图1所示，在同等实验条件下，与B6.SJL和BALB/C小鼠相比，NOD/SCID小鼠骨髓细胞中的ROS水平要高(B6.SJL：38.49±2.78，BALB/C：55.42±3.26，NOD/SCID：566.5±32.47，N=6；p＜0.0001)。
NOD/SCID小鼠用NAC处理后，NOD/SCID小鼠骨髓细胞中ROS水平明显降低(对照组：566.5±32.47，NAC处理组：108.2±7.85，n=6；p＜0.0001)。
实施例5人CD34+细胞富集方法
健康妊娠新生儿脐血，取自天津中心妇产医院，无菌操作采集，方法如下：
(1).将新鲜脐血分装于无菌的血浆瓶中，以脐血：HES(羟乙基淀粉)=(5：1)的体积比加入HES，充分混匀，室温静置40分钟以沉降红细胞。
(2).将去除红细胞的脐血液体30ml缓慢加到15ml的Ficoll液上，不要破坏界面，尽量多加。离心，20℃，2000rpm，20分钟，去刹闸。
(3).吸弃一部分上清后小心收集单个核细胞层(白膜层)于含有10ml的缓冲液(PBS+0.2mM-EDTA+0.5％FBS)的离心管中，充分混匀，离心，20℃，1600rpm，10分钟。
(4).弃上清，每管用40ml的缓冲液重悬，充分混匀后计数。离心，20℃，1200rpm，10分钟。
(5).弃上清，每108细胞用300μl的缓冲液重悬。
(6).每108细胞加入100μl的Fc-R阻断剂，避光。
(7).每108细胞再加入100μl的CD34+Microbeads，充分混匀后4℃避光孵育30分钟。
(8).孵育结束后，每108细胞用40ml缓冲液洗一遍，1500rpm，10分钟。
(9).弃上清，每108细胞用500μl缓冲液重悬。安装LS柱，3ml缓冲液润柱，3遍。
(10).逐滴加入细胞悬液，梯度磁场中通过，用3ml缓冲液洗柱，3遍。
(11).将柱子移除磁场，放在收集管上，加入5ml缓冲液，用活塞快速推出细胞，计数，调整细胞浓度为1×106/ml，冻存。
实施例6人Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rho123low干细胞的富集：
健康妊娠新生儿脐血，取自天津中心妇产医院，无菌操作采集，方法如下：
(1).将新鲜脐血分装于无菌的血浆瓶中，以脐血：HES(羟乙基淀粉)=(5：1)的体积比加入HES，充分混匀，室温静置40分钟以沉降红细胞。
(2).将去除红细胞的脐血液体30ml缓慢加到15ml的Ficoll液上，不要破坏界面，尽量多加。离心，20℃，2000rpm，20分钟，去刹闸。
(3).吸弃一部分上清后小心收集单个核细胞层(白膜层)于含有10ml的缓冲液的离心管中，充分混匀，离心，20℃，1600rpm，10分钟。
(4).弃上清，每管用40ml的缓冲液重悬，充分混匀后计数。离心，20℃，1200rpm，10分钟。
(5).弃上清，每108细胞用400μl的缓冲液重悬。
(6).每108细胞加入100μl的Biotin-AntibodyCocktail，充分混匀后4℃避光孵育10分钟。
(7).孵育结束后，每108细胞用10ml的缓冲液洗一遍，离心，1500rpm，10分钟。
(8).弃上清，每108细胞用800μl缓冲液重悬。每108细胞加入200μl的Anti-BiotinMicrobeads，充分混匀后4℃避光孵育15分钟。
(9).孵育结束后，每108细胞用10ml缓冲液洗一遍，1500rpm，10分钟。
(10).每108细胞用500μl缓冲液重悬，安装LS柱，3ml缓冲液润柱，3遍。逐滴加入细胞悬液，梯度磁场中通过，3ml缓冲液洗柱，3遍，收集Lin-细胞计数。
(11).将分离好的人Lin-细胞进行抗体标记，方法如下：
收集Lin-细胞用500μl的缓冲培养基(MEM+20％FBS)重悬，加入500μl罗丹明(Rho，0.2μg/ml)37℃，避光孵育30分钟。加入15ml预冷的培养基终止反应，离心1500rpm，5分钟。再加入15ml缓冲培养基，37℃，避光孵育15分钟，离心1500rpm，5分钟，用100μl的染色缓冲液(PBS+0.2mM-EDTA+2％FBS)重悬，加入如下抗体：
4℃避光孵育20分钟，用2ml缓冲液洗涤1遍，用缓冲液重悬后进行流式分选CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rho123low的干细胞。
本发明实施例5、6在实验室中是处于实施例1、2、3之前进行的，因其内容较多，且本发明的核心内容是人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型的构建方法，因此实施例5、6的内容相对于实施例1、2、3重要性低一些，故放在最后的实施例中。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (4)
1.一种人干细胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：移植前采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对受体小鼠(NOD/SCID)进行腹腔注射，同时给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸（NAC）的饮水，将人的干细胞移植后，继续给予受体小鼠含N-乙酰半胱氨酸的饮水，即得该人干细胞的免疫缺陷鼠移植模型；所述抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸腹腔注射处理的时间点为移植前14天，方式为每隔一天一次，所述对受体小鼠进行腹腔注射的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸的使用浓度为50-200mg/kg；所述的干细胞移植为将人的干细胞通过受体小鼠的胫骨的髓腔进行移植，移植细胞数量为100，50，20或10个。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述对受体小鼠进行腹腔注射的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸的使用浓度为100mg/kg。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述含N-乙酰半胱氨酸的饮水中N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5-5mg/ml。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述含N-乙酰半胱氨酸的饮水中N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mg/ml。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107156059A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-09-15 | 浙江大学 | 一种利用干细胞构建人源化慢性乙型肝炎鼠模型的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102920522A (zh) | 2013-02-13 |
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