CN102914610B - 准动态二维制备液相色谱系统及物质分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种准动态二维制备液相色谱系统及物质分离纯化方法。该系统包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和三通阀，该第一维色谱单元包括第一维色谱柱、进样单元及检测单元，该第二维色谱单元包括第二维色谱柱，其中，该第一维色谱柱的进样端及出样端分别与进样单元及三通阀的第一接口连通，该第二维色谱柱的进样端及出样端分别与三通阀的第二接口及检测单元连通，该三通阀的第三接口与检测单元连通；该方法是通过切换三通阀的共组状态，实现第一维色谱单元的独立工作或与第二维色谱单元协同工作。本发明能够保证大进样量的同时大大提高系统分离能力，且大大降低硬件和生产成本，应用范围广，尤其适合于复杂样品中微量组分的分离纯化。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种准动态二维制备液相色谱系统及物质分离纯化方法，属于色谱分离技术领域，
背景技术
制备液相色谱是获取纯样品的一种高效分离技术，其诞生于20世纪30年代，最初应用于色素的分离，至今得到了长足发展，如今已被广泛运用于医药工业，蛋白分离纯化等领域，如次生类代谢产物、天然产物、大分子化合物及某些重要的药用生物活性蛋白、生物治疗品与诊断试剂的分离纯化。但是，制备液相色谱与分析高效液相色谱比较分离效率不高，不能满足高纯度、高产量的需求。于是，人们致力寻找一种高分离效率的制备色谱模式，降低生产成本，得到高纯的样品。进样量与分离效率是液相制备色谱的两个重要指标，而进样量增加，会降低分离效率。关亚风等发明了一种内径逐渐缩小的锥形柱。此内径逐渐缩小的锥形柱，选择合适的锥角，使色谱谱带流型接近筛子状流型，其上样量大同时能有效提高柱效。但是该色谱柱提高的柱效有限，对一些复杂物质分离效果不尽人意。有人通过改进柱设计提出抛物线式色谱柱及色谱球，以进一步提高分离效率。将两个独立色谱系统串联起来的二维液相色谱(2D-LC)，在一维系统中不能完全分离的组分，有可能在二维系统中得到较好的分离，因此整个二维系统的分离能力，系统分辨率、峰容量较一维色谱系统得到了大大提高。在制备色谱中，有人首先使用离线二维模式，将样品用低压制备液相色谱粗分，将收集的洗脱液浓缩后，再以中、高压液相色谱分离。这种方法操作复杂费时费力，且浪费大量溶剂，生产成本高。有人将低、中、高压制备液相色谱系统结合构建在线二维制备液相色谱系统，用于规模化制备生产。但是在线二维液相色谱系统，需要两个制备液相色谱系统，对于复杂样品中单个目标物分离纯化，初期投资过高。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明旨在提供一种准动态二维制备液相色谱系统及物质分离纯化方法，其能够实现高纯度、高产量的分离需求，且操作简便，经济成本低。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种准动态二维制备液相色谱系统，包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和三通阀，所述第一维色谱单元包括第一维色谱柱、进样单元及检测单元，所述第二维色谱单元包括第二维色谱柱，其中，所述第一维色谱柱的进样端及出样端分别与进样单元及三通阀的第一接口连通，所述第二维色谱柱的进样端及出样端分别与三通阀的第二接口及检测单元连通，所述三通阀的第三接口与检测单元连通。
进一步的，所述三通阀至少具有两种工作状态，在一种工作状态下，第一维色谱单元的出样端通过三通阀直接与检测单元连通，在另一种工作状态下，第一维色谱单元的出样端通过三通阀直接与第二维色谱单元的进样端连通。
作为优选方案之一，所述第二维色谱柱的内径小于所述第一维色谱柱的内径。
作为优选方案之一，所述第二维色谱柱长度长于所述第一维色谱柱的长度。
作为优选方案之一，所述第一维色谱柱和/或第二维色谱柱采用色谱塔。
作为优选方案之一，所述第一维色谱柱及第二维色谱柱内均填充有一种以上固定相。
作为优选方案之一，所述第一维色谱柱和/或第二维色谱柱内于两个以上选定区域中分别填充有两种以上固定相。
作为优选方案之一，所述第二维色谱柱内固定相的粒度不大于第一维色谱柱内固定相的粒度。
一种基于上述准动态二维制备液相色谱系统的物质分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)在初始状态下，第一维色谱柱的出样端通过三通阀直接与检测单元连通；
(2)利用进样单元将含目标物的样品输入第一维色谱柱，使样品在第一维色谱柱中初步分离，同时利用检测单元实时监测样品分离情况；
(3)当目标物开始被从第一维色谱柱中洗脱时，切换三通阀，使第一维色谱柱的出样端通过三通阀直接与第二维色谱柱的进样端连通，并使目标物通过中心切割的方式直接进入第二维色谱柱；
(4)当目标物完全进入第二维色谱柱后，切换三通阀至初始状态，使第一维色谱柱通过三通阀直接与检测单元连通，并将保留于第一维色谱柱中的后于目标物洗脱的物质完全洗脱；
(5)再次切换三通阀，使第一维色谱柱的出样端通过三通阀直接与第二维色谱柱的进样端连通，对保留于第二维色谱柱中的目标物进行进一步分离纯化。
进一步的，该方法还包括如下步骤：
(6)通过检测单元对分离纯化的目标物进行检测，待达到设定标准后收集。
与现有技术相比，本发明至少具有如下积极效果：
(1)本发明通过三通阀将第一维色谱单元和第二维色谱单元有机结合，复杂样品在第一维系统中经过粗分后通过中心切割的方式，将目标物转入第二维色谱单元中，去掉绝大部分杂质，然后进行进一步分离纯化，保证大进样量的同时大大提高系统分离能力；
(2)本发明仅需在第一维色谱单元后使用三通阀连接第二维色谱单元，即可将目标物经第一维分离后通过中心切割的方式进入第二维色谱单元进一步分离纯化，完成两个分离系统的工作，能大大降低硬件和生产成本；
(3)本发明中第一维色谱柱中可以填充两种填料，下部为与第二维相同色谱填料，上部为粒径更粗的填料，因此，当第二维色谱柱填料发生塌陷时，第一维色谱柱中下部的填料会进入第二维色谱柱，实现色谱柱的修补，具有准动态压缩柱的功能，大大提高色谱柱使用寿命；同时对溶解性差的样品，可以在第一维色谱柱上部通过拌样方式进样，应用范围广。
(4)本发明操作简单，易于实现自动化，进样之后仅需切换三次三通阀，即可完成在线二维分离；
(5)本发明的应用范围广，可以用于天然产物的分离纯化、生物样品的分离纯化、药物的分离及手性样品的分离，特别适合于复杂样品中微量组分的分离纯化。
附图说明
图1是本发明一较佳实施例中准动态二维制备液相色谱系统的结构示意图；
图2为本发明一较佳实施例中山茶花原始样品的HPLC分析色谱图；
图3为本发明一较佳实施例中被从原始样品中分离纯化后所获目标物的HPLC分析色谱图。
具体实施方式
如前所述，有鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人提供了一种准动态二维制备液相色谱系统以及基于该准动态二维制备液相色谱系统的物质分离纯化方法。
作为本发明的一个方面，其技术方案如下：
一种准动态二维制备液相色谱系统，包括第一维色谱单元和第二维色谱单元，第一维色谱单元与第二维色谱单元以三通阀连接组成准动态二维制备液相色谱系统，用于规模化制备生产。其中，第一维色谱单元可为一套一维色谱分析系统，包括第一维色谱柱、进样单元和检测单元等，而第二维色谱单元可包括第二维色谱柱。
进一步的讲，前述三通阀的第一、二个接口分别与第二维色谱柱柱头和第一维色谱柱柱尾相接，第三个接口与检测单元相接；初始状态下，第一维色谱柱通过三通阀与检测单元相连，并由检测单元对样品分离情况进行实时监测，当目标物开始被从第一维色谱柱中洗脱下来时，立即切换三通阀，使得第一维色谱柱与第二维色谱柱相连，目标物通过中心切割的方式直接进入第二维色谱柱；然后，再次切换三通阀，使其恢复初始状态，直至将后于目标物洗脱的物质洗脱；最后，再次切换三通阀，使得第一维色谱柱与第二维色谱柱相连，对第二维色谱柱中的物质进行进一步分离纯化，并可通过检测单元对分离纯化的目标物纯度等进行检测，确定是否收集。
前述第一维、第二维色谱柱均可采用利于物质分布的色谱塔；优选的，较第一维色谱柱，第二维色谱柱内径更小，长度更长，且使用的填料粒径不大于第一维色谱柱填料粒径。
前述第一维、第二维色谱柱中使用的固定相可以为各种规格的聚合物材料及颗粒、硅胶以及原位聚合的整体材料，例如，反相填料、正相填料、离子交换树脂填料、体积排阻填料、整体填料、手性填料以及亲和填料。
该准动态二维制备液相色谱系统可应用于天然产物的分离纯化、生物样品的分离纯化、药物的分离及手性样品的分离。
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1，本实施例所涉及的准动态二维制备液相色谱系统主要由第一维分离系统、第二维色谱柱5和连接该两个部分的三通阀3组成，第一维分离系统包括第一维色谱柱2、检测器7及进样单元6，其中，三通阀3的三个接口分别与第二维色谱柱5柱头、第一维色谱柱2柱尾及检测器7连通，且第二维色谱柱5柱尾与检测器7相连。
第一维色谱柱2为内径40mm，长150mm的色谱塔，上部装填粒径为50μm的C18填料1，底部为粒径25μm的C18填料4。第二维色谱柱5为内径25mm，长300mm的色谱塔，装填粒径25μm的C18填料4。
以该准动态二维制备液相色谱系统对山茶花提取液中的一低含量杂质(目标物)进行分离纯化的过程如下：
请参见图2系原样HPLC分析色谱图。
在初始状态，第一维色谱柱2通过三通阀3与检测器7相连，样品在第一维色谱塔2中初步分离，检测器7对样品分离情况进行实时监测；
当目标物从第一维色谱柱2中洗脱下来时，切换三通阀3，使得第一维色谱柱2与第二维色谱柱5连通，目标物通过中心切割的方式直接进入第二维色谱柱5；然后三通阀3切换至初始状态，将后于目标物洗脱的物质洗脱；最后再次切换三通阀3，对第二维色谱柱5中的物质进行进一步分离纯化，再通过检测器进行检测确定后收集，收集的目标物用HPLC进行分析，谱图如图3所示。
前述检测器采用紫外检测器，其检测波长为230nm。
样品的HPLC分析条件为：第一、第二维色谱柱分离均使用0.1％三氟醋酸水溶液、乙腈为流动相，梯度洗脱。
HPLC分析系统色谱柱为SinoChrom ODS-BP(4.6×150mm5um)。
本发明系统结构简单，使用一套一维色谱分离制备系统连接第二维色谱柱构成了具有动态压缩功能的二维制备系统，保证大进样量的同时大大提高了制备色谱系统的分离能力和色谱柱的使用寿命；操作简单，易于实现自动化；不仅能大大降低制备过程的生产成本，而且通用性好，应用范围广。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，它包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和三通阀(3)，所述第一维色谱单元包括第一维色谱柱(2)、进样单元(6)及检测单元(7)，所述第二维色谱单元包括第二维色谱柱(5)，其中，所述第一维色谱柱(2)的进样端及出样端分别与进样单元(6)及三通阀(3)的第一接口连通，所述第二维色谱柱(5)的进样端及出样端分别与三通阀(3)的第二接口及检测单元(7)连通，所述三通阀(3)的第三接口与检测单元(7)连通。
2.根据权利要求1所述的准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，所述第二维色谱柱(5)的内径小于所述第一维色谱柱(2)的内径。
3.根据权利要求1所述的准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，所述第二维色谱柱(5)长度长于所述第一维色谱柱(2)的长度。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，所述第一维色谱柱(2)和/或第二维色谱柱(5)采用色谱塔。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，所述第一维色谱柱(2)及第二维色谱柱(5)内均填充有一种以上固定相。
6.根据权利要求5所述的准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，所述第一维色谱柱(2)和/或第二维色谱柱(5)内于两个以上选定区域中分别填充有两种以上固定相。
7.根据权利要求5所述的准动态二维制备液相色谱系统，其特征在于，所述第二维色谱柱(5)内固定相的粒度不大于第一维色谱柱(2)内固定相的粒度。
8.一种基于权利要求1-7中任一项所述准动态二维制备液相色谱系统的物质分离纯化方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)在初始状态下，第一维色谱柱(2)的出样端通过三通阀(3)直接与检测单元(7)连通；
(2)利用进样单元将含目标物的样品输入第一维色谱柱(2)，使样品在第一维色谱柱(2)中初步分离，同时利用检测单元(7)实时监测样品分离情况；
(3)当目标物开始被从第一维色谱柱(2)中洗脱时，切换三通阀(3)，使第一维色谱柱(2)的出样端通过三通阀(3)直接与第二维色谱柱(5)的进样端连通，并使目标物通过中心切割的方式直接进入第二维色谱柱(5)；
(4)当目标物完全进入第二维色谱柱(5)后，切换三通阀(3)至初始状态，使第一维色谱柱(2)通过三通阀(3)直接与检测单元(7)连通，并将保留于第一维色谱柱(2)中的后于目标物洗脱的物质完全洗脱；
(5)再次切换三通阀(3)，使第一维色谱柱(2)的出样端通过三通阀(3)直接与第二维色谱柱(5)的进样端连通，对保留于第二维色谱柱(5)中的目标物进行进一步分离纯化；
(6)通过检测单元(7)对分离纯化的目标物进行检测，待达到设定标准后收集。
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Denomination of invention: Quasi dynamic two-dimensional preparation liquid chromatography system and material separation and purification method Granted publication date: 20140813 Pledgee: Bank of China Limited Suqian City Branch Pledgor: Zhongke Woye Jiangsu Biology Co.,Ltd. Registration number: Y2024980038107 |