CN102914601B - 一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法。主要步骤是：配制含固定浓度内标化合物的内标溶液，用内标溶液配制系列浓度的待测成分的标准溶液，用液-质联用MRM模式分析，绘制X轴为浓度；Y轴为成分峰面积与内标峰面积之比的标准曲线，用内标溶液提取亚麻籽样品并对该提取液进行液-质联用MRM模式分析，从标准曲线或其回归方程中求出亚麻籽产品中的有益成分(亚麻木脂素，SDG)及有害成分(亚麻氰苷和新亚麻氰苷)的含量。本检测方法有快速、准确、重现性好，所用时间短等优点，是亚麻籽产品质量控制和生产条件的重要监测手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，特别指一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测力法。
背景技术
亚麻(linum usitatissimunL.)亦称胡麻，是世界十大油料作物之一。亚麻种子-亚麻籽中含有α-亚麻酸和木脂素等多种对健康有益的成分。亚麻籽木脂素-裂环异落叶松脂素双糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)经体内代谢活性化后具有改善妇女更年期症状、防治乳腺癌等功效[张才煜，张本刚，杨秀伟.亚麻子化学成分及其药理作用研究进展.中国新药杂志，2005，14(5)：525—530]。另一方面，亚麻籽中也含有生氰糖苷类化合物-亚麻氰苷和新亚麻氰苷。生氰糖苷在酶或消化道酸和微生物的作用下会分解释放出毒性很强的氢氰酸，因此大量食用含有生氰糖苷的亚麻籽产品会引起食物中毒[周小洁，车向荣，于霏.亚麻籽及其饼粕的营养学和毒理学研究进展.饲料工业，2005，26(19)：46-50]。准确快速的生氰糖苷和SDG检测方法对确保亚麻籽产品的食用安全以及指导高质量亚麻籽产品的生产非常重要。
迄今为止，亚麻籽及其产品中生氰糖苷的检测方法主要有硝酸银滴定法、氰离子选择电极法、比色法和高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)等，其中高效液相色谱法有重复性好、回收率高的优点[周小洁，车向荣，于霏.亚麻籽及其饼粕的营养学和毒理学研究进展.饲料工业，2005，26(19)：46-50]。然而，由于亚麻籽中的生氰糖苷缺乏共轭双键，紫外吸收不强，影响了紫外检测定量的灵敏度。近年发展起来的质谱检测可以很好得弥补紫外检测的不足，特别是质谱(MS)的多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式，在定量化合物时不仅考虑了保留时间，还考虑了化合物的母离子及子离子，大大提高了定量分析的分辨率和准确度。近年虽有个别高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测亚麻籽生氰糖苷的报道[Park，Eun-Ryong；Hong，Jin-Hwan；Lee，Dong-Ha；Han，Sang-Bae；Lee，Kang-Bong；Park，Jae-Seok；Chung，Hyung-Wook；Hong，Kyung-Hyun；Kim，Myung-Chul.Analysis and decrease of cyanogenic glucosides in flaxseed.Korea Food andDrug Administration.(2005)，34(6)，875-879]，但还没有使用定量方面更有优势的MRM模式检测法的报道。另外，对亚麻籽木脂素SDG及亚麻氰苷和新亚麻氰苷的同时定量方法还没见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法。本检测方法采用含内标化合物的甲醇溶液对亚麻子产品进行提取和前处理，之后通过U／HPLC-MS的MRM模式对亚麻氰苷、新亚麻氰苷及亚麻籽木脂素SDG这三种成分进行定性定量分析。
本发明要解决的技术问题由如下方案实现：一种亚麻籽产品中有益及有害成分的检测方法，步骤特征是：
(1)内标溶液配制：配制含内标化合物浓度固定在0.1-500μg／mL的甲醇溶液；
(2)配制标准曲线用溶液：用步骤(1)所述内标溶液溶解亚麻籽纯成分得到浓度为0.5—500μg／mL的标准品储存液，用步骤(1)所述内标溶液稀释所述标准品储存液得到系列浓度的标准溶液；
(3)亚麻籽油样品处理：取50-5000μL亚麻籽油加0.1—10mL的步骤(1)所述内标溶液进行萃取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析；
(4)亚麻籽固体样品处理：取15-1500mg亚麻籽固体样品加0.1-10mL的步骤(1)所述内标溶液进行提取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析；
(5)液-质联用分析：高效液相色谱-质谱联用定量分析色谱柱填料为反相硅胶ODS，流动相为AB两相梯度洗脱，其中A为含酸的水溶液；B为乙腈或甲醇，采用负离子模式多反应监测质谱定量；
(6)待测物浓度计算：步骤(2)的标准溶液用步骤(5)的方法来分析，求出Y轴为响应因子，X轴为成分浓度的标准曲线，其中响应因子为成分峰面积与内标峰面积之比。上述步骤(3)和步骤(4)的样品经步骤(5)的方法分析可得出亚麻籽样品中成分的响应因子，再用标准曲线计算出待测物浓度。整个计算过程可用相应计算机软件或(超)高效液相色谱-质谱联用仪所带软件完成。
首先选定结构性质与待测成分相近的化合物为内标物。然后固定内标化合物的浓度，配置一系列浓度的亚麻氰苷、新亚麻氰苷及SDG的标准溶液，用LC-MS的MRM模式测定。根据标准品的浓度和化合物与内标物面积之比绘制标准曲线(如图2)，求出横轴为化合物浓度，纵轴为化合物与内标物面积之比的线性回归方程。用含同样浓度内标的甲醇溶液提取样品，LC-MS的MRM模式测定面积，将化合物与内标物面积之比代入回归方程计算化合物的浓度。计算过程可用各种定量软件完成。测得加标回收率为85.3～112.3％，说明该方法准确度符合实验要求，结果可靠。
本发明的优点是：选用了性质与化合物相近的内标化合物，并在提取样品时既加入内标化合物，在整个样品前处理与分析过程中内标化合物与待测化合物共存，从而尽可能地抵消了提取率不全及分析过程中的误差。本检测方法具有快速、准确、重现性好，能同时测定亚麻籽有益成分和有害成分等优点。
附图说明
图1为1亚麻氰苷、2新亚麻氰苷及3SDG的化学结构式。
图2为亚麻木脂素(SDG)的标准曲线。
图3为本检测方法的流程图。
具体实施方式
以下(图3)具体实施方式和步骤仅为一例，但内标化合物不限于例中所用化合物，也可选其它和待测物结构相近的化合物作为内标，如芦丁等其它酚类成分、海藻糖等其它碳水化合物，可使用一种内标，也可分别针对于SDG和生氰糖苷使用两种内标化合物。在原理相同的情况下具体步骤和样品提取的料液比例可适当调整。
①配制内标溶液：配制内标物(相思子素-2″-O-芹菜糖甙，Abrusin2″-0-β—apioside)浓度为10μg／mL的甲醇溶液。
②配制标准曲线用溶液：配制含50μg／mL的亚麻氰苷、新亚麻氰苷及SDG和10μg／mL内标化合物的甲醇溶液，用上述内标溶液按照1∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3比例稀释得系列浓度的标准溶液。
③亚麻籽油样品处理：取500μL亚麻子油加1mL上述含内标溶液超声提取10min后再震摇1min，如此反复3次，静置分层，取上清液过0.22微米滤膜后，得样品溶液做液-质联用分析。
④亚麻籽固体样品处理：取150mg固体样品加1mL上述内标溶液超声提取10min后震摇1min，如此反复3次，然后10000rmp离心2.5min，取上清液过0.22微米滤膜后，得样品溶液做液-质联用分析。
⑤液-质联用分析：超高效液相色谱-质谱联用定量分析用色谱柱为AgilentZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm；粒径1.8μm)，柱温保持在30℃。流动相为AB两相梯度洗脱，其中A为含0.1％(v／v)甲酸的水溶液，B为甲醇。洗脱程序为0min，2％B；3min，20％B；3.5min，40％B；5min，50％B；5.5min，100％B；7min，100％B。流速0.4mL／min；样品注射量为2μL。质谱毛细管电压4kV，离子源温度350℃，采用负离子模式多反应监测(MRM)定量，参数设置如表1所示。
表1亚麻籽成分及内标物的MRM测定条件
其中亚麻氰苷的裂解电压可以为5-500，优选140-180；新亚麻氰苷的裂解电压可以为5-500，优选150-190；SDG的裂解电压可以为5-500，优选120-180。所有化合物的碰撞能量可以为5-200，优选表中所示数值±10。
表2例举了目标及内标化合物的名称、保留时间和最低定量限等参数。最低定量限定义为信噪比为10时的浓度。标准曲线方程中的X为被测物浓度，Y为响应因子(被测物与内标峰的峰面积之比)。
⑥待测物浓度计算：通过将样品溶液中目标物的响应因子代入标准曲线方程求出其浓度，进而引入提取溶剂的用量及稀释倍数计算出各目标化合物在样品中的含量。
表2亚麻籽成分定量的有关参数
Claims (1)
1.一种亚麻籽产品中有益成分SDG及有害成分亚麻氰苷和新亚麻氰苷的检测方法，步骤特征是：
(1)内标溶液配制：配制含内标化合物浓度固定在0.1-500μg／mL的甲醇溶液；
(2)配制标准曲线用溶液：用步骤(1)所述内标溶液溶解亚麻纯成分得到浓度为0.5—500μg/mL的标准品储存液，用步骤(1)所述内标溶液稀释所述标准品储存液得到系列浓度的标准溶液；
(3)亚麻籽油样品处理：取50-5000μL亚麻籽油加0.1-10mL的步骤(1)所述内标溶液进行萃取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析；
(4)亚麻籽固体样品处理：取15-1500mg亚麻籽固体样品加0.1-10mL的步骤(1)所述内标溶液进行提取，静置或离心分层，取上清液做液-质联用分析；
(5)液-质联用分析：高效液相色谱-质谱联用定量分析色谱柱填料为反相硅胶ODS，流动相为AB两相梯度洗脱，其中A为含酸的水溶液；B为甲醇，采用负离子模式多反应监测质谱定量，洗脱程序为0min，2％B；3min，20％B；3.5min，40％B；5min，50％B；5.5min，100％B；7min，100％B；
(6)待测物浓度计算：步骤(2)的标准溶液用步骤(5)的方法来分析，求出Y轴为响应因子，X轴为成分浓度的标准曲线，其中响应因子为成分峰面积与内标峰面积之比，上述步骤(3)和步骤(4)的样品经步骤(5)的方法分析可得出亚麻籽样品中成分的响应因子，再用标准曲线计算出待测物浓度。
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| 亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定——高效液相色谱-二极管阵列检测-电喷雾质谱法;张文斌 等;《浙江大学学报(农业与生命科学版)》;20080915;第34卷(第5期);第564-570页 * |
| 张文斌 等.亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定——高效液相色谱-二极管阵列检测-电喷雾质谱法.《浙江大学学报(农业与生命科学版)》.2008,第34卷(第5期), |
| 胡麻籽活性成分研究应用进展;魏长庆 等;《粮食与油脂》;20120410(第4期);第6-8页 * |
| 魏长庆 等.胡麻籽活性成分研究应用进展.《粮食与油脂》.2012,(第4期), |
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