CN102908401A - 荜茇在制备抑制神经炎症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了荜茇或其提取物在抑制神经炎症的药物中的应用。所述荜茇提取物是以醇为提取液进行提取获得的提取物。实验证明，荜茇或其提取物可以抑制小胶质细胞激活，减轻神经炎症的发生，从而达到治疗中枢神经系统疾病的效果。
Description
技术领域
本发明涉及荜茇或其提取物在制备抑制神经炎症的药物中的应用，特别涉及荜茇或其提取物在制备通过抑制神经炎症来治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
背景技术
免疫系统在维护组织稳态以及应对感染和伤害中起着重要的作用。小胶质细胞是中枢神经系统常驻免疫细胞，是单核吞噬细胞家族的成员之一，参与脑内的固有免疫反应。正常情况下小胶质细胞起免疫监视作用，通过简单的吞饮起到清除代谢产物，维护组织稳定的净化作用。在正常的生理条件下，大脑被认为是免疫豁免的。实际上，抗原呈递被主动抑制，小胶质细胞维持在静息状态，而免疫组分被血脑屏障排除在大脑之外。然而，神经损伤或有毒物质的存在，会刺激免疫细胞促炎症介质的释放，这些促炎性介质诱发了神经炎症反应。当神经炎症在适当的时机以适当的程度出现时，它可以解除诱发刺激，并恢复大脑的稳态和功能。有益的急性神经炎症反应可修复已有的损害，并将进一步损伤降至最低。然而如果小胶质细胞发生了持续的过度激活，那么促炎症因子（如TNF-α，IL-1β和PGE2）的长时间无调控释放创建了一个不利的神经毒性环境，损害了神经元，并损伤了大脑的正常功能（Block M.L.and Hong J.S.Microglia and inflammation-mediated neurodegeneration:multiple triggerswith a common mechanism.Prog.Neurobiol,2005,76:77–98.）。
近十多年来，临床研究和动物实验的证据说明了脑内神经炎症与多种中枢神经系统疾病密切相关，如帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、癫痫(epilepsy)和脑缺血(cerebral ischemia)等(Zipp F,Aktas O.The brain as a target ofinflammation:common pathways link inflammatory and neurodegenerative diseases.Trends Neurosci,2006,29:518–527)。中枢神经系统疾病往往伴有神经元细胞的大量坏死以及凋亡，而这些坏死病灶周围聚集大量活化的小胶质细胞，并且可以检测到其分泌的各种免疫因子和细胞毒因子，包括花生四烯酸代谢产物前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、细胞因子(cytokine)、炎性趋化因子(inflammatorychemokines)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和兴奋性氨基酸如谷氨酸等(Brown GC,Bal-Price A.Inflammatoryneurodegeneration mediated by nitric oxide,glutamate,and mitochondria.MolNeurobiol,2003,27:325-355)，它们对周围神经元的存亡起着决定性的作用，更为重要的是这些因子之间相互作用和相互调节，当它们过度产生时，彼此扩大各自的毒性，最终导致神经元的损伤、变性甚至死亡(Block ML,Zecca L,HongJS.Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms.Nat Rev Neurosci,2007,8:57–69)。因此小胶质细胞介导的炎症反应在中枢神经系统疾病的病情进程中的作用逐渐被人们所重视。所以针对神经炎症寻找能够抑制小胶质细胞激活、阻断神经毒性物质释放的药物为治疗中枢神经系统疾病提供了一个富有吸引力的药物研发方向(Klegeris A,McGeer EG,McGeer PL.Therapeutic approaches toinflammation in neurodegenerative disease.Curr Opin Neurol,2007,20:351–357)。
荜茇是中、蒙、藏医习惯用药，味辛、性热,临床用于治疗胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、肾寒、寒泻、呕吐等症状。荜茇中含有丰富的生物碱、酰胺类、木脂素类、萜类、甾醇类及其它类的化合物，其中生物碱和酰胺类约35种，尤其是胡椒碱的含量不少于2.5%。目前文献中还未见报道荜茇提取物及胡椒碱可以抑制神经炎症，并据此对中枢神经系统疾病治疗方面的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供荜茇或其提取物在制备抑制神经炎症的药物中的应用。并提供荜茇或其提取物在制备通过抑制神经炎症来治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
本发明还提供荜茇或其提取物在制备抑制小胶质细胞激活作用的药物中的应用。
本发明还提供荜茇或其提取物在制备减轻多巴胺神经元损伤的药物中的应用。
其中，荜茇提取物是以醇为提取液进行提取获得的提取物，荜茇提取物的制备方法，包括如下步骤：
1）取荜茇干燥果实，用重量是所述荜茇干燥果实的8-10倍的70-95%（是体积百分比）乙醇水溶液作为提取剂对所述荜茇干燥果实进行提取，得到提取液；
2）将步骤1）得到的提取液浓缩成相对密度为1-1.1的浓缩液；
3）将步骤2）得到的浓缩液用水稀释,离心，将离心后的上清液经过D101大孔吸附树脂柱吸附；
4）将步骤3）得到的吸附过所述上清液的D101大孔吸附树脂柱用5-15倍柱体积的10-20％乙醇水溶液（体积百分比）洗脱，
5）将步骤4）洗脱过的D101大孔吸附树脂柱用10-20倍柱体积的60-70%乙醇水溶液（体积百分比）洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，即得到荜茇提取物。
在步骤1）中，为了提取充分，荜茇干燥果实可以先粉碎，再提取，上述提取的次数可以为3次，所述提取剂是85%（体积百分比）的乙醇水溶液。
在步骤2）中，所述浓缩是在50-70℃下减压浓缩，优选是在60℃、真空度0.01Pa下浓缩；所述浓缩液的相对密度是1.08。
在步骤3）中，所述稀释是指将步骤2）的浓缩液加水稀释，浓缩液加水后的总重量与所述荜茇干燥果实质量的比例是1:1；所述离心是1000g-2000g下，离心10分钟。
在步骤4）中，所述5-15倍柱体积的10-20％乙醇水溶液洗脱优选是10倍柱体积的20％乙醇水溶液洗脱；
步骤5）中，10-20倍柱体积的60-70%乙醇水溶液洗脱优选是20倍柱体积的70％乙醇水溶液洗脱。
所述步骤5）得到第3至20个柱体积的洗脱液后，可进行干燥，干燥的步骤如下：将收集的洗脱液减压浓缩，然后真空冷冻干燥。
本发明还提供一种药物，其有效成分为上述荜茇提取物；所述药物为抑制神经炎症和/或抑制小胶质细胞激活作用和/或减轻多巴胺神经元损伤和/或治疗中枢神经系统疾病的药物。
上述抑制神经炎症和/或抑制小胶质细胞激活作用和/或减轻多巴胺神经元损伤和/或治疗中枢神经系统疾病的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明采用的细胞模型是小胶质细胞激活模型，是100ng/ml脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）对BV2细胞系形成的细胞模型。
实验证明：加入LPS（终浓度100ng/ml）和荜茇提取物（终浓度0.25mg/ml）共培养24h，荜茇提取物能够显著减轻LPS引起的BV2细胞激活，降低细胞内环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的蛋白水平,减少炎症因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的释放。
为进一步确定荜茇提取物抑制小胶质细胞活化的作用机制，通过对NF-κB信号通路的研究，荜茇提取物能够通过抑制LPS引起的IκB降解，从而减轻核转录因子NF-κB的p65亚基核转位水平，进而减少炎症相关基因的表达。
为进一步确定荜茇提取物通过抑制神经炎症来起到神经保护作用，又采用小鼠炎症动物模型。
上述小鼠炎症动物模型是通过对C57小鼠腹腔注射5mg/kg的LPS形成的动物模型。荜茇提取物治疗组是C57小鼠腹腔注射LPS后2h进行120mg/kg的荜茇提取物灌胃给药，之后7d持续给药、每日给药1次。
实验证明：通过观察对小胶质细胞标志物CD11b的免疫染色，发现荜茇提取物E能够减轻LPS引起的中脑黑质部位小胶质细胞的激活；通过对多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）的免疫染色及蛋白免疫印迹方法检测，荜茇提取物对抗LPS引起的免疫炎症损伤的神经保护药效与LPS模型组有显著性差异。
上述实验表明，荜茇提取物可以抑制神经炎症、抑制小胶质细胞的激活作用，保护多巴胺能神经元，从而可以通过抑制神经炎症来治疗中枢神经系统疾病。
附图说明
图1为实施例1制备的荜茇提取物的HPLC的图谱。
图2为不同药物处理BV2细胞系进行细胞形态学观察来检测荜茇提取物抑制小胶质细胞激活的药效。
图3为BV2细胞NADPH氧化酶p67及MHCⅡ类分子OX-6的表达情况。图示为不同药物处理BV2细胞24h，进行免疫荧光染色p67和OX-6。
图4为在BV2细胞系中药物处理24h后，COX-2的表达情况及PGE2释放水平。图示为不同药物处理BV2细胞24h，通过免疫荧光染色和Western blot方法检测COX-2蛋白水平的变化情况，收集细胞上清通过ELISA法检测PGE2释放水平。**代表与Control组相比，P<0.001；#代表与LPS模型组相比，P<0.05。
图5为在BV2细胞系中药物处理1h后，IκB及NF-κB亚基p65蛋白水平变化情况。图示为不同药物处理BV2细胞1h，通过免疫荧光染色检测IκB、p65蛋白水平的变化情况，通过荧光强度分析p65的核转位情况；通过Western blot方法检测IκB蛋白水平的变化情况。**代表与Control组相比，P<0.001；#代表与LPS模型组相比，P<0.05；##代表与LPS模型组相比，P<0.001。
图6为在小鼠炎症模型中7d进行中脑黑质部位小胶质细胞表面标志物CD11b免疫组化结果。
图7为在小鼠炎症模型中7d进行中脑黑质部位多巴胺能神经元标志物TH免疫组化结果，及中脑黑质纹状体部位TH蛋白含量的水平。**代表与Control组相比，P<0.001；##代表与LPS模型组相比，P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中使用的细胞系如下：
小胶质瘤细胞系BV2是小鼠源的小胶质瘤细胞系，购自中国协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心(3111C0001CCC000063)。
下述实施例中的试验方法如下：
1．蛋白免疫印迹Western blot
1.1蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)在Bio-Rad公司的灌胶模具上组装gel sandwich，把用75%酒精擦干净的两玻璃板和中间1.0mm厚的隔板的下缘处于同一直线上,组装严密以防漏胶；
(2)按下表1中SDS-PAGE分离胶配方，制成10%的分离胶；
表1.SDS-PAGE分离胶配方
| 试剂 | 10%分离胶 |
| H2O(ml) | 4 |
| 1.5M Tri s-HCl,pH 8.8(ml) | 2.5 |
| 30%（g/ml）polyacrylamide(ml) | 3.3 |
| 10%SDS(μl) | 100 |
| 10%APS(μl) | 100 |
| TEMED(μl) | 5.7 |
(3)立即将分离胶注入胶槽的两玻璃板之间，后注入去离子水，室温静置45-60min，使胶聚合；
(4)待分离胶聚合后，吸出上层无离子水，并用滤纸吸干残余水分；并再用无离子水洗凝胶顶部数次，以去除可能未完全聚合的丙烯酰胺，最后滤纸吸干残余水分；
(5)按下表2中SDS-PAGE浓缩胶配方，制成5%的浓缩胶；
表2.SDS-PAGE浓缩胶配方
| 试剂 | 5%的浓缩胶 |
| H2O(ml) | 2.7 |
| 1.0M Tris-HCl,pH 6.8(ml) | 0.5 |
| 30%（g/ml）polyacrylamide(ml) | 0.63 |
| 10%（g/ml）SDS(μl) | 40 |
| 10%（g/ml）APS(μl) | 40 |
| TEMED(μl) | 4 |
(6)立即在分离胶顶部灌入5%浓缩胶，插入齿梳，室温静置30-45min；
(7)浓缩胶聚集过程中，根据蛋白定量的结果，计算各组蛋白上样量；
(8)浓缩胶聚合后，把凝胶固定在电泳装置上，电泳槽中加入电泳缓冲液；
(9)小心取出齿梳，用加样器按预定顺序加待测样品及预染Marker，在空白的样品孔中加入等体积的凝胶加样缓冲液；
(10)进行电泳，电泳槽周围放冰，以80V电压用于浓缩胶电泳，以150V电压用于分离胶电泳，待溴酚蓝全部跑出底部后，立即结束电泳。
1.2蛋白质转膜
(1)提前半小时剪取两张与凝胶大小一致的PVDF膜，并在左上角做好标记，同时剪取6张Whatman滤纸，其面积大小略大于凝胶，将滤纸、PVDF预先在电转移缓冲液中浸泡；
(2)电泳结束后，小心拆下凝胶，置电转移缓冲液中平衡；
(3)铺上三层滤纸、PVDF膜，滤纸与PVDF膜要对齐，且要排除滤纸与PVDF膜之间的气泡；
(4)小心将凝胶平放于PVDF膜之上，凝胶开始加样侧与PVDF膜标记侧对应，排除胶与膜之间的气泡；
(5)把另外三层滤纸放上，确定无气泡后，将转膜夹层放入电转移槽中，凝胶侧在阴极；
(6)将电转移槽电源接通，正负极对应准确后打开电源开关，设定电流100mA，电转移1h；
(7)转膜结束后取出转膜夹子，观察PVDF膜和凝胶，若在膜上可见明显的预染标准蛋白印迹，而胶上预染蛋白标准已消失，说明转移效果良好。
1.3免疫反应与化学显色
(1)以0.01M PBS漂洗PVDF膜，10min，3次；
(2)将膜置于10%（g/ml）牛奶封闭液中，室温封闭1h，以封闭膜上非特异性结合位点，回收封闭液，以备重复使用；
(3)以杂交洗液TTBS漂洗3次，每次10min；
(4)加入适当一抗，按比例稀释于20ml TTBS液中（TH抗体，1∶10000；IκB抗体，1：1000；COX-2抗体，1：1000；actin抗体，1:5000），0.01%Thimerosal，4℃过夜；
(5)吸出一抗孵育液,以TTBS漂洗PVDF膜3次，每次10min；
(6)加入1∶15000稀释的ODYSSEY红外标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗体，室温下与杂交膜孵育2h；
(7)回收二抗液，以TBST漂洗PVDF膜2次，每次10min；
(8)以PBS漂洗PVDF膜10min，利用ODYSSEY机器扫描PVDF膜。
比较不同条带的密度：将各时间点的光密度值与正常对照组比较，得到相对百分数。
2.细胞免疫荧光染色
1)细胞在盖片上生长，药物处理结束后，从孵箱中取出
2)用预温的0.01M PBS洗3次，每次10分钟
3)4％（g/ml）的甲醛室温固定20－30分钟
4)0.01M PBS洗3次，每次10分钟
5)0.3％（g/ml）Triton X－100透化2－5分钟
6)0.01M PBS洗3次，每次10分钟
7)5%（g/ml）BSA室温封闭30分钟
8)加一抗（用1％（g/ml）BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9)0.01M PBS洗3次，每次10分钟
10)加二抗（用1％（g/ml）BSA稀释）60分钟，闭光
11)0.01M PBS洗3次，每次10分钟
12)95％甘油封片
3.PGE2释放量检测
PGE2（前列腺素E2）是一种由小胶质细胞释放的花生四烯酸衍生物，是花生四烯酸经环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）代谢的产物，为二十碳不饱和脂肪酸，是一种重要的炎性因子，已有很多研究证明PGE2在多种神经退行性疾病的发生发展中起着重要的作用。正常情况下COX-2并不表达,但是通过各种刺激信号诱导,包括内毒素、细胞因子和生长因子，都可以引起COX-2的表达上调。通过检测细胞培养上清中PGE2释放量，可判断小胶质细胞激活的程度，本实验所用PGE2释放量检测试剂盒购自R&D公司货号：Cat.No.KGE004B。）具体步骤见说明书。
4.免疫组化步骤：
1)动物经灌注固定，立即取材（脑或脊髓），放入含30%（g/ml）蔗糖的4%（g/ml）
多聚甲醛溶液内后固定4℃过夜
2)冰冻切片，40-60um，切片放入0.01M PBST液(pH7.2-7.5)内待染。
3)切片入0.01M PBST液中浸洗三次，5分钟
4)切片入1N盐酸，抗原修复30分钟，室温
5)切片入蒸馏水浸洗三次10分钟
6)切片入3%（g/ml）H2O2消除内源性过氧化物酶的活性10分钟
7)切片入蒸馏水浸洗三次10分钟
8)切片入0.01M PBST浸洗三次5分钟
9)切片入5%（g/ml）脱脂奶粉PBST液（或5%（g/ml）正常羊血清）封闭30分钟，室温（抑制非特异性背地）
10)倾去奶粉（或血清），切片不清洗，直入适当稀释的I抗(0.01M PBST稀释)孵育4度过夜
11)切片入0.01M PBST浸洗三次5分钟
12)切片入1:300生物素标记的Ⅱ抗(1%BSA-0.01M PBST稀释)2-3小时，室温
13)切片入0.01M PBST浸洗三次5分钟
14)切片入1:300辣根酶标记的链霉卵白素Ⅲ抗(0.01M PBST稀释)2-3小时室温
15)切片入0.01M PBST浸洗三次5分钟
16)切片入DAB显色，10-30分钟室温（体系为DAB 6mg，DW 9ml，0.1MPB 1ml，30%H2O2 10-20ul）
17)切片入流水充分浸洗
18)切片入0.01M PB液中裱片，自然干燥
19)切片上行脱水，透明，封固
如果切片进行免疫荧光染色，则去掉步骤6、7，从步骤12开始加入荧光Ⅱ抗室温孵育2小时，切片入0.01M PBST浸洗三次5分钟，甘油封片。
5.组织蛋白的提取
(1)小鼠不麻醉状态下断头后新鲜取材，于冰上快速地剥离出双侧纹状体，并将其放在液氮内冻存、备用；
(2)将上述冻存备用的大脑纹状体转移至eppendorf管中，按每mg组织10μl的比例加入细胞裂解液，手持式匀浆器匀浆；
(3)超声破碎两次，每次10s，使组织细胞溶解；
(4)4℃，12000g，离心两次，每次15min，取上清；
(5)蛋白定量，95℃，5min变性，-20℃保存
实施例1、荜茇提取物的获得
本实施例中荜茇干燥果实是生药，可购自药店。
取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用8～10倍药材重量的85%（体积百分比）乙醇溶液提取三次,每次1小时，过滤，合并滤液，于60℃下减压（真空度0.01Pa）回收乙醇至相对密度为1.08的浓缩液，浓缩液用水稀释，稀释后的质量与荜茇干燥果实的质量比例是1：1，然后在1500g下，离心10分钟。将离心后的上清液经过大孔吸附树脂柱（D101型）吸附，先用10倍柱体积的20％（体积百分比）乙醇洗脱；然后用20倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，得到洗脱液；将洗脱液减压浓缩，真空冷冻干燥，即得荜茇提取物。
其中提取物的HPLC的图谱如图1所示，HPLC色谱条件：色谱柱：Agilent EclipseXDB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：0.25%甲酸-甲醇（35：65）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：343nm；进样量：20μL；柱温：40℃。
实施例2、荜茇提取物的获得
本实施例中荜茇干燥果实是生药，可购自药店。
取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用8～10倍药材重量的70%（体积百分比）乙醇溶液提取三次,每次1小时，过滤，合并滤液，于50℃下减压（真空度0.01Pa）回收乙醇至相对密度为1.0的浓缩液，浓缩液用水稀释，稀释后的质量与荜茇干燥果实的质量比例是1：1，然后在1500g下，离心10分钟。将离心后的上清液经过大孔吸附树脂柱（D101型）吸附，先用10倍柱体积的20％（体积百分比）乙醇洗脱；然后用20倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，得到洗脱液；将洗脱液减压浓缩，真空冷冻干燥，即得荜茇提取物。
实施例3、荜茇提取物的获得
本实施例中荜茇干燥果实是生药，可购自药店。
取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用8～10倍药材重量的95%（体积百分比）乙醇溶液提取三次,每次1小时，过滤，合并滤液，于70℃下减压（真空度0.01Pa）回收乙醇至相对密度为1.1的浓缩液，浓缩液用水稀释，稀释后的质量与荜茇干燥果实的质量比例是1：1，然后在1500g下，离心10分钟。将离心后的上清液经过大孔吸附树脂柱（D101型）吸附，先用10倍柱体积的20％（体积百分比）乙醇洗脱；然后用20倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，得到洗脱液；将洗脱液减压浓缩，真空冷冻干燥，即得荜茇提取物。
实施例4、对荜茇提取物抑制小胶质细胞激活作用的检测
在正常健康脑中，小胶质细胞胞体较小，有多个细长突起呈高度分枝状，此时表现为静息状态；当脑组织出现感染、外伤、缺血或毒性物质的侵害时，小胶质细胞迅速被激活，体积增大、胞体变圆，突起变的粗短，表现为阿米巴样，并开始大量表达一些与抗原识别、提呈有关的特异性膜表面分子，如主要组织相容性复合物Ⅱ（MajorHistocompatibility Complex Ⅱ，MHC Ⅱ）（Michelle L.Block,Jau-ShyongHong.Microglia and inflammation-mediated neurodegeneration:Multiple triggerswith a common mechanism.Progress in Neurobiology,2005,76:77–98.）。此外在小胶质细胞被激活的初始阶段中，它会产生大量的活性氧自由基（Reactive OxygenSpecies，ROS）。NADPH氧化酶是一种过氧化物酶，是活化的小胶质细胞中产生ROS的主要来源,其催化产生的ROS在破坏入侵微生物的结构和信息传递方面有重要作用。然而持续大量产生的氧自由基会破坏发生炎症反应周围的组织，因而在正常情况下NADPH氧化酶的活性是受严格控制的。NADPH氧化酶是一个多聚体跨膜蛋白质,由六种亚基组成,即p47phox、p67phox、p40phox、Rac(小分子单体G蛋白，又称Rac样GTP酶)、p22phox和gp9lphox（后两者又称黄素细胞色素b558）,b558在细胞膜上，其他亚基位于胞浆中。当小胶质细胞接受外界信号刺激，其胞内信号瀑布效应引发NADPH氧化酶活性形式的组装。在NADPH氧化酶激活时有两个重要的基本过程,一是NADPH氧化酶成分的磷酸化,二是NADPH氧化酶胞浆成分转位到膜上。在小胶质细胞处于静息状态时,p47phox、p67phox、p40phox、Rac位于细胞浆中,前三者以复合物形式存在,在受到外界刺激后,经过一系列信号转导途径,细胞浆内的亚基p47phox、p67phox磷酸化,Rac的GDP与GTP交换,然后三者与p40phox一起转位到细胞膜上,与膜上p22phox和gp9lphox结合形成具有活性的NADPH氧化酶，以NADPH氧化酶作为电子供体,将分子氧催化为02 -,进而产生一系列ROS,造成细胞损伤（Cyril Che′ret,Annie Gervai s,Aure′lia Lelli，etal.Neurotoxic Activation of Microglia Is Promoted by a Nox1-Dependent NADPHOxidase.J Neurosci，2008,28(46):12039–12051）。ROS可以直接引起神经元的损伤，部分还可以与NO反应，生成毒性更强的过氧化亚硝酸盐。此外，NADPH氧化酶生成的ROS在细胞内还可以作为第二信使来调节其他炎性分子和神经毒性分子的产生，如NO、TNF-α、PGE2和IL-1β等（Qin L,Liu Y,Wang T,et al.NADPH oxidasemediates lipopolysaccharide-induced neurotoxicity and proinflammatory geneexpression in activated microglia.J Biol Chem,2004,279(2):1415-1421.）。
1、采用细胞形态学观察BV2细胞系，细胞免疫荧光染色方法检测小胶质细胞NADPH氧化酶p67及小胶质细胞活化标记物OX-6(MHC Ⅱ类分子)的表达情况。
荜茇提取物抑制小胶质细胞激活作用的确定，采用的细胞株是BV2，采用的细胞模型是小胶质细胞激活模型，是脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）对BV2细胞系形成的细胞模型。采用的细胞培养液是DMEM+10%胎牛血清（DMEM培养基可购自Gibco公司，货号C11995；另外10%胎牛血清是指终浓度为10%，是体积百分数）（所有实验中用的细胞培养液均与这里的培养液相同）。
A．药物处理分组：空白对照组（药物溶剂即无血清DMEM培养基）、PLLE对照组（0.25mg/ml）：添加0.25mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物、LPS低剂量模型组（100ng/ml）：添加100ng/ml脂多糖、LPS高剂量模型组（1000ng/ml）：添加1000ng/ml脂多糖、高剂量治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.25mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.25mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物、低剂量治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.05mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.05mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物。上述各组的溶剂均为无血清DMEM培养基。
B.接种好的24孔板BV2细胞，除去培养液，分别按照上述药物处理分组加入相应浓度的药物500μl，孵育24小时。
C.显微镜普光拍照，观察小胶质细胞形态学变化。
D．细胞免疫荧光染色，检测NADPH氧化酶p67亚基及MHC Ⅱ类分子OX-6的表达，其中一抗为p67（Millipore，07-502）和OX-6(Abcam,ab23990)，二抗为Alexa594goat anti-mouse IgG（A11020）和Alexa
488goat anti-rabbit IgG（A11034）。
2、实验结果
形态学变化结果表明，经不同浓度LPS处理BV2细胞24h，都能引起小胶质细胞形态变圆变大，标志着小胶质细胞激活，但100ng/ml剂量组激活现象较轻，所以利用100ng/ml的LPS进行造模；在荜茇提取物的药物作用下，高低剂量组都能够改善BV2细胞的形态学变化，说明实施例1、2或3制备的荜茇提取物能够减轻LPS引起的小胶质细胞激活。部分结果如图2所示，图2中，control为空白对照组，PLLE为PLLE对照组，LPS 1000ng/ml为LPS高剂量模型组，LPS 100ng/ml为LPS低剂量模型组，LPS+PLLE 0.25mg/ml为高剂量治疗组，LPS+PLLE 0.05mg/ml为低剂量治疗组。图2中右上角方框所示为放大图像。
免疫荧光染色结果表明，LPS处理BV2细胞24h引起胞浆中NADPH氧化酶p67亚基向细胞膜的募集，组装成有活性的酶产生ROS，并且能够使MHC Ⅱ类分子OX-6的表达上调，标志着小胶质细胞的激活；在荜茇提取物的药物作用下，能够减轻OX-6的表达及p67亚基向细胞膜的募集，说明实施例1、2或3制备的荜茇提取物能够减轻小胶质细胞的激活。部分结果如图3所示，图3中，control表示空白对照组、LPS表示100ng/ml模型组，LPS+PLLE表示LPS（100ng/ml）与PLLE（0.25mg/ml）同时给药治疗组，p67PHOX表示p67荧光染色结果，OX-6表示OX-6荧光染色结果，Phase表示明视野观察细胞形态结果，Merge表示合并图像结果。图3中虚线方框表示的是目标细胞放大结果。
实施例5、对荜茇提取物抑制小胶质细胞激活作用靶点的检测
小胶质细胞激活后会分泌许多有害的炎性介质来损伤多巴胺能神经元，PGE2便是其中重要的一个炎性介质，它是由环氧合酶-2（COX-2）将花生四烯酸转化合成的。研究发现在帕金森病患者中脑黒质部位伴随有COX-2的表达增加和PGE2的水平升高，说明COX-2和PGE2在多巴胺能神经元退变的病理过程中发挥着重要作用（Teismann P,Tieu K,Choi DK,Wu DC,Naini A,Hunot S,Vila M,Jackson-Lewis V,PrzedborskiS..Cyclooxygenase-2is instrumental in Parkinson’s diseaseneurodegeneration.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:5473–5478.）。
此外，研究发现COX-2基因敲除鼠能够抵抗LPS诱导的多巴胺能神经元死亡作用（Litteljohn D,Mangano EN,Hayley S.Cyclooxygenase-2 deficiency modifiesthe neurochemical effects,motor impairment and co-morbid anxiety provokedby paraquat administration in mice.Eur J Neurosci,2008,28(4):707-716.）。因此，小胶质细胞活化而导致的COX-2表达上调，炎症介质PGE2生成的增多，这一过程在多巴胺能神经元的退行性病变中起着重要的作用。
1、采用免疫荧光染色方法检测小胶质细胞中COX-2的表达情况。
A．药物处理分组：空白对照组（药物溶剂即无血清DMEM培养基）、LPS模型组（100ng/ml）：添加100ng/ml脂多糖、高剂量治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.25mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.25mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物、低剂量治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.05mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.05mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物。上述各组的溶剂均为无血清DMEM培养基。
B.接种好的24孔板BV2细胞，除去培养液，分别按照上述药物处理分组加入相应浓度的药物，孵育24小时
C.细胞免疫荧光染色，检测COX-2，其中一抗为COX-2（SantaCruz，sc-1747），二抗为Alexa
647donkey anti-goat IgG（A21447）。
2、采用Western blot法检测小胶质细胞COX-2的蛋白含量变化。
A．药物处理分组：空白对照组（药物溶剂即无血清DMEM培养基）、LPS模型组（100ng/ml）：添加100ng/ml脂多糖、治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.25mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.25mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物
B.接种好的培养瓶BV2细胞，除去培养液，分别按照上述药物处理分组加入相应浓度的药物，孵育24小时。
C.药物处理结束后，收集细胞提取蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，进行Westernblot检测小胶质细胞COX-2的蛋白含量变化。其中一抗为COX-2（SantaCruz，sc-1747），二抗为Donkey anti-goat IRDye 680CW（Odyssey，926-32224）。
3、采用ELISA法检测小胶质细胞PGE2释放水平。
A．药物处理分组：空白对照组（药物溶剂即无血清DMEM培养基）、PLLE对照组（0.25mg/ml）：添加0.25mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物、LPS低剂量模型组（100ng/ml）：添加100ng/ml脂多糖、LPS高剂量模型组（1000ng/ml）：添加1000ng/ml脂多糖、高剂量治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.25mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.25mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物、低剂量治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.05mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.05mg/ml实施例1、2或3制备的荜茇提取物。上述各组的溶剂均为无血清DMEM培养基。
B.接种好的96孔板BV2细胞，除去培养液，分别按照上述药物处理分组加入上述相应浓度的药物，孵育24小时。
C.药物处理结束后，收集细胞上清，进行ELISA检测PGE2释放水平。PGE2释放量检测试剂盒购自R&D公司货号：Cat.No.KGE004B。）具体步骤见说明书。
4、实验结果
通过免疫细胞化学方法对BV2细胞的COX-2进行染色（图4中A），通过westernblot方法进一步验证COX-2蛋白水平（图4中B），发现经LPS处理24h的BV2细胞COX-2蛋白水平表达上调，并且在实施例1、2或3制备的荜茇提取物的药物作用下能够减轻LPS引起的COX-2蛋白水平的上调；此外，通过ELISA方法检测PGE2的释放水平（图4中C），LPS处理24h的BV2细胞对PGE2释放水平显著上调，发现在实施例1、2或3制备的荜茇提取物的药物作用下能够显著减少LPS引起的PGE2释放。部分结果如图4所示，图4中A为免疫荧光染色方法检测小胶质细胞COX-2的表达情况的结果，图4中B为采用Western blot法检测小胶质细胞COX-2的蛋白含量变化的结果，图4中C为采用ELISA法检测小胶质细胞PGE2释放水平的结果；图4中，control为空白对照组，PLLE为PLLE对照组，LPS 1000ng/ml为LPS高剂量模型组，LPS 100ng/ml为LPS低剂量模型组，LPS+PLLE 0.25mg/ml为高剂量治疗组，LPS+PLLE 0.05mg/ml为低剂量治疗组。图4中方框中标注的是目标细胞的放大结果。
本实施例的结果表明，本发明的荜茇提取物可以显著减少LPS引起的PGE2释放，减轻LPS引起的COX-2蛋白水平的上调，实施例1、2或3制备的荜茇提取物能够减轻小胶质细胞的激活，从而可以保护神经元，使其受损减缓，达到治疗中枢神经系统疾病的作用。
实施例6、对荜茇提取物抑制小胶质细胞激活作用信号通路的检测
在小胶质细胞中，NF-κB是一种调控炎症基因表达的重要转录因子，其家族包括5个亚单位：Rel(cRel)、p65(RelA)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。NF-κB是以两个亚基形成的同源或异源二聚体与靶基因上特定的序列（-κB位点）结合调节基因转录的，最常见的NF-κB二聚体是p65与p50组成的异二聚体。静息状态下，NF-κB蛋白定位在细胞浆中，与NF-κB的抑制性蛋白(inhibitor kappa B,IκB)结合而呈非活性状态。当小胶质细胞受到信号刺激后，IκB激酶复合体（IκB kinase,IKK）活化将IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位点，游离的NF-κB迅速移位到细胞核，与特异性κB序列结合，诱导相关基因转录（Schulze-Luehrmann,J.,and Ghosh,S.Antigen-receptor signaling to nuclear factor kappa B.Immunity，2006，25,701-715.），其表达产物主要参与免疫应答和炎症反应，最终导致细胞损害。
1、采用免疫荧光染色方法检测小胶质细胞胞浆中IκB降解情况，及NF-κB的p65亚基的核转位情况。
A．药物处理分组：空白对照组（药物溶剂即无血清DMEM培养基）、PLLE对照组（0.25mg/ml）：添加0.25mg/ml实施例1制备的荜茇提取物、LPS模型组（100ng/ml）：添加100ng/ml脂多糖、治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.25mg/ml）：添加100ng/ml脂多糖和0.25mg/ml实施例1制备的荜茇提取物、阳性药物对照组LPS(100ng/ml)+Bay11-7082（5μM）：添加100ng/ml脂多糖和5μM Bay11-7082（NF-κB抑制剂，Sigma，B5556）。Bay11-7082是一种常用的NF-κB抑制剂，可以抑制一些细胞因子诱导的IκBα的磷酸化，从而抑制IκBα降解和随后的NF-κB核转运，最终抑制依赖于NF-κB的基因转录。上述各组的溶剂均为无血清DMEM培养基。
B.接种好的24孔板BV2细胞，除去培养液，按照上述药物处理分组加入相应浓度的药物，孵育60min
C.细胞免疫荧光染色，检测IκB和p65，其中一抗为p65（CST，4764S）和IκB（CST，4814），二抗为Alexa
488goat anti-mouse IgG（A11029）和Alexa
594goat anti-rabbit IgG（A11037）。
D.利用Image J图像分析软件，通过测量p65在细胞核中的荧光强度分析p65的核转位情况
2、采用Western blot法检测小胶质细胞中IκB蛋白含量变化
A．药物处理分组：空白对照组、PLLE对照组（0.25mg/ml）、LPS模型组（100ng/ml）、治疗组LPS(100ng/ml)+PLLE（0.25mg/ml）、阳性药物对照组LPS(100ng/ml)+Bay11-7082（NF-κB抑制剂，Sigma，B5556）（5μM）各组处理同步骤1。Bay11-7082是一种常用的NF-κB抑制剂，可以抑制一些细胞因子诱导的IκBα的磷酸化，从而抑制IκBα降解和随后的NF-κB核转运，最终抑制依赖于NF-κB的基因转录。
B.接种好的培养瓶BV2细胞，除去培养液，分别按照上述药物处理分组加入上述相应浓度的药物，分别孵育30min、60min。
C.药物处理结束后，收集细胞提取蛋白，检测蛋白浓度，进行Western blot检测小胶质细胞中IκB蛋白含量变化。其中一抗为IκB（CST，4814），二抗为Goatanti-mouse IRDye 680CW（Odyssey，926-32210）。
3、实验结果
结果如图5所示，通过免疫细胞化学方法对BV2细胞的IκB和NF-κB的p65亚基进行染色（图5中A），及western blot方法进一步验证IκB蛋白水平（图5中C），BV2细胞经LPS处理30min、60min，都会引起胞浆中IκB的降解，从而引起p65向细胞核转位，导致下游炎症相关基因的表达上调；在实施例1制备的荜茇提取物的药物作用下能够减少LPS引起的小胶质细胞胞浆中IκB的降解和p65的核转位。图5中A为通过免疫细胞化学方法对BV2细胞的IκB和NF-κB的p65亚基进行染色的结果，图5中B为NF-κB的p65亚基的核转位情况的结果，图5中C为采用Western blot法检测BV2细胞经LPS处理30min、60min IκB蛋白含量变化；图5中，control为空白对照组，PLLE为PLLE对照组，LPS为LPS低剂量模型组，LPS+PLLE为治疗组，LPS+Bay11-7082为阳性药物对照组。IκB表示IκB蛋白，p65表示p65亚基，merge表示图像合并结果。
实施例7、在动物模型中验证荜茇提取物抑制神经炎症的作用
1、采用免疫荧光组化方法检测小鼠炎症模型中脑黒质部位小胶质细胞激活情况。
A．通过对C57小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）腹腔注射5mg/kg的LPS制作神经炎症小鼠模型，记为LPS模型组。荜茇提取物治疗组是C57小鼠腹腔注射5mg/kg的LPS后2h进行120mg/kg的荜茇提取物（分别为实施例1、2或3制备的荜茇提取物）灌胃给药，之后7d持续给药、每日给药1次。对照组采用腹腔注射溶剂PBS作为对照。
B．动物经给药后7天进行灌注取脑，采用冰冻切片法进行免疫组化，对小胶质细胞的标志物CD11b进行荧光染色，观察小胶质细胞的细胞形态变化。
2、采用免疫组化方法检测小鼠炎症模型中脑黒质部位多巴胺能神经元损伤情况。
动物经给药后7天进行灌注取脑，采用冰冻切片进行免疫组化，对多巴胺能神经元标志性蛋白TH进行DAB染色，其中I抗TH（Sigma，T2928），浓缩型鼠SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SPN-9002），观察TH阳性神经元的细胞形态及数量。
3、采用Western blot法检测小鼠炎症模型中脑纹状体部位多巴胺能神经元TH蛋白水平的变化。
造模7天后新鲜取材，剥离双侧纹状体进行组织蛋白提取，再进行Western blot检测多巴胺能神经元TH蛋白的相对含量。其中I抗TH（Sigma，T2928），浓缩型鼠SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SPN-9002）。
3、实验结果
结果如图6所示，LPS模型组的中脑黑质部位的小胶质细胞呈现出大而圆的细胞形态，标志着小胶质细胞被激活，Control对照组中小胶质细胞呈现分枝状，标志着小胶质细胞处于静息态；在实施例1、2或3制备的荜茇提取物的药物治疗作用下，LPS所诱导的小胶质细胞活化得到显著地缓解。图6中，LPS为LPS模型组，Control为对照组，LPS++PLLE为实施例1制备的荜茇提取物的药物治疗组。
结果如图7所示，LPS模型组的中脑黑质部位TH阳性神经元出现明显减少（图7中A），并且出现轴突断裂、突触片段化，此外还发现胞浆浓缩现象、胞体变小呈球状，表明在LPS模型组小鼠中脑黒质部位多巴胺能神经元发生细胞损伤；在实施例1、2或3制备的荜茇提取物的治疗作用下，均可以看到多巴胺能神经元明显的突触形态，并且胞体大而完整，表明多巴胺能神经元状态良好，LPS所引起的多巴胺能神经元损伤得到显著的缓解。通过Western blot检测多巴胺能神经元TH蛋白的相对含量结果（图7中B），LPS模型组的纹状体TH蛋白水平显著降低，说明LPS能够引起小鼠纹状体部位多巴胺能神经元的细胞损伤，在PLLE的治疗作用下能够显著减轻LPS引起的多巴胺能神经元损伤。图7中，A为采用免疫组化方法检测小鼠炎症模型中脑黒质部位多巴胺能神经元损伤情况结果；B为采用Western blot法检测小鼠炎症模型中脑纹状体部位多巴胺能神经元TH蛋白水平的变化的结果；图7中，LPS为LPS模型组，Control为对照组，LPS++PLLE为实施例1制备的荜茇提取物的药物治疗组。
Claims (10)
1.荜茇或其提取物在制备抑制神经炎症的药物中的应用。
2.荜茇或其提取物在制备抑制小胶质细胞激活作用的药物中的应用。
3.荜茇或其提取物在制备减轻多巴胺神经元损伤的药物中的应用。
4.荜茇或其提取物在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求1-4中所述的应用，其特征在于：所述荜茇提取物是以醇为提取液进行提取获得的提取物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述荜茇提取物的制备方法，包括如下步骤：
1）取荜茇干燥果实，用重量是所述荜茇干燥果实的8-10倍的体积百分比是70-95%的乙醇水溶液作为提取剂对所述荜茇干燥果实进行提取，得到提取液；
2）将步骤1）得到的提取液浓缩成相对密度为1-1.1的浓缩液；
3）将步骤2）得到的浓缩液用水稀释,离心，将离心后的上清液经过D101大孔吸附树脂柱吸附；
4）将步骤3）得到的吸附过所述上清液的D101大孔吸附树脂柱用5-15倍柱体积的体积百分比是10-20％的乙醇水溶液洗脱，将洗脱过的D101大孔吸附树脂柱用10-20倍柱体积的体积百分比是60-70%的乙醇水溶液洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，即得到来自荜茇的提取物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述荜茇提取物的制备方法中：
步骤1）中，所述提取的次数为3次，所述提取剂是体积百分比是85%的乙醇水溶液；
步骤2）中，所述浓缩是在50-70℃下减压浓缩，优选是在60℃、真空度0.01Pa下浓缩；所述浓缩液的相对密度是1.08。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述荜茇提取物的制备方法中：步骤3）中，所述稀释是指将步骤2）的浓缩液加水稀释，浓缩液加水后的总重量与所述荜茇干燥果实质量的比例是1:1；所述离心是在1000g-2000g下，离心10分钟。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述荜茇提取物的制备方法中：步骤4）中，所述5-15倍柱体积的10-20％乙醇水溶液洗脱优选是10倍柱体积的20％乙醇水溶液洗脱；步骤5）中，10-20倍柱体积的60-70%乙醇水溶液洗脱优选是20倍柱体积的70％乙醇水溶液洗脱。
10.一种药物，其有效成分为权利要求5-9中任意一项所述的荜茇提取物；所述药物为抑制神经炎症和/或抑制小胶质细胞激活作用和/或减轻多巴胺神经元损伤和/或治疗中枢神经系统疾病的药物。
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| 裴印权: "荜茇的中枢神经抑制作用", 《生理科学》, no. 10, 31 December 1982 (1982-12-31) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107969665A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-01 | 大连民族大学 | 一种树莓味多组分果冻粉的制备方法 |
| CN108142894A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-06-12 | 大连民族大学 | 一种绿色保健六道木果冻粉 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102908401B (zh) | 2016-04-13 |
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