CN102895192A - 一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制药技术领域的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)制备微球的方法，该方法将药物水溶液加到聚合物有机溶液中进行乳化，然后选择纳米颗粒混悬液做表面活性剂球，最后在另一大水相中硬化，除去有机溶剂并收集微球。所制得的微球包括药物、纳米颗粒、聚合物和药用辅料，它们的重量百分比含量分别为：药物0.01-40％，纳米颗粒0.01-96％，聚合物99.98-3.65％，药用辅料为0-30％。本发明避免了用常规W/O，W/O/W，和S/O/O方法制备的微球引起的组织相容性问题，而且本发明方法制备的表面组装有纳米颗粒的微球具有增强细胞黏附的作用，可减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化，可以运用到各种药物缓释或控释微球的制备及疾病的治疗中。

Description

一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法

技术领域

本发明涉及制药技术领域的微球及其制备方法，尤其涉及一种纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)制备微球的方法及其制品。

背景技术

制药行业从药物发现，到临床的应用，最后一个环节是药物制剂。其中有一部分药物需要长期给药才能治愈；还有一部分需要靶向等局部给药。要达到这些目的，原料药必须要制备成相应的剂型。例如需要长期给药但在体内的半衰期短的药物，宜制备成缓释长效剂型；对于一些肿瘤的治疗，需要一些药物靶向于病照，例如靶向于肿瘤血管的栓塞微球制剂等。

关于微球制剂的制备方法，Meng Shi等[Journal of Controlled Release，89(2003)，167-177]报道了利用W/O/W方法把牛血清白蛋白(BSA)和环孢霉素A(CyA)包封在PLGA/PLA壳-核微球里，该方法利用最常见的W/O/W复乳法来制备双层微球，而该复乳法的油水界面是公认的蛋白杀手，容易导致水溶性的蛋白在该界面的聚集，同样致使包封率不高，存在不完全释放和突释等缺陷。Morita T.等[Journal of Controlled Release，69(2000)，435-444]用聚乙二醇PEG作为蛋白微粉化的赋形剂(即表面活性剂)，然后用水包油-油包固体的方法把蛋白微囊包在生物可降解的微球里，该文献虽然利用新的S/O/W乳化法制备载蛋白微球，但只是改变了表面活性剂，将以前报道较多的聚乙烯醇PVA改为聚乙二醇PEG。但这种改变仍不能克服包封率低，及疏水性表面所引起的局部微囊化及炎症的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法及其制品，以解决现有技术中微球制剂包封率低、疏水性表面会引起局部微囊化及炎症的缺点。

本发明的技术方案如下：

一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，包括如下步骤：

(1)将药物或药物和药用辅料制备成药物水溶液，所述药物在药物水溶液中的重量百分比为0.1％-90％；较优的为10％-50％，所述药用辅料在药物水溶液中的重量百分比为0％-20％，较优的为5％-15％；

(2)将步骤(1)制备的药物水溶液按照重量比为1∶1-10分散在浓度为0.5％-80％(w/w)的聚合物有机溶液中形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；较优的，聚合物有机溶液的浓度为5％-30％(w/w)，分散方式可选择乳化、涡旋或超声等，分散时间较佳为1-5分钟；

(3)将步骤(2)形成的油包水(W/O)乳液加入到重量百分比浓度为1％-80％的纳米颗粒混悬液中或含1％-80％(w/w)纳米颗粒和0.5％-5％(w/w)表面活性剂的混悬液中乳化，形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；其中纳米颗粒浓度以20％-70％(w/w)为佳；加入方式可为滴加、一次性加入、喷雾方式加入或倒入等；乳化方式可选择乳化、涡旋或超声等，乳化时间为0.1-5分钟；

(4)将所述纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳转移到浓度为1％-10％(w/w)无机盐溶液固化1-4h；该无机盐可选自氯化钠、氯化钾、硝酸钾或碳酸钠等，转移方式可为滴加、一次性加入、喷雾方式加入或倒入等；

(5)将步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并洗涤所得微球，之后冻干，得到表面自组装有纳米颗粒的微球，通常洗涤时可采用水、乙醇或乙醇和水的混和液进行洗涤3-5次。

较佳地，所述药物包括小分子药物和大分子药物。

较佳地，所述小分子药物为化学药物，可选自肿瘤化疗类药物或抗生素类药物，其中肿瘤化疗类药物选自阿霉素、环磷酰胺、更生霉素、博莱霉素、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀、顺铂、依托泊苷、喜树碱及其衍生物、苯芥胆甾醇、紫杉醇及其衍生物、多西紫杉醇及其衍生物、长春碱、长春新碱、它莫西芬、依托泊苷、哌泊舒凡、环磷酰胺或氟他胺及其衍生物，缓释微球可载有上述药物中的一种；抗生素类药物选自环孢素、左氧氟沙星、氧氟沙星、或盐酸依匹斯汀，缓释微球可载有上述药物中的一种；

所述大分子药物为生物大分子药物；

所述药用辅料为注射用药用辅料，尤其是

小糖类(如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖或乳糖等)、多羟基类化合物(如甘露醇、山梨醇、甘油、1，2-丙二醇、赤鲜糖醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮等)、多糖类化合物(如葡聚糖、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、纤维素或环糊精物质等)、氨基酸化合物(如甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或组氨酸等)、或无机盐类物质(如锌盐、钙盐、铜盐、镁盐或钼盐等)的一种或任意组合。

较佳地，所述生物大分子药物选自蛋白大分子药物、疫苗、抗体、核酸、或脂质体药物中的一种或几种，其中

所述蛋白大分子药物选自生长素、促红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、疫苗、干扰素(IFN)、生长激素(GH)、胰岛素(Insulin)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板生长因子(PDGF)、内皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形成蛋白(BMP)、组织多肽抗原(TPA)、抗体(antibody)、凝血因子VIII(VIII)或凝血因子IX遗传因子等的一种或几种；

所述的核酸选自反义核苷酸(anti-RNA)、小分子RNA(RNAi)或基因(DNA)等的一种或几种。

较佳地，所述步骤(2)中，所述聚合物有机溶液中，聚合物选自聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇(PLGA-PEG)和聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)中的一种或几种，有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、庚烷、氯仿、或丙酮中的一种或几种，其中以二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈中一种或几种组合的有机溶液为佳。

较佳地，所述聚合物有机溶剂中还添加有0.1％-20％(w/w)聚乙二醇(PEG)或泊洛沙姆(poloxmer)。

较佳地，所述步骤(3)中，所述纳米颗粒混悬液选自有机纳米颗粒水混悬液、无机纳米颗粒水混悬液或上述两者的混合液；其中有机纳米颗粒例如聚苯乙烯纳米颗粒、交联葡聚糖纳米颗粒等，无机纳米颗粒例如二氧化硅纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、四氧化三铁纳米颗粒、三氧化二铁颗粒、金纳米颗粒、三氧化二铝纳米颗粒、碳酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、碳酸镁纳米颗粒、氢氧化镁纳米颗粒量子点、银纳米颗粒等，可选择有机纳米颗粒或无机纳米颗粒的一种或多种。

较佳地，所述的步骤(3)中，所述表面活性剂选自聚乙烯醇PVA、聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮PVP、泊洛沙姆poloxmer、聚三梨醇、乙基纤维素EC、或吐温的一种或几种。

一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备的微球，所述微球的粒径为1-500μm，较佳地为10-100μm，其表面组装有一层纳米颗粒；其中所述微球中，

药物的重量百分比为0.01％-40％，纳米颗粒的重量百分比为0.01％-96％，聚合物的重量百分比为99.98-3.65％，药用辅料的重量百分比为0-30％。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一，本发明选择了合适的聚合物材料和制备微球的方法，制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，并且这种表面自组装有一层纳米颗粒的微球具有增强细胞黏附的作用，以及减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用，从而避免了用常规的W/O和W/O/W方法导致的包封率不高，及S/O/O等方法制备的微球，由于表面疏水，容易导致体内组织微囊化及炎症等副作用；

第二，采用本发明方法制备微球，其粒径的大小可以根据不同需要进行控制，且不污染环境；

第三，这种方法制备的微球，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放，同时可以使药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活；

第四，采用本发明方法制成的微球制剂，其微粒表面光滑圆整，颗粒规整无粘连，粒径可以根据需要从1μm到500μm进行调控，其冻干粉剂为白色细腻、疏松粉体，不会塌陷、不粘连，再分散性良好，可以运用到各种药物缓释或控释微球的制备及疫苗的佐剂制备中。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为本发明实施例一的例1所得微球的SEM照片；

图2为本发明实施例一的例1所得微球的体外释放曲线；

图3为本发明实施例一的例1所得微球的抗菌作用效果曲线；

图4为本发明实施例一的例1所得微球的抗癌作用效果曲线；

图5为本发明实施例一的例1所得微球与W/O/W方法制备微球的体内组织相容性SEM照片；

图6为本发明实施例二的例1所得微球的SEM照片；

图7为本发明实施例二的例1所得微球的体外释放曲线；

图8为本发明实施例二的例1所得微球的药效作用曲线；

图9为本发明实施例二的例1所得微球与W/O/W方法制备微球的体内组织相容性曲线；

图10为本发明实施例三的例1所得微球的体外释放曲线；

图11为本发明实施例三的例1所得微球的药效作用曲线；

图12为本发明实施例四的例1所得微球的药效作用曲线；

图13为本发明实施例五的例1所得微球的药效作用曲线；

图14为本发明实施例七所得微球的药效作用曲线；

图15为本发明实施例八所得微球的药效作用曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例一以阿霉素为例的小分子药物微球

例1：具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)取20mg阿霉素溶解到0.5ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PLGA的二氯甲烷溶液按照重量比1∶9混合并超声5分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到50ml重量百分比浓度为10％的银纳米颗粒混悬液中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.35％，纳米颗粒的重量百分比为96％，聚合物的重量百分比为3.65％，药用辅料的重量百分比为0％。

对本例制备的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸微球进行形貌表征、释放曲线测试、抗菌测试、抗癌测试及在体内组织相容性测试，并将其抗菌性、抗癌性及相容性与W/O/W的方法制备的微球进行对比，其中抗癌作用的测试条件为：一次给药，总剂量与对照组水溶液组每天一次的共15天的总剂量相同。相容性测试中，以微球注射部位出现纤维化的时间为标准计算时间。

图1-图5分别依次列出了本例中载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸微球的扫描电镜图、体外释放曲线、抗菌作用曲线、抗癌作用曲线和相容性SEM图像。其中图1中，A为微球的扫描电镜图，B为微球的表面放大图，可以看出，本例所制备的微球形态好，其表面自组装有一层银纳米颗粒，粒径在10-500nm；从图2中可以看出，本例所制备的微球几乎达到100％的药物释放率，突释非常小，几乎没有不完全释放，基本可以达到零级释放，其体外释放性能符合要求。微球中阿霉素相对于其原始投加量的包封率为92.0％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)。从附图3可以看出，本例所制备的微球的抗菌效果比对照组好；从附图4可以看出，本例所制备的微球的抗癌作用效果比对照组好，约为100％，而对照组仅为80％。附图5中可看到，W/O/W方法制备的微球(图5A)在治疗后的3-6个月出现纤维化组织；而本例纳米颗粒混悬液的制备微球(图5B)在治疗一年后也没有纤维组织的出现(即注射部位的微囊化不出现，从而克服了微囊化的产生)。

以本实施例方法制备的小分子药物微球可以用于需要长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤的血管栓塞微球等。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，且这种表面具有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

例2：具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备

本例与例1的不同之处在于，

步骤(2)中，PLGA的二氯甲烷溶液浓度为0.5％；

步骤(3)中，将步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到含有10％的银纳米颗粒和1％(w/w)的PVA表面活性剂的混悬液中。

实施例二以生长素为例的大分子药物微球

例1：具有细胞黏附作用和促进生长或延缓衰老作用的载有生长素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括以下步骤：

(1)10mg生长素和10mg葡聚糖溶解到0.4ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PLGA二氯甲烷溶液按照重量比为1∶9混合并超声1分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到40ml重量百分比浓度为10％的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液中并超声0.1分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的氯化钠溶液固化3小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤5次，冻干后得到具有细胞黏附作用和促进生长或延缓衰老作用的载有生长素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.17％，纳米颗粒的重量百分比为84.45％，聚合物的重量百分比为15.17％，药用辅料的重量百分比为0.21％。

对本例制备的具有细胞黏附作用和促进生长或延缓衰老作用的载有生长素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球进行形貌表征、释放曲线测试、药效测试以及在体内组织相容性测试，并将其药效、相容性与W/O/W方法制备的微球进行对比，其中，药效测试条件为：一次给药，总剂量与对照组水溶液组每天一次的共15天的总剂量相同。图6-图9分别依次列出了本例中微球的扫描电镜图、体外释放曲线、药效作用曲线和组织相容性SEM照片。其中，图6中，A为微球的扫描电镜图，B为微球的表面放大图，图中可以看出，本例所制备的微球形态好，粒径在10-120μm，其表面自组装有一层羟基磷灰石纳米颗粒；从图7中可以看出，本例所制备的微球几乎达到100％的药物释放率，突释非常小，几乎没有不完全释放，可以达到零级释放(各条曲线代表不同PLGA材料制备的微球，可以调控药物的不同释放时间，其中各个PLGA分别为2A50/50，羟基乙酸∶乳酸＝1∶1和分子量为20000-30000Da；2A65/35，羟基乙酸∶乳酸＝1∶1和羟基乙酸∶乳酸＝0.65∶0.35和分子量为20000-30000Da；3A50/50，羟基乙酸∶乳酸＝1∶1和分子量为30000-47000Da；3A65/35，羟基乙酸∶乳酸＝0.65∶0.35和分子量为30000-47000Da)，其体外释放性能符合要求。微球中生长素相对于其原始投加量的包封率为80.95％(计算方式为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)。附图8中，微球组为本实施例方法制备的微球，对照组为W/O/W方法制备的微球，空白组为不含药物的微球，可以看出，使用本例所制备的微球，体重增加比对照组的体重增加快，药效更好；从附图9可以看出，本例所制备的微球的相容性比对照组的好，在治疗期间，在动物组织内没有出现注射部位的微囊化或纤维化。

这种方法制备的微球包封率高最少可以达到80％以上，突释非常小，几乎没有不完全释放，基本可以达到零级释放，同时由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，可以使生物大分子药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活。而且这种表面具有纳米颗粒的生物大分子药物微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

例2：具有细胞黏附作用和促进生长或延缓衰老作用的载有生长素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备

本例与例1的不同之处在于，步骤(3)中，将步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到含有10％羟基磷灰石纳米颗粒和0.5％(w/w)PVA表面活性剂的混悬液中。

本实施例方法制备的生物大分子药物微球可以用于需要频繁注射给药、长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤、各种病因引起的贫血、侏儒等重大疾病的治疗。

实施例三

例1：具有抗菌作用和抗病毒效果的载有干扰素(IFN)水溶液的聚乳酸(PLA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)将5mg干扰素和5mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为10％的PLA的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶8混合并超声1分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到4ml重量百分比浓度为20％的二氧化钛纳米颗粒混悬液中并超声2分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为10％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化4小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤4次，冻干后得到载有干扰素(IFN)水溶液的聚乳酸(PLA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.51％，纳米颗粒的重量百分比为89.89％，聚合物的重量百分比为9.04％，药用辅料的重量百分比为0.56％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，制备的微球形态好，其表面自组装一层二氧化钛纳米颗粒，粒径在10-150μm；微球中干扰素相对于其原始投加量的包封率为91.07％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)。

本例所制得的微球的体外释放曲线如附图10、药效曲线如附图11，图10中可看出几乎零级的体外释放曲线；图11中，微球组为本实施例方法制备的微球，对照组为W/O/W方法制备的微球，可看出本实施例微球抗病毒和抗菌作用均好于对照组。

这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放。由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，同时可以使IFN药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活。

例2：具有抗菌作用和抗病毒效果的载有干扰素(IFN)水溶液的聚乳酸(PLA)微球的制备

本例与例1的不同之处在于，步骤(3)中，将步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到含50％的二氧化钛纳米颗粒和5％(w/w)的PVA表面活性剂的混悬液中。

这种方法制备的IFN微球可以用于需要频繁注射给药、长期治疗的疾病，如肝炎；可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦。

实施例四

例1：具有抗菌作用和治疗贫血作用的载有促红细胞生成素(EPO)水溶液的聚己内酯(PCL)微球的制备，包括如下步骤：

(1)将5mg EPO和5mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PCL的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶9混合并超声1分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到5ml重量百分比浓度为20％的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为1％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化1小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到具有抗菌作用和治疗贫血作用的载有促红细胞生成素(EPO)水溶液的聚己内酯(PCL)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.30％，纳米颗粒的重量百分比为71.79％，聚合物的重量百分比为27.55％，药用辅料的重量百分比为0.36％。

对本例制备的微球形貌表征，结果显示，所制备微球形态好，其表面自组装有一层羟基磷灰石纳米颗粒，粒径在50-120μm；微球中EPO相对于其原始投加量的包封率为83.33％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

本例制备的颗粒的药效曲线见附图12，由图12可看出，本实施例制备的微球抗贫血效果和抗菌效果为70天，与普通的药物颗粒70天相比，效果都非常好。

这种方法制备的微球包封率高最少可以达到80％以上，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放。由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，同时可以使EPO药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活。且这种具有纳米颗粒表面的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

例2：具有抗菌作用和治疗贫血作用的载有促红细胞生成素(EPO)水溶液的聚己内酯(PCL)微球的制备

本例与例1的不同之处在于，步骤(3)中，将步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到含40％羟基磷灰石纳米颗粒和5％(w/w)的PVA表面活性剂的混悬液中。

本实施例方法制备的EPO微球可以用于需要频繁注射给药、长期治疗各种原因引起的贫血如肿瘤治疗引起的肾衰贫血；可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦。

实施例五

例1：具有抗菌作用和粒细胞增加作用的载有粒细胞集落刺激因子G-CSF水溶液的PLGA-PEG微球制备，包括以下步骤：

(1)5mg G-CSF和5mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PLGA-PEG的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶9混合并超声5分钟形成均匀得混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到1ml重量百分比浓度为30％的羟基磷灰石纳米颗粒混悬液中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有粒细胞集落刺激因子G-CSF水溶液的PLGA-PEG微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.70％，纳米颗粒的重量百分比为44.03％，聚合物的重量百分比为54.72％，药用辅料的重量百分比为0.55％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，制备微球形态好，其表面自组装有一层羟基磷灰石纳米颗粒，粒径在50-120μm；微球中G-CSF相对于其原始投加量的包封率为93.33％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

该例的药效曲线如附图13，其中微球组为本实施例方法制备的微球，对照组为W/O/W方法制备的微球，空白组为不含药物的微球，图中可以看出，本实施例微球的药效明显好于对照组。

例2：具有抗菌作用和粒细胞增加作用的载有粒细胞集落刺激因子G-CSF水溶液的PLGA-PEG微球制备

本例与例1的不同之处在于，步骤(3)中，将步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到含20％羟基磷灰石纳米颗粒和2％(w/w)的PVA表面活性剂的混悬液中。

本实施例方法制备的G-CSF微球可以用于需要频繁注射给药、长期治疗各种原因引起的白细胞减少症；可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放。由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，同时可以使EPO药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活。且这种具有纳米颗粒表面的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例六

载有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水溶液的PLA-PEG微球的制备，包括如下步骤：

(1)将5mg GM-CSF和5mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PLA-PEG的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶9比例涡旋3分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)的油包水(W/O)乳液滴加到4ml重量百分比浓度为30％羟基磷灰石纳米颗粒混悬液中并搅拌4分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为3％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化3小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水溶液的PLA-PEG微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.60％，纳米颗粒的重量百分比为44.78％，聚合物的重量百分比为53.87％，药用辅料的重量百分比为0.75％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，制备微球形态好，表面自组装一层羟基磷灰石纳米颗粒，粒径在20-150μm；微球中GM-CSF相对于其原始投加量的的包封率为80％，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

本实施例方法制备的GM-CSF微球可以适用于癌症化疗和在用骨髓抑制疗法时所引起的白细胞减少症，亦适用于治疗骨髓衰竭患者的白细胞低下，也可预防白细胞减少时可能潜在的感染并发症，还能使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快；可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦；这种方法制备的微球包封率高最少可以达到80％，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放；由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，同时可以使GM-CSF药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活；由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，且这种具有纳米颗粒表面的微球具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例七

载有重组人生长激素(GH)水溶液的PLA/PLGA微球的制备，包括如下步骤：

(1)将5mg GH和5mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为12.5％的PLGA的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶4混合并搅拌2.5分钟，形成均匀的混悬液，再把PLA的有机溶液(1.6ml，浓度12.5％)加到上述混悬液中，再搅拌2分钟形成均匀混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)的油包水(W/O)乳液滴加到2ml含10％羟基磷灰石纳米颗粒和2％(w/w)的PVA表面活性剂的混悬液中并超声0.5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有重组人生长激素(GH)水溶液的PLA/PLGA微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.90％，纳米颗粒的重量百分比为60.20％，聚合物的重量百分比为39.22％，药用辅料的重量百分比为0.68％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，制备微球形态好，其表面自组装有一层羟基磷灰石纳米颗粒，粒径在50-200μm；微球中GH相对于其原始投加量的包封率为91.84％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

本实施例制备的重组人生长激素(GH)药物水溶液PLA/PLGA微球药效曲线如附图14，其中微球组为本实施例方法制备的微球，对照组为W/O/W方法制备的微球，图中可见，本实施例微球的药效明显好于对照组。

本实施例方法制备的微球可以适用于儿童、成人生长激素缺乏症，特纳氏综合症，儿童慢性肾功能不全导致的生长障碍，手术、创伤后高代谢状态(负氮平衡)，烧伤，脓毒败血症；可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦；同时表面自组装有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例八

载有血管内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液的聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将10mg VEGF和10mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为30％的PCL-PEG的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶9混合并超声1.5分钟形成均匀混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)的油包水(W/O)乳液滴加到1ml重量百分比浓度为60％羟基磷灰石纳米颗粒混悬液中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤5次，冻干后得到载有血管内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液的聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.69％，纳米颗粒的重量百分比为51.72％，聚合物的重量百分比为46.99％，药用辅料的重量百分比为0.60％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，本实施例制备的微球形态好，其表面自组装有一层纳米颗粒，粒径在50-200μm；微球中VEGF相对于其原始投加量的包封率为80.23％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

本实施例制备的血管内皮细胞生长因子(VEGF)药物溶液聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)微球药效曲线如附图15，其中微球组为本实施例方法制备的微球，对照组为W/O/W方法制备的微球，图15中可见，本实施例微球的药用效果明显好于对照组。

这种方法制备的VEGF微球可以适用于新生血管的形成治疗促血管内皮细胞生长的疗法，可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦；本方法制备的微球包封率高最少可以达到80％以上，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放。由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，同时可以使VEGF药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活。且这种表面自组装有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例九

载有血管内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液的聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)微球的制备方法，包括如下步骤：

(1)将10mg VEGF和40mg葡聚糖溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为5％的PCL-PEG和10％(w/w)泊洛沙姆的二氯甲烷溶液按照重量比为1∶1混合并超声1.5分钟形成均匀混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)的油包水(W/O)乳液滴加到1ml重量百分比浓度为10％羟基磷灰石纳米颗粒和0.5％(w/w)的PVA表面活性剂混悬液中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤5次，冻干后得到载有血管内皮细胞生长因子(VEGF)水溶液的聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为6.15％，纳米颗粒的重量百分比为61.54％，聚合物的重量百分比为7.69％，药用辅料的重量百分比为24.62％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，本实施例制备的微球形态好，其表面自组装有一层纳米颗粒，粒径在50-200μm；微球中VEGF相对于其原始投加量的包封率为80％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

本实施例制备的血管内皮细胞生长因子(VEGF)药物溶液聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)微球药效曲线如附图16，其中微球组为本实施例方法制备的微球，对照组为W/O/W方法制备的微球，图16中可见，本实施例微球的药用效果明显好于对照组。

这种方法制备的VEGF微球可以适用于新生血管的形成治疗促血管内皮细胞生长的疗法，可以减少注射的频率和减轻病人的痛苦；本方法制备的微球包封率高最少可以达到80％以上，突释非常小和几乎没有不完全释放，可以达到零级释放。由于纳米颗粒在材料降解产生的酸可以与羟基磷灰石纳米颗粒发生反应，而中和酸，以保证微球的内环境相对稳定，同时可以使VEGF药物在整个制备过程和治疗过程保持高活性即不失活。且这种表面自组装有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例十以阿霉素为例的小分子药物微球

例1：具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)取450mg阿霉素溶解到0.5ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PLGA和20％(w/w)泊洛沙姆的二氯甲烷溶液按照重量比1∶10混合并超声5分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到重量百分比浓度为10％的50ml银纳米颗粒和5％(w/w)的PVA表面活性剂混悬液中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为11.34％，纳米颗粒的重量百分比为60.18％，聚合物的重量百分比为25.32％，药用辅料的重量百分比为3.16％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，本实施例制备的微球形态好，其表面自组装有一层纳米颗粒，粒径在50-200μm；微球中阿霉素相对于其原始投加量的包封率为98.90％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

以本实施例方法制备的小分子药物微球可以用于需要长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤的血管栓塞微球等。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，且这种表面具有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例十一

具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)取0.5mg阿霉素溶解到0.5ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为20％的PLGA和0.1％(w/w)聚乙二醇的二氯甲烷溶液按照重量比1∶9混合并超声5分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到重量百分比浓度为10％的50ml银纳米颗粒混悬液和2％(w/w)的PVA表面活性剂中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.01％，纳米颗粒的重量百分比为35.71％，聚合物的重量百分比为60.12％，药用辅料的重量百分比为4.16％。

对本例制备的微球进行形貌表征，结果显示，本实施例制备的微球形态好，其表面自组装有一层纳米颗粒，粒径在50-200μm；微球中阿霉素相对于其原始投加量的包封率为99.90％(计算方法为：实际包封在微球的药×100％/投入的药量＝药物的包封率)，且实验表明其体外释放曲线也符合要求。

以本实施例方法制备的小分子药物微球可以用于需要长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤的血管栓塞微球等。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，且这种表面具有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例12

具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)取0.01mg阿霉素溶解到0.1ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为10％的PLGA和0.1％(w/w)聚乙二醇的二氯甲烷溶液按照重量比1∶10混合并超声5分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到重量百分比浓度为1％的0.1ml银纳米颗粒混悬液和2％(w/w)的PVA表面活性剂中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为0.01％，纳米颗粒的重量百分比为0.01％，聚合物的重量百分比为99.98％。

以本实施例方法制备的小分子药物微球可以用于需要长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤的血管栓塞微球等。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，且这种表面具有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例13

具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)取4mg阿霉素溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为1％的PLGA和0.1％(w/w)聚乙二醇的二氯甲烷溶液按照重量比1∶1混合并超声5分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到重量百分比浓度为4％的0.1ml银纳米颗粒混悬液和2％(w/w)的PVA表面活性剂中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为40％，纳米颗粒的重量百分比为40％，聚合物的重量百分比为20％。

以本实施例方法制备的小分子药物微球可以用于需要长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤的血管栓塞微球等。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，且这种表面具有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

实施例14

具有抗菌作用和抗癌效果的载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球的制备，包括如下步骤：

(1)取3mg阿霉素和3mg聚乙二醇溶解到0.2ml的水中形成药物水溶液；

(2)把上述药物水溶液和百分比浓度为1％的PLGA和0.1％(w/w)聚乙二醇的二氯甲烷溶液按照重量比1∶1混合并超声5分钟形成均匀的混悬液，即油包水(W/O)乳液；

(3)把步骤(2)所得油包水(W/O)乳液滴加到重量百分比浓度为2％的0.1ml银纳米颗粒混悬液和2％(w/w)的PVA表面活性剂中并搅拌5分钟形成纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳；

(4)把步骤(3)所得的纳米颗粒混悬液包油-油包水(W/O/S)复乳滴加到浓度为5％(w/w)的1000ml氯化钠溶液固化2小时；

(5)把步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并用水洗涤3次，冻干后得到载有阿霉素水溶液的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球。

本实施例中所得微球中，药物的重量百分比为30％，纳米颗粒的重量百分比为20％，聚合物的重量百分比为20％，药用辅料为30％。

以本实施例方法制备的小分子药物微球可以用于需要长期治疗的疾病，尤其是需要局部治疗的疾病如肿瘤的血管栓塞微球等。这种方法制备的微球包封率高，最少可以达到80％以上，且这种表面具有纳米颗粒的微球，由于表面亲水性的材料与组织相容性比疏水性的材料好，具有增强细胞黏附、减少局部过酸和疏水材料引起的炎症及微囊化的作用。

Claims (10)

1.一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将药物或药物和药用辅料制备成药物水溶液，所述药物在药物水溶液中的重量百分比为0.1％-90％，药用辅料在药物水溶液中的重量百分比为0％-20％；

(2)将步骤(1)制备的药物水溶液按照重量比为1∶1-10分散在浓度为0.5％-80％(w/w)的聚合物有机溶液中形成均匀的混悬液，即油包水乳液；

(3)将步骤(2)形成的油包水乳液加入到重量百分比浓度为1％-80％的纳米颗粒混悬液中或含1％-80％(w/w)纳米颗粒和0.5％-5％(w/w)表面活性剂的混悬液中乳化，形成纳米颗粒混悬液包油-油包水复乳；

(4)将所述纳米颗粒混悬液包油-油包水复乳转移到浓度为1％-10％(w/w)无机盐溶液固化1-4h；

(5)将步骤(4)所得样品进行离心，收集微球，并洗涤所得微球，之后冻干，得到表面自组装有纳米颗粒的微球。

2.如权利要求1所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述药物包括小分子药物和大分子药物。

3.如权利要求2所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述小分子药物为化学药物，所述大分子药物为生物大分子药物，所述药用辅料为注射用药用辅料。

4.如权利要求3所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述生物大分子药物选自蛋白大分子药物、疫苗、抗体、核酸、或脂质体药物中的一种或几种。

5.如权利要求1所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述步骤(2)的聚合物有机溶液中，聚合物选自聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇、聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇或聚己内酯-聚乙二醇中的一种或几种；有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、庚烷、氯仿、或丙酮中的一种或几种；

所述步骤(3)中，所述纳米颗粒混悬液选自有机纳米颗粒水混悬液、无机纳米颗粒水混悬液或上述两者的混合液。

6.如权利要求1或5所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，聚合物有机溶液的浓度为5％-30％(w/w)；所述步骤(3)中，所述纳米颗粒混悬液的浓度为20％-70％(w/w)。

7.如权利要求1所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述聚合物有机溶液中还添加有0.1％-20％(w/w)聚乙二醇或泊洛沙姆。

8.如权利要求1所述的纳米颗粒混悬液包油-油包水制备微球的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述表面活性剂选自聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚三梨醇、乙基纤维素或吐温的一种或几种。

9.一种纳米颗粒混悬液包油-油包水制备的微球，其特征在于，所述微球的粒径为1-500μm，其表面组装有一层纳米颗粒；其中

所述微球中，药物的重量百分比为0.01％-40％，纳米颗粒的重量百分比为0.01％-96％，聚合物的重量百分比为99.98％-3.65％，药用辅料的重量百分比为0-30％。

10.如权利要求9所述的微球，其特征在于，所述微球的粒径为10-100μm。

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