CN102883727B

CN102883727B - 预防和治疗病毒感染的方法和物质

Info

Publication number: CN102883727B
Application number: CN201080064931.8A
Authority: CN
Inventors: A·S-Y·刘; L·H·C·杨; A·H-Y·罗
Original assignee: Perry Ltd; Versitech Ltd
Current assignee: Versitech Ltd; Purapharm Co Ltd
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: ES2660229T3; AU2010337947A1; EP2521554A2; CA2786169A1; EP2521554A4; JP6153569B2; AU2010337947B2; JP2015231998A; DK2521554T3; JP2013516400A; CN102883727A; EP2521554B1; WO2011080593A2; CA2786169C; WO2011080593A3; US20130029923A1

Abstract

本发明提供一种用于预防和治疗病毒感染的有利的新方法。具体而言，本发明举例说明了连翘酯苷A和蓝花楹酮的治疗用途，所述二者为从中药材如连翘(Fructus forsythiae)(Lian Qiao)中分离的化合物。本发明还提供了用银翘散(Yin Qiao San)组合物预防和治疗病毒感染的用途。

Description

预防和治疗病毒感染的方法和物质

相关申请的相互参引

本申请要求享有2009年12月30日提交的美国临时申请No.61/291,073的权益，所述申请通过引证的方式全文纳入本文。

背景技术

病毒感染导致许多急性和慢性的危及生命的疾病。估计全世界约3340万人感染人免疫缺陷病毒(HIV)₍₁₎。此外，估计有20亿人感染了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)，且每年有600,000人由于所述感染的急性或慢性后果而死亡₍₂₎。

流行性感冒是急性病毒感染并且是世界上最广泛传播的病毒感染之一。主要的甲型流感大流行病包括1957年的亚洲流感大流行病(H2N2)、1968年的香港流感大流行病(H3N2)、1970年的H1N1(俄罗斯流感)再度出现、1997和2003年的H5N1禽流感，和最近的2009年四月猪流感(H1N1)爆发。2009年11月，全世界超过207个国家和地区或团体已报道了流感H1N12009的实验室确认病例，包括至少8768例死亡₍₃₎。此外，禽流感H5N1病毒仍是重大的健康问题。根据世界卫生组织，基于所报道病例，H5N1导致超过60％的高死亡率。

尽管付出广泛的努力，开发有效的抗病毒药仍然主要是根据经验的。对HIV尚无治愈疗法。同样，对急性肝炎尚无特异性治疗，虽然抗病毒治疗可改善某些患有慢性肝炎感染的患者的病症。此外，几乎所有的季节性甲型流感病毒的流行毒株均对FDA批准的抗病毒药——包括金刚烷和神经氨酸酶抑制剂——有抗性_(4，5)。

在以前的研究中，本发明人已鉴定了一系列H5N1、H1N1和H9N2神经氨酸酶的强效抑制剂，其与已知的神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦的水平相当₍₆₎。本发明人也已使用生物活性引导的纯化技术来分析和鉴定在草药中导致抗炎活性的生物活性分子，所述草药包括人参和升麻属的种_(7，8)。虽然这些进展给人深刻印象，但从天然来源分离和鉴定有用的治疗化合物仍有困难且主要根据经验。同样，由于病毒株随时间推移会改变，抗性突变的出现进一步减弱抗病毒药的效力。因此，开发其他新型抗病毒治疗剂是迫切需要的。

发明内容

本发明提供用于预防和/或治疗病毒感染的有利的新物质和方法。具体而言，本发明举例说明了连翘酯苷A(forsythoside A)和蓝花楹酮(jacaranone)的治疗用途，所述二者是从中药材如连翘(Fructus forsythiae)(Lian Qiao)中分离的化合物。本发明还提供了草药制剂，和含所述草药制剂的组合物，用于预防和/或治疗病毒感染。优选地，本发明的化合物和组合物被制成用于口服给药的形式。

在一个实施方案中，本发明的治疗方法可用于预防和/或治疗病毒感染。所述方法包括对需要所述治疗的受试者给予有效量的包含具有下式的分离化合物A或其前药、代谢物或盐的组合物：

其中

R₁-R₁₇独立地为-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、烷氧基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺。

在另一个实施方案中，所述方法包含对受试者给予有效量的分离的化合物A的前药和/或代谢物(或其盐)。化合物A的示例性代谢物是化合物B。化合物B的化学结构如下所示：

其中

R’₁-R’₆独立地为-H、烷基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺。

化合物A的另一示例性代谢物是化合物C。化合物C的化学结构如下所示：

其中

R”₁-R”₁₃独立地为-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、烷氧基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺。

在另一个实施方案中，所述方法包含对需要所述治疗的受试者给予有效量的包含具有下式的分离的化合物D或其前药、代谢物或盐的组合物：

其中

R₁”’-R₂”’独立地为-H、酰基、卤代烷基、烷基氨基、烷基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺，并且

R₃”’-R₄”’独立地为-H、烷基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺。

本发明还提供了式A-D的化合物作为预防和/或治疗病毒感染的药物的用途。在一个实施方案中，本发明提供了连翘酯苷A和蓝花楹酮及其前药、代谢物或盐作为预防和/或治疗病毒感染的药物的用途。

在另一个实施方案中，所述方法包括给予包含如下形式的分离化合物的组合物，所述分离化合物的形式包括但不限于，盐、立体异构体、互变异构体、晶体、多晶型物、无定形物、溶剂合物、水合物、酯、前药、代谢物及其结合物。

在又一个实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的银翘散(YinQiao San，YQS)组合物或其级分而治疗、预防或改善病毒感染的治疗方法。还提供了银翘散组合物或其级分作为治疗、预防或改善病毒感染的药物的用途。

本发明还包括银翘散组合物的级分，其由本文所描述的反相HPLC方法分级分离。在一个具体的实施方案中，本发明提供了银翘散组合物的甲醇提取物的F2-F5级分中的一种或多种，其HPLC色谱图显示于图12中。在一个具体的实施方案中，本发明提供了银翘散组合物的甲醇提取物的F2和/或F3级分，其HPLC色谱图显示于图12中。在一个具体的实施方案中，本发明提供了银翘散组合物的S11级分，其HPLC色图法显示于图14中。

在一个实施方案中，本发明的治疗方法可用于预防和/或治疗由甲型、乙型或丙型流感病毒引起的病毒感染，所述流感病毒包括但不限于H1N1、H9N2、H3N2、H5N1、H2N2、H7N7、H7N1及其任意结合物。

在另一个实施方案中，预防和/或治疗病毒感染的方法还包括：对受试者给予选自例如以下的第二抗病毒剂：扎那米韦、奥塞米韦(oseltamivir)、帕拉米韦、奥司他韦(seltamivir)，及其任意结合物；并且其中所述第二抗病毒剂可在给予本发明化合物之前、同时或之后给予。

在又一个实施方案中，预防和/或治疗病毒感染的方法还包括对受试者给予除本发明化合物之外的中药材，所述中药材包括但不限于连翘(Fructus forsythiae)、荆芥(Herba seu Flos Schizonepetae Tenuifoliae)、牛蒡子(Fructus Arctii Lappae)、淡豆豉(Semen Sojae Preparatum)、淡竹叶(Herba Lophatheri Gracilis)、甘草(RadixGlycyrrhizae Uralensis)和桔梗(Radix Platycodi Grandiflori)。

在又一个实施方案中，治疗病毒感染的方法还包括测定受试者病毒感染水平的步骤；其中所述测定任选地在多个时间进行以监测随时间的变化。

在另一个实施方案中，治疗病毒感染的方法还包括测定受试者中一种或多种生物标记物水平的步骤；其中所述测定任选地在多个时间进行以监测随时间的变化。

附图说明

图1显示出从连翘中提取包括连翘酯苷A(化合物A1)和蓝花楹酮(化合物D1)在内的生物活性化合物的示意图。将连翘研碎并用10x的milli-Q水回流提取并煮沸2小时。提取过程重复一次。每次，将所得提取物收集、合并、蒸干并重溶于MeOH。使用生物分析引导的分离方案，将显示出显著抗病毒和/或COX-2抑制作用的级分使用反相高效液相色谱法(HPLC)进一步纯化直至获得纯化合物。

图2A-B显示出连翘酯苷A(化合物A1)的反相高效液相色谱法(HPLC)色谱图(A)和UV吸光度(B)。将化合物A1通过反相HPLC使用流速为1mL/min的10％至90％乙腈的梯度洗脱进行纯化。图2A显示出使用光电二极管阵列检测器在254、210和280nm处检测到单峰。化合物A1在约6.8min时洗脱。图2B显示出化合物A1的UV吸光度在210、290和330nm处最大。

图3A-B显示出蓝花楹酮(化合物D1)的反相高效液相色谱法(HPLC)色谱图(A)和UV吸光度(B)。将化合物D1通过反相HPLC使用流速为1mL/min的10％至90％乙腈的梯度洗脱进行纯化。图3A显示出使用光电二极管阵列检测器在254、210和280nm处检测到单峰。化合物D1在约10.75min时洗脱。图3B显示出化合物D1的UV吸光度在230nm处最大。

图4显示出连翘酯苷A(化合物A1)的¹H(上图)和¹³C(下图)化学位移。化合物A1的结构通过Bruker 500MHz DRX NMR波谱仪解析，对于¹H以500MHz操作，对于¹³C NMR以125MHz操作，使用含有TMS的甲醇-d作为溶剂。

图5显示出蓝花楹酮(化合物D1)的¹H(上图)和¹³C(下图)化学位移。化合物D1的结构通过Bruker 500MHz DRX NMR波谱仪阐明，对于¹H以500MHz操作，对于¹³C NMR以125MHz操作，使用含有TMS的甲醇-d作为溶剂。

图6显示出连翘酯苷A和蓝花楹酮的化学结构。

图7A-E显示出连翘酯苷A(化合物A1)或奥塞米韦对流感病毒复制的抑制作用。将MDCK细胞用流感病毒(A)H1N1(A/HK/54/98)、(B)H1N1-R(A/Vicotria/07159200/07)、(C)H9N2(A/Quail/HIK/G1/97)或(D)H3N2(A/H3N2/1174/99)感染。用连翘酯苷A(化合物A1)(100ug/ml)孵育48小时后，通过在MDCK细胞中进行滴定来测量细胞培养上清液中的病毒效价(TCID₅₀)。(E)将细胞用H1N1(A/HK/54/98)病毒感染后，将奥塞米韦(100μM)或PBS作为对照加入所述细胞中。通过在MDCK细胞中进行滴定来测量细胞培养上清液中的病毒效价(TCID₅₀)。(所有图均是来自三个试验的代表性结果)。

图8显示出连翘酯苷A(化合物A1)对原代人血巨噬细胞中流感病毒复制的抑制作用。将原代人血巨噬细胞用人流感病毒包括H1N1(A/HK/54/98)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用连翘酯苷A(化合物A1)(100μg/ml)或DMSO孵育48小时。之后，收集细胞培养上清液，并且通过在MDCK细胞中进行滴定来测量病毒效价(TCID₅₀)。(来自三个试验的代表性结果。)

图9A-C显示出通过免疫细胞化学(A-B)和蛋白印迹分析(C)测定的连翘酯苷A(化合物A1)对流感病毒的抑制作用。(A)将MDCK细胞用人流感病毒H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为0.2。随后将细胞用化合物A1(100μg/ml)或DMSO孵育6或10小时。之后，将细胞固定。将流感核蛋白和M1蛋白质用流感检测试剂盒(Influenza Detection Kit)染色。(B)感染后6和10小时对表达病毒蛋白的细胞数目计数并计算表达病毒蛋白的细胞百分数。(C)将MDCK细胞用人流感病毒H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2，或进行假感染(M)。之后，将细胞用连翘酯苷A(化合物A1)(100μg/ml)或DMSO进行孵育。在感染后2、4、9或24小时收获蛋白质。流感M1蛋白质的表达通过蛋白印迹分析进行分析。肌动蛋白用作上样对照。A&C，来自三个试验的代表性附图；B，n＝3，^＊P＜0.05。

图10A-D显示出通过透射电子显微术的病毒体的超微结构检查。将MDCK细胞用人流感病毒H9N2/Gl(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用连翘酯苷A(化合物A1)(100μg/ml)(C-D)或DMSO(A-B)孵育18小时。随后将细胞固定，通过透射电子显微术检查超微结构。(B)和(D)中的箭头表示流感病毒体。放大倍数：A，3200×；B，6300×；C，4800×；D，8900×。

图11A-B显示出蓝花楹酮(化合物D1)对环氧合酶2(COX-2)的抑制作用。(A)将原代人血巨噬细胞用H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用化合物D1(10μg/ml或20μg/ml)或DMSO孵育3小时。之后，收获总的RNA并且通过TaqMan基因表达测定法检查COX-2mRNA水平(n＝5)。(B)将细胞用H9N2/G1(AQuail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2，或进行假感染。之后，将细胞用化合物D1(10μg/ml或20μg/ml)处理48小时。随后收获细胞培养上清液并通过前列腺素E₂EIA试剂盒(n＝4)测量前列腺素E₂的水平。^＊P＜0.05；#P＜0.01；##p＜0.005。

图12显示出银翘散(YQS)配方的反相高效液相色谱法(HPLC)色谱图。通过反相HPLC使用流速为1mL/min的10％至90％乙腈的梯度洗脱分离级分。获得总共五个级分。

图13A-C显示出YQS和YQS级分对病毒复制的抑制作用。将MDCK细胞用H1N1(A/HK/54/98)(A)或H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)(B)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用YQS(100μg/ml)或DMSO孵育48小时。之后，收集细胞培养上清液，并且通过在MDCK细胞中进行滴定来测量病毒效价(TCID₅₀)。(C)将MDCK细胞用H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用YQS级分(F1-F5)(100μg/ml)或DMSO孵育48小时。之后，收集细胞培养上清液，并通过在MDCK细胞中进行滴定来测量病毒效价(TCID₅₀)。代表性附图来自三个(A-B)或两个(C)独立试验。

图14显示出通过反相高效液相色谱法(HPLC)获得的YQS的典型色谱图。通过反相HPLC使用流速为1mL/min的10％至90％乙腈的梯度洗脱分离级分。获得总共十三个级分。

图15A-B显示出YQS和YQS级分诱导白细胞介素(IL)-1β。(A)将原代人血巨噬细胞用H1N1(A/HK/54/98)进行感染，m.o.i.为2，或进行假感染。随后将H1N1感染的细胞用YQS(100μg/ml)或DMSO孵育3小时。之后，收获总的RNA并且通过TaqMan基因表达测定法检查IL-1βmRNA水平。(B)将原代人血巨噬细胞用H1N1(A/HK/54/98)进行感染，m.o.i.为2，或进行假感染。随后将H1N1感染的细胞用YQS级分(S1-S13)(100μg/ml)或DMSO孵育3小时。之后，收获总的RNA并通过TaqMan基因表达测定法检查IL-1βmRNA水平。代表性附图来自三个试验。

具体实施方式

本发明提供了用于预防、治疗和/或改善受试者病毒感染的有利的新和方法。本发明具体举例说明了连翘酯苷A和蓝花楹酮的治疗用途，所述二者是自中药材如连翘(Fructus forsythiae)(Lian Qiao)中分离的化合物。本发明还提供了用于预防和/或治疗病毒感染的草药制剂，及其组合物。优选地，本发明的化合物和组合物被制成用于口服给药的形式。

在一个实施方案中，所述方法包括对受试者给予有效量的分离的化合物A或其前药、代谢物或盐。化合物A的化学结构如下所示：

其中

在另一个实施方案中，所述方法包括对受试者给予有效量的分离的化合物A的前药和/或代谢物(或其盐)。化合物A的示例性代谢物为化合物B。化合物B的化学结构如下所示：

其中

在另一个实施方案中，所述方法包括对需要所述治疗的受试者给予有效量的包含具有下式的分离的化合物D或其前药、代谢物或盐的组合物：

其中

R₁”’-R₂”’独立地为-H、酰基、卤代烷基、烷基氨基、烷基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺，和

在一个实施方案中，C-R”’₁形成一个醚键或酯键。在另一个实施方案中，R”’₃-R”’₄独立地为-H、烷基、卤素、卤代烷基、烷氧基或羟基烷基。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的化合物A、化合物B、化合物C和化合物D(及其前药、代谢物和盐)的任意结合物而治疗、预防或改善病毒感染的方法。

本发明还包括式A-D的化合物作为预防和/或治疗病毒感染的药物的用途。在一个实施方案中，本发明提供了连翘酯苷A和蓝花楹酮，及其前药、代谢物或盐，作为预防和/或治疗病毒感染的药物的用途。

“烷基”意指一至八个碳原子的直链饱和单价基团或三至八个碳原子的支链饱和单价基团。其可包括一至四个或一至三个碳原子的烃基，其可为直链的。实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。

“酰基”意指基团-C(O)R，其中R为例如氢、烷基或环烷基、杂环烷基、卤素或烷基卤素。实例进一步包括甲酰基、乙酰基、乙基羰基等。

“羧基”意指基团-C(O)OH。

“烷氧羰基”意指基团-C(O)R，其中R为例如氢、烷基或环烷基、杂环烷基、卤素或烷基卤素。

“甲酰胺”意指基团-C(O)R，其中R为例如-NH₂或烷基氨基。

“卤素”意指氟、氯、溴或碘，例如溴和氯。

“卤代烷基”意指被一个或多个、相同或不同的卤素原子取代的烷基，例如-CH₂Cl、-CH₂Br、-CF₃、-CH₂CH₂Cl、-CH₂CCl₃等。

“氨基”意指基团-NH₂。

“烷基氨基”意指基团-NHR或-NR₂，其中每个R独立地为烷基基团。实例包括甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、二甲基氨基、甲基乙基氨基、二(1-甲基乙基)氨基等。

“羟基”意指基团-OH。

“羟基烷基”意指被一个或多个，优选一个、两个或三个羟基基团取代的如本文所定义的烷基基团。代表性实例包括，但不限于，羟基甲基、2-羟基乙基、2-羟基丙基、3-羟基丙基、1-(羟基甲基)-2-甲基丙基、2-羟基丁基、3-羟基丁基、4-羟基丁基、2，3-二羟基丙基、2-羟基-1-羟基甲基乙基、2，3-二羟基丁基、3，4-二羟基丁基和2-(羟基甲基)-3-羟基丙基，优选2-羟基乙基、2，3-二羟基丙基和1-(羟基甲基)2-羟基乙基。

“烷氧基”意指基团-OR_a，其中R_a为烷基基团。示例性烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

本发明进一步提供通过给予包含分离的对映异构体化合物的组合物而预防、治疗或改善病毒感染的方法。本发明化合物的分离的对映异构形式基本上不相互包含(即，对映体过量)。换言之，所述化合物的“R”型基本上不合化合物的“S”型，因此其相对于“S”型，对映体过量。相反，化合物的“S”型基本上不含化合物的“R”形式，因此其相对于“R”型，对映体过量。在本发明的一个实施方案中，所述分离的对映异构化合物为至少约80％对映体过量。在一个优选的实施方案中，所述化合物为至少约90％对映体过量。在一个更优选的实施方案中，所述化合物为至少约95％对映体过量。在一个甚至更优选的实施方案中，所述化合物为至少约97.5％对映体过量。在一个最优选的实施方案中，所述化合物为至少约99％对映体过量。

本发明还提供了通过给予一种如下形式的含分离的化合物的组合物而预防、治疗或改善病毒感染的方法，所述分离化合物的形式，包括但不限于，盐、立体异构体、互变异构体、晶体、多晶型物、无定形物、溶剂合物、水合物、酯、前药、代谢物，及其任意结合物。

本文所使用的术语“前药”指本发明化合物的代谢前体或其可药用形式。一般而言，前药包含化合物的功能性衍生物，当给予至受试者时其可为无活性的，但其容易在体内转变为活性代谢化合物。

选择和制备合适前药衍生物的常规步骤描述于，例如，″Design of Prodrugs″，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985中。优选地，本发明的前药提高本发明化合物所需的特性，包括但不限于，溶解度、生物利用度和稳定性。因此，如果需要，本发明方法所使用的化合物可以前药的形式递送。本发明中所使用的化合物的前药可通过以下方式制备：对所述化合物中存在的官能团进行改性从而使得所述改性在常规操作下或在体内断裂以产生母体化合物。

术语“代谢物”指药理学活性产物，包括例如，通过本发明化合物在受试者中的体内代谢产生的活性中间体或最终产物。代谢物可来自，例如，受试者中所给予的化合物的合成代谢和/或分解代谢过程，包括但不限于氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺、酯化、脱酯、酶裂解等。

代谢物通常通过以下方式鉴定：制备放射标记的(例如，¹⁴C或³H)同位素的本发明化合物，将其以可检测的剂量(例如，大于约0.5mg/kg)肠胃外给予动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴)或人，允许足够的时间发生代谢(通常约30秒至约30小时)，然后从尿液、血液或其他生物样本中分离其转化产物。这些产物容易分离，因为其被标记(其他产物通过使用能够结合代谢物中残存的表位的抗体而分离)。代谢物的结构可以以常规方式测定，例如，通过MS、LC/MS或NMR分析测定。通常，代谢物的分析根据药物代谢研究领域的技术人员熟知的技术进行。

本文所使用的术语“受试者”描述了可对其用本发明组合物进行治疗的生物体，包括哺乳动物，例如灵长类。可受益于所公开的治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于，猿、黑猩猩(chimpanzee)、猩猩(orangutan)、人、猴；以及家养动物例如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。

本文所使用的术语“抗病毒”包括但不限于，预防、抑制、遏制、减少、不利地影响以及/或者妨碍病毒的生长、存活、复制、机能和/或传播。

在一个实施方案中，本发明提供了通过给予有效量的本发明化合物而治疗、预防或改善病毒感染的治疗方法。

在一个具体实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的连翘酯苷A(化合物A1)或其前药、代谢物或盐而治疗、预防、改善病毒感染的治疗方法。连翘酯苷A(化合物A1)的化学结构为：

在另一具体的实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的蓝花楹酮(化合物D1)或其前药、代谢物或盐而治疗、预防和/或改善病毒感染的治疗方法。蓝花楹酮(化合物D1)的化学结构为：

连翘酯苷A(化合物A1)和蓝花楹酮(化合物D1)可使用本文所述的分离和生物分析引导的操作从连翘(Fructus forsythiae)和相关植物中分离。

在另一具体实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的化合物A1的前药和/或代谢物(或其盐)而治疗、预防或改善病毒感染的治疗方法。化合物A1的示例性代谢物为化合物B1。化合物B1的化学结构为：

化合物A1的另一示例性代谢物为化合物C1。化合物C1的化学结构为：

在另一实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的连翘酯苷A(化合物A1)、化合物B1、化合物C1和化合物D1(及其前药、代谢物或盐)的任意结合物而治疗、预防或改善病毒感染的治疗方法。

本发明还提供了用于预防和/或治疗病毒感染的草药制剂，以及含有所述草药制剂(改进的银翘散制剂)的组合物。

在一个实施方案中，所述组合物包含由以下具有括号内所示相对重量的草药组成的草药制剂：连翘(Lian Qiao/Fructus forsythiae suspensae)(25％-35％)、金银花(JinYin Hua/Flos Lonicerae Japonicae)(25％-35％)、牛蒡子(Niu Bang Zi/FructusArctii Lappae)(1％-7％或15％-25％)、桔梗(Jie Geng/Radix Platycodi Grandiflori)(1％-7％)、薄荷(Bo He/Herba menthae haplocalycis)(1％-7％)、淡豆豉(Dan Dou Chi/Semen Sojae Preparatum)(3％-7％)、甘草(Gan Cao/Radix Glycyrrhizae Uralensis)(8％-20％)、淡竹叶(Dan Zhu Ye/Herba Lophatheri Gracilis)(1％-5％)和荆芥(JingJie)(1％-5％)。

在一个实施方案中，所述组合物包含由以下具有括号内所示相对重量的草药组成的草药制剂：连翘(25％-40％)、金银花(25％-40％)、牛蒡子(15％-25％)和甘草(10％-20％)；并且其中所述组合物不包含以下草药中的任一种：荆芥、薄荷、淡豆豉、淡竹叶和桔梗。

在一个优选的实施方案中，所述组合物包含如表1中所示的YQS-F9的草药制剂。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含选自如表1中所示的YQS-F5、YQS-F6A或YQS-F1的草药制剂。在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种如表1中所示的草药制剂。在一个实施方案中，所述组合物不包含如表1中所示的YQS-常规制剂。

表1举例说明了本发明的草药制剂。

表1：银翘散(YQS)中的草药成分的分布百分数。

常规YQS煎剂中总干重为66g。

有利地，本发明组合物提供了令人惊奇的优异抗病毒效果。具体而言，本发明组合物提高了患有病毒感染的受试者中的IL-1β水平。

在一个实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的本发明组合物或其级分而治疗、预防或改善病毒感染的治疗方法。还提供了本发明组合物或其级分作为治疗、预防或改善病毒感染的药物的用途。

在又一个实施方案中，本发明提供了通过对受试者给予有效量的银翘散(YQS)组合物(如表1中所示的YQS-常规制剂)或其级分而治疗、预防或改善病毒感染的治疗方法。还提供了银翘散组合物或其级分作为治疗、预防或改善病毒感染的药物的用途。

所述银翘散组合物是由薄荷(Herba menthae haplocalycis)、荆芥(Herba seuFlos Schizonepetae Tenuifoliae)、连翘(Fructus forsythiae suspensae)、牛蒡子(Fructus Arctii Lappae)、淡豆豉(Semen Sojae Preparatum)、淡竹叶(HerbaLophatheri Gracilis)、甘草(Radix Glycyrrhizae Uralensis)、金银花(Flos LoniceraeJaponicae)和桔梗(Radix Platycodi Grandiflori)组成的草药混合物。

在一个具体的实施方案中，所述银翘散组合物由以下具有括号内所示相对重量的草药组成：薄荷(约60)、荆芥(约40)、连翘(约100)、牛蒡子(约60)、淡豆豉(约50)、淡竹叶(约40)、甘草(约50)、金银花(约100)和桔梗(约60)。

在一个实施方案中，本发明提供了所述银翘散组合物的级分，所述级分是通过反相HPLC(Lichrospher 100RP C18 EC 5μm，250×4.6mm ID)使用流速为1mL/min的10％乙腈(CH₃CN)至90％CH₃CN的梯度洗脱而分级分离的。峰值检测使用设定在210、254和280nm的Agilent 1200系列的快速扫描光电二极管阵列检测器实现。

在一个具体实施方案中，本发明提供了银翘散组合物的F2-F5中的一个或多个级分，其HPLC色谱图显示于图12中。在一个具体实施方案中，本发明提供了银翘散组合物的F2和/或F3级分，其HPLC色谱图显示于图12中。在一个具体实施方案中，本发明提供了银翘散组合物的S11级分，其HPLC色谱图显示于图14中。

本文所使用的术语“治疗”，包括但不限于，减弱、遏制、抑制、减轻或影响病症的进展、严重性和/或范围以及在缓解之后疾病再发生或复发的机会。在一个实施方案中，治疗可包括直接影响或治疗、遏制、抑制、减轻与感染有关的症状的严重程度、延缓所述症状发作，减少所述症状，或其结合。在另一实施方案中，治疗包括延缓进展、加快缓解、导致缓解、增强缓解、加速恢复、增强其他治疗的效果或降低对其他治疗的抗性，或其结合。

本文所使用的术语“遏制”或“抑制”，包括但不限于，减轻症状的严重程度、减轻急性发作的严重程度、减少症状的数量、降低疾病相关症状的发生率、减少症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活期，或其结合。

本文所使用的术语“预防”，包括但不限于，延缓症状的发作、防止疾病复发、减少复发事件的数量或频率、增长症状发作之间的时间，或其结合。

本文所使用的术语“有效量”指能够预防、改善或治疗病毒感染的量。术语“有效量”还包括能够预防、改善或治疗病毒感染以及/或者抑制或减少COX-2和/或PGE2水平的量。在某些实施方案中，所述有效量能够使病毒效价(例如，TCID₅₀)降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。病毒效价的降低可由例如在不同时间点获自受试者的生物样本测定。

有利地，本发明化合物和组合物能够预防、抑制、降低和/或阻碍病毒复制。在具体实施方案中，流感病毒H1N1(A/HK/54/98)、H1N1(A/Vicotria/07159200/07)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)在MDCK细胞中的复制分别被连翘酯苷A(化合物A1)抑制约15、3、24和12倍。

此外，本发明的化合物和组合物可用于调节病毒感染期间的免疫应答。例如，本发明的化合物和组合物提高IL-1β水平。本发明的化合物和组合物也可抑制COX-2和前列腺素E₂(PGE-2)活性，特别是在病毒感染期间。在另一实施方案中，所述的有利的新治疗方法能够预防、治疗或改善对现有的抗病毒治疗剂有抗性的受试者的病毒感染，所述现有的抗病毒治疗剂包括但不限于化合物，例如金刚烷和神经氨酸酶抑制剂，扎那米韦、奥塞米韦、帕拉米韦和奥司他韦；干扰素；核苷，siRNA；或其任意结合物。

本发明的化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由流感病毒引起的感染，所述流感病毒包括但不限于：甲型流感、乙型流感或丙型流感的任一亚型。

本文所使用的术语“流感病毒”，包括能够引起动物或人受试者的疾病的流感病毒的任意毒株，或用于实验分析的感兴趣的候选的任意流感病毒毒株。流感病毒记载于Fields，B.，et al.，Fields′Virology，4^th ed.，Philadelphia：Lippincott Williams andWilkins；ISBN：0781718325，2001。

本文所使用的甲型流感病毒包括能够引起动物或人受试者的疾病的甲型流感病毒的任意毒株，或用于实验分析的感兴趣的候选的任意甲型流感病毒毒株。大量甲型流感分离株已部分或完全测序，如记载于Macken，C.，Lu，H.，Goodman，J.，& Boykin，L.，″Thevalue of a database in surveillance and vaccine selection.″inOptions forthe Control of Influenza IV.A.D.M.E.Osterhaus，N.Cox & A.W.Hampson(Eds.)Amsterdam：Elsevier Science，2001，103-106)。该数据库也包含乙型和丙型流感基因组区段的完全序列。

流感病毒是正粘病毒科的有包膜的负链RNA病毒。流感病毒分为甲、乙和丙型流感病毒，其中甲型流感病毒是最致病的并且被认为是唯一能够与动物毒株进行重配的类型。甲、乙和丙型流感病毒可根据它们的核蛋白和基质蛋白的差异区分。如下面进一步讨论的，甲型流感病毒亚型通过其血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变异界定并且通常根据结合相应蛋白的抗体区分。

甲型流感病毒基因组由分布在八个RNA区段中的十个基因组成。所述基因编码10种蛋白：包膜糖蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)；基质蛋白(M1)；核蛋白(NP)；作为RNA依赖的RNA转录酶组分的三种聚合酶(PB1、PB2和PA)，所述转录酶在本文中也称作聚合酶或聚合酶复合物；离子通道蛋白(M2)，和非结构蛋白(NS1和NS2)。乙型流感病毒基因组的结构与甲型流感极为相似，而丙型流感病毒基因组包含七个RNA区段并且缺少NA基因。

甲型流感病毒分类基于血细胞凝集素和神经氨酸酶基因。可能的血细胞凝集素和神经氨酸酶基因可使用本领域已知的UniProtKB/Swiss-Prot Release 57.5(2009年7月7日)或UniProtKB/TrEMBL Release 40.5(2009年7月7日)测定。世界卫生组织(WHO)命名法按照病毒的动物宿主源(如非人则具体指出)、地理学来源、毒株编号、分离年份、HA和NA的抗原说明来定义每个病毒株。例如，具有HA型H1、H2和H3和NA型N1和N2的病毒已引起人流行病。例如，H5N1/97“禽流感”爆发是首次记载的家禽流感病毒向人的直接传播，引起了具有严重病毒性肺炎和死亡率＞30％的破坏性感染₍₉₎。其他甲型流感流行病包括1957年的亚洲流感大流行病(H2N2)、1968年的香港流感大流行病(H3N2)、1970年的H1N1(俄罗斯流感)再度出现，以及最近的2009年4月的猪流感爆发(H1N1)。

在一个实施方案中，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由甲型流感病毒引起的感染，所述病毒包括但不限于H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N7、H3N8、H3N9、H4N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8、H7N9、H8N1、H8N2、H8N3、H8N4、H8N5、H8N6、H8N7、H8N8、H8N9、H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9、H10N1、H10N2、H10N3、H10N4、H10N5、H10N6、H10N7、H10N8、H10N9、H11N1、H11N2、H11N3、H11N4、H11N5、H11N6、H11N7、H11N8、H11N9、H12N1、H12N2、H12N3、H12N4、H12N5、H12N6、H12N7、H12N8、H12N9、H13N1、H13N2、H13N3、H13N4、H13N5、H13N6、H13N7、H13N8、H13N9、H14N1、H14N2、H14N3、H14N4、H14N5、H14N6、H14N7、H14N8、H14N9、H15N1、H15N2、H15N3、H15N4、H15N5、H15N6、H1N7、H15N8和H15N9的任意毒株。

在一个具体实施方案中，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由甲型流感病毒引起的感染，所述病毒包括但不限于H1N1、H9N2、H3N2、H5N1、H2N2、H7N7和H7N1的任意毒株。

在另一具体实施方案中，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由甲型流感病毒引起的感染，所述病毒包括但不限于H1N1(A/HK/54/98，奥塞米韦敏感毒株)、H1N1(A/Vicotria/07159200/07，奥塞米韦抗性毒株)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)、H3N2(A/H3N2/1174/99)、H5N1(A/H5N1/97)、H1N1(A/54/98)、H9N2/G1和H6N1(A/Teal/HK/W312/97)。

在另一具体实施方案中，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由病毒引起的感染，所述病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒、鼻病毒、HIV病毒；肝炎病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、F型肝炎病毒和G型肝炎病毒；肿瘤病毒；人乳头瘤病毒(HPV)；人嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)；牛白血病病毒(BLV)；EB(Epstein-Barr)病毒；1型单纯疱疹病毒；2型单纯疱疹病毒；冠状病毒；以及脊髓灰质炎病毒。

在一个实施方案中，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由包括但不限于以下病毒引起的感染：水痘带状疱疹(也称作水痘或带状疱疹)病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和8型单纯疱疹病毒(也称作AIDS相关的卡波西肉瘤病毒)。在一个具体实施方案中，本发明用于治疗与带状疱疹病毒再活化(通常称作带状疱疹(shingles))有关的神经痛或神经衰弱。在另一个具体实施方案中，本发明用于治疗由病毒感染引起的慢性疲乏综合征。

如本领域已知的，病毒例如甲型流感病毒遗传变异通过两种主要机制发生。遗传漂变通过点突变发生，所述点突变因宿主免疫反应的选择性压力经常在抗原显著性位置发生，且遗传漂变涉及一个亚型的整个病毒基因组区段被另一个亚型取代。此外，包括人、猪、鸟、马、水栖动物和其他动物的许多不同类型的动物物种可被病毒感染。可用于预防、治疗或改善由病毒变异体引起的感染的治疗方法是本发明的实施方案。

此外，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于预防、治疗或改善由包括但不限于以下病原体引起的感染：细菌、真菌、寄生微生物、RNA、DNA、逆转录病毒载体、肿瘤/致癌病毒、阮病毒、原生动物、环境毒素，以及传染性病原体的结合物。

在一个实施方案中，本发明化合物、药物组合物和治疗方法可用于治疗或改善受试者的发热。

在一个实施方案中，治疗或改善病毒感染的本发明方法包括：

(i)对需要所述治疗的受试者给予有效量的选自以下的分离的化合物：

a)化合物A

b)化合物B

c)化合物C

d)化合物D

e)这些化合物的前药、代谢物和/或盐；以及

f)其任意结合物；

其中

R₁-R₁₇、R’₁-R’₆和R”₁-R”₁₃独立地为-H、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷基、烷氧基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺；

R₃”’-R₄”’独立地为-H、烷基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基、羟基烷基、羧基、烷氧羰基或甲酰胺；

(ii)测定所述受试者中一种或多种病毒的存在和/或水平；其中所述测定任选地在多个时间进行以监测随时间的变化；并且/或者任选地，以及

(iii)测定所述受试者中一种或多种生物标记物的存在和/或水平；其中所述测定任选在多个时间进行以监测随时间的变化。

一种类型病毒或多种类型病毒的存在和/或水平可由出于评价目的受试者例如患者的目的而获得的生物流体样本来测定。可在如下的生物样本中测量病毒的存在和/或水平，所述生物样本例如血液、组织、血清、血浆、尿液、唾液和泪液。在一个实施方案中，所述样本是血液样本。在另一个实施方案中，所述样本是尿液样本。在另一个实施方案中，所述样本是唾液样本。在另一个实施方案中，所述样本是体液样本。

一种类型病毒或多种类型病毒的存在和/或水平可以以本领域已知的方式测定，例如滴定法、病毒效价、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹和免疫分析。

一经病毒感染，在宿主细胞中迅速引起强烈的变化。在病毒感染引起的多种后果中，共同的特征是对病原体的细胞反应从细胞调亡死亡变化为自体吞噬₍₁₀₎。向自体吞噬状态的转换与病毒感染的人巨噬细胞中促炎细胞因子的诱导相关₍₁₀₎。例如，冠状病毒和脊髓灰质炎病毒能够诱导宿主细胞中有利于病毒的存活和复制的自体吞噬过程。

流感病毒感染的人巨噬细胞显示出凋亡的延缓发生和许多种促炎细胞因子和相关分子的超诱导(hyper-induction)。例如，发现H5N1/97病毒在分化的原代人血巨噬细胞中诱导高水平的促炎细胞因子₍₁₁₎。该细胞因子失调促进疾病的发病和严重性_(12-13)。此外，p38K，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，也在H5N1感染的巨噬细胞中对TNF-α超诱导起重要作用₍₁₄₎。流感例如H5N1和H9N2/G1感染也在人血巨噬细胞中触发IFN-β和IFN-α(包括IFN-α亚型例如IFNA1、2和8)的超诱导。另外，干扰素调节因子3(IRF3)在被H5N1病毒感染的人血巨噬细胞中对包括IFN-β、IFN-λ1和TNF-α在内的细胞因子的超诱导起重要作用₍₁₅₎。

与宿主细胞中促炎细胞因子的诱导有关的从凋亡死亡到自体吞噬状态的细胞反应的转换，也在其他致病感染中发现，如细菌、真菌和微生物感染，包括由细胞内微生物例如李斯特菌属(Listeria)和分枝杆菌(Mycobacteria)引起的感染。

本申请的化合物通过在感染过程中调节或辅助调节细胞因子和细胞因子相关分子而具有有益的免疫调节特性。而且，这些细胞因子和相关分子可作为生物标记物，例如用于确定病症的严重性和感染的进程、治疗方法适当性、剂量、给药途径，和/或是否需要给予其他药剂。

所述生物标记物包括但不限于：TNF-α；白细胞介素-1β(IL-1β)、COX-2、前列腺素(例如，PEG2)、干扰素例如干扰素-β(IFN-β)、干扰素-α(IFN-α)包括IFN-α亚型如IFNA1、2和8，以及干扰素-γ(IFN-γ)；p38K；IRF3；白细胞介素家族例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-16(IL-16)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-19(IL-19)、白细胞介素-20(IL-20)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-24(IL-24)、白细胞介素-25(IL-25)、白细胞介素-26(IL-26)、白细胞介素-27(IL-27)、白细胞介素-28(IL-28)、白细胞介素-29(IL-29)、白细胞介素-30(IL-30)、白细胞介素-31(IL-31)、白细胞介素-32(IL-32)、白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-34(IL-34)、白细胞介素-35(IL-35)；白细胞介素受体家族；巨噬细胞炎症蛋白家族例如巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)和巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)；以及免疫球蛋白例如IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。

免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和亚型例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。免疫球蛋白进一步包括单体或多聚体形式的分子，不论是由完整的抗体消化而来或通过其他方式产生。

在另一具体实施方案中，由本发明化合物调节的细胞因子和相关分子选自以下：TNF-α；IFN-β；IFN-α包括亚型1、2和8；IFN-γ；p38K；IRF3；IL-1；IL-2；IL-3；IL-5；IL-4；IL-6；IL-8；IL-10；IL-12；IL-13；IL-14；IL-17；IL-18；IL-23；IL-24；IL-25；IL27；1L-32；G-CSF；M-CSF；MCP-1；MIP-2；MIP-1α；IgA；IgG；IgM；IgD和IgE。

生物标记物的存在和/或水平可由获自目的受试者如患者的生物流体样本测定。病毒的存在和/或水平可在样本中测量，所述样本例如血液、组织、血清、血浆、尿液、唾液和泪液。在一个实施方案中，所述样本是血液样本。在另一个实施方案中，所述样本是尿液样本。在另一个实施方案中，所述样本是唾液样本。在另一个实施方案中，所述样本是体液样本。

在另一个实施方案中，生物标记物的水平可通过定量免疫检测方法测定，所述方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹、免疫分析、微点阵和放射免疫分析。

而且，可测量多个标记物。此外，多个标记物的分析可分别单独进行或同时进行。数个标记物可合并入一个测试用于高效处理来自受试者的多个样本。

在一个实施方案中，本发明提供了给予分离的化合物进行治疗的方法。本文所使用的“分离的”指已从其天然可存在的任意环境中移出的化合物。例如，分离的连翘酯苷A不是指在连翘中存在的连翘酯苷A化合物。在优选实施方案中，本发明的化合物为至少75％纯，优选至少90％纯，更优选超过95％纯，且最优选超过99％纯(基本上纯的)。

在一个具体实施方案中，本发明的治疗组合物包括在其他连翘酯苷化合物不存在的情况下的化合物A、B、C，其前药、代谢物或盐，及其任意结合物。

在另一具体实施方案中，本发明的治疗组合物包括在其他连翘酯苷化合物不存在的情况下，化合物A1(连翘酯苷A)、B1、C1、D1，其前药、代谢物或盐，及其任意结合物。

本发明还提供了通过给予以可与可药用载体结合的形式存在的治疗组合物或药物组合物的治疗方法。在该上下文中，化合物可为，例如，分离的或基本上纯的。术语“载体”指与化合物一起给予的稀释剂、辅剂、赋形剂或载体。这些药物载体可为无菌液体，如水和油，包括石油如矿物油，植物油如花生油、大豆油和芝麻油，动物油，或合成来源的油。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

合适的给药方法包括但不限于，口服、吸入或肠胃外给药，肠胃外给药包括静脉内、皮下、局部、经皮、真皮内、经粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眼眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔，以及作为待插入(暂时地或永久地)受试者体内的任意医学装置或物体的组分而共同给药。

在一个实施方案中，本发明方法还包括对受试者给予第二抗病毒剂，所述第二抗病毒剂包括但不限于，化合物如金刚烷和神经氨酸酶抑制剂，扎那米韦、奥塞米韦、帕拉米韦和奥司他韦；干扰素；核苷酸；siRNA；或其任意结合物；且其中所述第二抗病毒剂可在本发明化合物或药物组合物之前、之后或同时给予。

在一个具体实施方案中，本发明方法还包括对受试者给予第二抗病毒剂，所述第二抗病毒剂选自以下：扎那米韦、奥塞米韦、帕拉米韦、奥司他韦，及其任意结合物；其中所述第二抗病毒剂可在本发明化合物或药物组合物之前、之后或同时给予。

在另一具体实施方案中，本发明化合物或药物组合物可与至少一种第二抗病毒剂联合使用，任选地与疫苗形式的至少一种第二抗病毒剂一起给予；或在至少一种第二抗病毒剂之前、同时或之后给予。

合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述治疗组合物，如果需要，也可包含少量的润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。组合物可以常规粘合剂和载体如甘油三酯配制。合适的药物载体的实例记载于E.W.Martin编的″Remington′sPharmaceutical Sciences″。所述组合物包含治疗有效量的治疗组合物，以及合适量的载体，以便提供对患者恰当给药的形式。所述制剂应适合给药方式。

在一个实施方案中，根据常规步骤将所述组合物配制为适合对人局部注射给药的药物组合物。通常，用于局部注射给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当需要时，所述组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，所述成分以单位剂量形式单独或混合在一起提供，例如，作为在熔封容器例如标示活性剂量的安瓿或小袋中的干燥冻干粉剂或无水浓缩物。当所述组合物通过注射给予时，可提供一安瓿注射用无菌水或盐水以便可在给药之前将各成分混合。

本发明的治疗或药物组合物可制成中性或盐形式。可药用盐包括但不限于，盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

本发明还提供了对所述化合物的改性以便其在给予受试者后更加稳定，即，一旦给药则其具有比未改性的化合物更长的有效时间。所述改性是本领域技术人员熟知的，例如微囊化等。

在具体疾病、病症或障碍的治疗中有效的本发明治疗组合物或药物组合物的量将取决于该疾病、病症或障碍的性质并且可通过常规临床技术测定。通常，剂量从约0.001mg/kg至约2mg/kg变化。此外，体外测定可任选地用于帮助确定最佳剂量范围。制剂中要使用的准确剂量还取决于给药途径和疾病、病症或障碍的严重性，应根据从业医生的判断和每个患者的情况决定。有效剂量可由得自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推断出。例如，为了基于大鼠研究产生的数据获取对人的有效mg/kg剂量，将大鼠的有效mg/kg剂量除以六。

本发明还提供了包含装有一种或多种成分(例如，适合给药的化合物、载体)的一个或多个容器的药包或试剂盒。

给药方法也可根据中医药实践来实行。在具体疾病、病症或障碍的治疗中有效的制剂剂量和组成将通过常规临床技术根据该疾病、病症或障碍的性质确定。

处方量的中药可容易制成适合对人或动物给药的任意形式的药物。合适的形式包括，例如，酊剂、煎剂和干浸膏粉。它们可口服，或者经静脉注射、经粘膜或吸入施用。活性成分也可制成胶囊、粉剂、丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、栓剂、口服溶液、巴氏消毒的胃肠悬浮注射剂、小量或大量注射剂、冻干注射粉剂、巴氏消毒的注射粉剂等。所有上述方法是本领域技术人员已知的，它们记载于书中，且是草药从业人员惯常使用的。

酊剂通过将草药悬浮于醇溶液(例如葡萄酒或烈性酒)中而制备。悬浮一段时间后，可将液体(醇溶液)例如每天给药两次或三次，每次一茶匙。

煎剂是草药制剂的常见形式。其通常在粘土罐中制备，但也可在玻璃、搪瓷或不锈钢容器中制备。制剂可在水中浸泡一段时间，随后将其煮沸，并缓慢沸腾直至水量减少例如一半。

浸膏是草药主要组分的浓缩制剂。通常，所述主要组分通过将草药悬浮于恰当选择的溶剂中从草药中提取而得，所述溶剂通常为水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有机溶剂。

可通过浸渍、渗滤、再渗滤、逆流萃取、涡轮萃取，或通过二氧化碳超临界(温度/压力)提取来进一步促进提取过程。过滤除去草药残渣后，可将提取溶液进一步蒸发并由此浓缩得到软浸膏(extractum spissum)和/或通过喷雾干燥、真空干燥箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥最终得到干浸膏粉(extractum siccum)。软浸膏或干浸膏粉可进一步溶解在合适的液体中至所需给药浓度，或者加工成例如丸剂、胶囊剂、注射剂等形式。

在一个实施方案中，本发明方法还包括对受试者给予除本发明化合物以外的中药材，所述中药材包括但不限于连翘(Fructus forsythiae)、荆芥(Herba seu FlosSchizonepetae Tenuifoliae)、牛蒡子(Fructus Arctii Lappae)、淡豆豉(Semen SoiaePreparatum)、淡竹叶(Herba Lophatheri Gracilis)、甘草(Radix GlycyrrhizaeUralensis)和桔梗(Radix Platycodi Grandiflori)。

材料和方法

植物材料

草药薄荷(60g)、荆芥(40g)、连翘(100g)、牛蒡子(60g)、淡豆豉(50g)、淡竹叶(40g)、甘草(50g)、金银花(100g)和桔梗(60g)以及草药提取物由PuraPharmInternational(H.K.)Ltd提供。

生物活性分子的提取和分离

将获自Purapharm International(H.K.)Ltd.的连翘干燥并研磨成粉末。提取生物活性化合物的方法显示于图1中并说明如下。

简言之，将连翘(100g)干燥、研磨成粉末，然后提取两次以得到生物活性化合物。在每次提取过程中，将粉末悬浮于10x milli-Q水回流2小时。将每次提取的上清液收集、合并并在真空下蒸发至干燥以得到22.23g浅黄色粉末。将粉末再溶于MeOH并分级分离。

将所得MeOH提取物通过反相高效液相色谱法(HPLC)(Lichrospher 100RP C18EC5μm，250×4.6mm ID)使用流速为1mL/min的10％乙腈(CH₃CN)至90％CH₃CN的梯度洗脱进行纯化。

峰检测使用设定在210、254和280nm的Agilent 1200系列的快速扫描光电二极管阵列检测器实现。在200nm至300nm之间以1nm的间隔扫描洗脱峰以确定最大和最小吸光度。获得总共13个级分。

检测每个级分的生物活性。级分4显示出COX-2抑制作用，级分5显示出明显的抗病毒作用；因此，将它们进一步纯化。通过使用HPLC重复所述纯化过程，获得具有抗病毒作用的纯化合物(化合物A1)(6.1mg)和具有COX-2抑制作用的纯化合物(化合物D1)(2.8mg)。

分子结构的解析

所述纯化合物的结构通过¹H和¹³C NMR波谱测定法以及通过TOF-ESI-MS和EI-MS波谱测定法解析。NMR波谱在Bruker 500MHz DRX NMR波谱仪上记录，对于¹H以500MHz运行，对于¹³CNMR以125MHz运行，使用含有TMS的甲醇-d作为溶剂。化合物A1的精确的质量测定记录在micrOTOF II ESI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)上，将样本溶解于MeOH。化合物D1的精确的质量测定记录在5975C EI-MS(Agilent Technologies)上。

银翘散(YQS)提取物的制备

YQS提取物根据中国药典(2005)制备。简言之，将3g的薄荷和2g的荆芥用20倍的milli-Q水回流1小时提取两次。收集挥发油和水提取物。将残余物与包括连翘(5g)、牛蒡子(3g)、淡豆豉(2.5g)、淡竹叶(2g)和甘草(2.5g)的其他五种草药合并，随后用10倍的milli-Q水回流2小时提取两次。收集上清液并将其与之前的水提取物合并。随后将所得提取物在减压下冻干。将干燥的糊状物与金银花(5g)和桔梗(3g)合并，并随后用10倍的MeOH提取三次。获得约5g的MeOH提取物。

用于抗病毒生物分析的YQS提取物的分级分离

YQS的MeOH提取物通过反相HPLC (Lichrospher 100RPC18EC 5μm，250×4.6mmID)使用流速为1mL/min的10％乙腈(CH3CN)至90％CH3CN的梯度洗脱进行分级分离。

峰检测使用设定在210、254和280nm的Agilent 1200系列的快速扫描光电二极管阵列检测器实现。获得总共5个级分。

用于IL-1β生物分析的YQS提取物的分级分离

将YQS提取物通过反相HPLC (Lichrospher 100RP C18EC5μm，250×4.6mm ID)使用流速为1mL/min的10％乙腈(CH₃CN)至90％CH₃CN的梯度洗脱进行分级分离。

峰检测使用设定在210、254和280nm的Agilent 1200系列的快速扫描光电二极管阵列检测器实现。获得总共13个级分。

人流感病毒的制备

按照Lee et al.2005和Mok et al.2007_(14，16)中所记载的制备人流感H1N1病毒(A/HK/54/98(奥塞米韦敏感毒株)和A/Vicotria/07159200/07(奥塞米韦抗性毒株)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)，所述文献通过引证的方式全文纳入本文。

为简要说明，首先，将病毒从人中分离。通过有限稀释克隆分离的人流感H1N1病毒(A/HK/54/98(奥塞米韦敏感毒株)和A/Vicotria/07159200/07(奥塞米韦抗性毒株)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)。在MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞中制备种子病毒原液。

病毒感染

将MDCK细胞和巨噬细胞用指明的病毒以0.2或2的感染复数(m.o.i.)在37℃感染30min。随后取出含病毒接种物的上清液，且将所述细胞在MEM或巨噬细胞无血清培养基(Invitrogen)中孵育。

组织培养感染剂量(TCID₅₀)的测定

TCID分析之前，将MDCK细胞以2×10⁴细胞/孔接种于96孔板上。在感染后48小时从病毒感染的细胞收获培养上清液。制备连续2倍稀释的上清液样本，并将稀释过的样本用MDCK细胞孵育1小时以进行病毒吸附。

随后移除病毒接种物。将细胞洗涤一次并用补充有1μg/ml的TPCK-处理的胰岛素的MEM再补足。孵育四天后，将细胞用10％甲醛固定30min并用0.5％结晶紫染色以测定病毒诱导的细胞病变效应。使用Reed-Muench公式计算TCID₅₀效价。

免疫细胞化学染色

在感染后指定的时间点，将细胞固定，并将病毒核蛋白和M1蛋白用流感检测试剂盒(Influenza Detection Kit)(Oxoid)根据制造商说明进行染色。

蛋白质提取和蛋白质印迹分析法

用含蛋白酶抑制剂混合物的总裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mMNaCl，50mMNaF，10mMb-磷酸甘油酯，0.1mMEDTA，10％甘油，1％Triton X-100)制备全细胞裂解物。对于蛋白质印迹分析，将10μg蛋白在样品缓冲液(125mMTris，pH 6.8，4％十二烷基硫酸钠，20％甘油，5％β-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中加热变性，用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，且转移至硝酸纤维素膜上用于以ECL^TM蛋白质印迹检测试剂(GEHealthcare)溶液测定蛋白质水平。

透射电子显微术

感染后18小时，将细胞用2.5％戊二醛的二甲砷酸盐缓冲液(0.1M二甲胂酸钠-HCl缓冲液，pH 7.4)在冰上固定15min。随后将细胞自培养皿中刮出，通过以5000rpm离心3min收获沉淀。将细胞用2.5％戊二醛的二甲砷酸盐缓冲液在4℃固定过夜，随后重悬于0.1M蔗糖的二甲砷酸盐缓冲液中。用二甲砷酸盐缓冲液洗涤后，将细胞在室温下在含1％四氧化锇的二甲砷酸盐缓冲液中固定30min。将细胞洗涤三次且随后用梯度浓度的乙醇脱水。用环氧丙烷洗涤两次后，将细胞团埋入环氧树脂中。切成厚度为100nm的超薄切片。在透射电子显微镜(Philips EM208S)下检查细胞的超微结构特征。

定量逆转录PCR分析

根据制造商说明用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。cDNA用寡聚(dT)引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)由总RNA合成。编码COX-2或IL-1β的mRNA水平用TaqMan基因表达分析测定。

前列腺素E₂测定

感染后第48小时，收获细胞培养上清液，并且根据制造商说明用前列腺素E₂EIA试剂盒(Cayman)测量上清液中的前列腺素E₂(PGE2)水平。

实施例

以下是举例说明实施本发明的过程的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。

实施例1-连翘酯苷A和蓝花楹酮的提取和鉴定

通过使用反相HPLC将从连翘制备的MeOH提取物反复纯化而获得淡黄色粉末。详细过程总结于图1中。

借助使用连续HPLC的生物活性引导的纯化，称为化合物A1的抗病毒分子在约6.8min时作为单一化合物(＞95％纯度)洗脱出，其在220、290和330具有最大UV吸光度(图2)。化合物A1的¹³CNMR谱如图4中所示，显示出以下的信号：δ131.5(C-1)，116.5(C-2)，146.2(C-3)，144.8(C-4)，117.2(C-5)，121.4(C-6)，72.4(C-α)，36.8(C-β)，104.6(C-1’)，75.3(C-2’)，76.0(C-3’)，72.5(C-4’)，74.9(C-5’)，67.8(C-6’)，102.4(C-1”)，72.1(C-2”)，72.4(C-3”)，74.1(C-3”)，70.0(C-4”)，18.1(C-5”)，127.8(C-1”’)，115.2(C-2”’)，147.0(C-3”’)，149.9(C-4”’)，116.6(C-5”’)，123.2(C-6”’)，147.7(C-7””)，114.8(C-8”’)，168.4(C-9”’)。化合物A1在其HR-ESI-MS中在m/z 623处显示出[M-H]^-离子峰。

将其波谱数据与文献中所报道的数据对比，化合物A1鉴定为连翘酯苷A。连翘酯苷A的化学结构显示于图6A中。连翘酯苷A在最初干燥的草药(连翘)中的含量百分比为1.24％(w/w)。使用反相HPLC将从连翘制备的MeOH提取物反复纯化获得了2.8mg的黄色无定形粉末(化合物D1)。详细过程总结于图1中。借助使用连续HPLC的生物引导的纯化，抑制COX-2表达的分子在约10.75min时作为单一化合物(＞95％纯度)洗脱出，其在230具有最大UV吸光度(图3)。化合物D1的¹³C NMR谱显示出以下的信号：δ45(C-7)，52(C-9)，68(C-4)，128(C-2，C-6)，152(C-3，C-5)，171(C-8)，187(C-1)(图5)。化合物D1显示出以下位置的质荷比(m/z)：182，169，150，122，109(100)，94，81，74，69，43。将其波谱数据与文献报道的数据相比，化合物D1鉴定为蓝花楹酮，其化学结构示于图6B(Ogura et al.，1976)中。蓝花楹酮在干燥草药中的含量百分比为0.036％(w/w)。

实施例2-连翘酯苷A的细胞毒性的测定

确定连翘酯苷A(化合物A1)对流感病毒复制的抑制作用后，按照如下所述检查连翘酯苷A(化合物A1)的细胞毒性。简言之，将Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞以1x10⁵细胞/孔的密度接种于24孔板并孵育18小时，然后加入浓度为100ug/ml的连翘酯苷A (化合物A1)，或在对照中加入二甲基亚砜(DMSO)。

在37℃、5％CO₂条件下孵育48小时后，通过噻唑蓝溴化四唑盐(MTT)测定法测量细胞活力。首先，将MTT以0.1mg/ml的最终浓度加入细胞中。孵育90分钟后，除去培养上清液，将每个孔用异丙醇处理以进行细胞固定。将MTT代谢产物甲臢(formazan)持续振荡5分钟溶于异丙醇。分别在560nm和670nm下测量甲臢和背景的光密度。

细胞毒性指数如下计算：

(λ560_样本1-λ670_样本1)/(λ560_DMSO-λ670_DMSO).

结果如表1所示，其揭示了连翘酯苷A(化合物A1)未显示出对MDCK细胞的明显细胞毒性。

表1.连翘酯苷A的细胞毒性

实施例3-连翘酯苷A对病毒的抑制作用

为了测定连翘酯苷A(化合物A1)对病毒的抑制作用，将MDCK细胞用人流感病毒感染，并且根据如下举例说明的过程进行病毒效价(TCID₅₀)生物测定。

简言之，将MDCK细胞以1×10⁵细胞/孔接种于24孔板上，并用包括H1N1(A/HK/54/98)(奥塞米韦敏感性毒株)、H1N1(A/Vicotria/07159200/07)(H1N1-R)(奥塞米韦抗性毒株)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)的人流感病毒分别以2的感染复数(m.o.i.)感染30分钟。之后，将细胞用PBS洗涤一次以除去未吸附的病毒，并用浓度为100ug/ml的补充有最低基础培养基(MEM)的连翘酯苷A(化合物A1)处理。

用连翘酯苷A(化合物A1)或DMSO孵育48小时后，收集细胞培养上清液，并对其进行病毒效价(TCID₅₀)分析以测量连翘酯苷A(化合物A1)对流感病毒复制的抑制作用。简言之，将两倍连续稀释的上清液加入MDCK细胞中。将细胞于37℃、5％CO₂条件下孵育1小时以进行病毒吸附。然后用MEM或磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞以移除未吸附的病毒接种物，并用添加有1ug/ml N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶的新鲜MEM补足。将细胞于37℃、5％CO₂条件下再孵育4天，随后用10％甲醛固定30分钟，并用0.5％结晶紫染色以检查病毒诱导的细胞病变效应。TCID₅₀效价使用Reed-Muench公式计算，所述公式记载于Methods and Techniques in Virology，1993₍₁₇₎中，所述文献通过引证的方式全文纳入本文。

结果如图7所示，其揭示了MDCK细胞中的病毒复制被100μg/ml的连翘酯苷A(化合物A1)抑制。具体而言，与DMSO处理的细胞相比，流感病毒H1N1(A/HK/54/98)、H1N1(A/Vicotria/07159200/07)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)的复制分别被连翘酯苷A(化合物A1)抑制约15、3、24和12倍(图7A-D)(来自三个试验的代表性结果)。用H1N1(A/HK/54/98)感染细胞后，还将达菲(Tamifiu)(100μM)加入所述细胞中作为对照(图7E)。与稀释剂(PBS)处理的细胞相比，病毒抑制超过30倍(图7E)。

实施例4-连翘酯苷A对原代人血巨噬细胞中流感病毒的抑制作用

将原代人血巨噬细胞用包括H1N1(A/HK/54/98)、H9N2(A/Quail/HK/G1/97)和H3N2(A/H3N2/1174/99)的人流感病毒进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用连翘酯苷A(化合物A1，100μg/ml)或DMSO孵育48小时。之后，收集细胞培养上清液，通过在MDCK细胞中进行滴定来测量病毒效价(TCID50)(来自三个试验的代表性结果)。结果如图8所示，其证明连翘酯苷A(化合物A1)在原代人血巨噬细胞中具有抗流感病毒作用。

实施例5-通过免疫细胞化学和蛋白印迹分析表明的连翘酯苷A对流感病毒复制的抑制作用

本实施例证明连翘酯苷A抑制流感病毒复制。将MDCK细胞用人流感病毒H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为0.2。随后将细胞用连翘酯苷A(化合物A1，100μg/ml)或DMSO孵育6或10小时。之后，将细胞固定并将核蛋白和M1蛋白用流感检测试剂盒(Influenza Detection Kit)(Oxoid)进行染色。对表达病毒蛋白的细胞数目进行计数并计算表达病毒蛋白的细胞的百分数。

如图9(A&B)所示，感染后6小时(hour post-infection，h.p.i.)，与对DMSO或连翘酯苷A(化合物A1)处理后的表达病毒蛋白的细胞百分数相比，未发现显著差异。然而，从6h.p.i至10h.p.i.，用DMSO处理时，表达病毒蛋白的细胞的数目增加约100％；而用连翘酯苷A(化合物A1)处理时，百分数仅增加约15％。这表明连翘酯苷A(化合物A1)减少被病毒感染的细胞的数目。

将MDCK细胞用人流感病毒H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2，或进行假感染。之后，将细胞用连翘酯苷A(化合物A1)(100μg/ml)或DMSO孵育。在2、4、9或24h.p.i收获蛋白质。

流感M1蛋白的表达通过蛋白印迹分析法进行分析。肌动蛋白用作上样对照。检查病毒M1蛋白的表达水平，通过Quantity One软件(Bio-Rad)测量带强度。相对强度通过将M1强度归一化为肌动蛋白强度而确定。

如图9C所示，与用DMSO处理的细胞相比，用连翘酯苷A(化合物A1)处理的细胞中的M1蛋白表达水平更低。在2h.p.i.，M1在DMSO处理的细胞中的相对强度比连翘酯苷A处理的细胞中的M1相对强度高超过四倍。此外，在2-24h.p.i.的时期，所述相对强度在DMSO处理的细胞中从0.13增加至1.7。相反，在连翘酯苷A(化合物A1)处理的细胞中，所述相对强度仅在24h.p.i.达到0.39。这些结果进一步表明用连翘酯苷A进行处理降低了M1蛋白表达并减少了病毒载量。

实施例6-由电子显微术表明的连翘酯苷A对流感病毒复制的抑制作用

本实施例证明连翘酯苷A抑制流感病毒复制。将MDCK细胞用人流感病毒H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用连翘酯苷A(化合物A1)(100μg/ml)(C-D)或DMSO(A-B)孵育18小时。随后将细胞固定并通过透射电子显微术检查超微结构。

如图10中所示，在DMSO处理的细胞(A-B)中，大多数病毒体已完全从细胞中分离。相反，在连翘酯苷A(化合物A1)处理的细胞中，一部分病毒体仍附着于细胞(C-D)。

将感染的细胞在透射电子显微术下以更高放大倍数进一步观察。有很小一部分的病毒粒子仍与用DMSO孵育的细胞相连(B，箭头)，它们通过细颈(thin neck)附着，。相反，在连翘酯苷A处理的细胞中，出芽的病毒体仍通过粗柄(thick stalk)连接至细胞(D，箭头)。这表明由于连翘酯苷A(化合物A1)的处理，出芽过程放慢或异常。

实施例7-蓝花楹酮对环氧化酶2(COX-2)和流感病毒感染的抑制作用

将原代人血巨噬细胞用H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用蓝花楹酮(化合物D1)或DMSO孵育3小时。之后，收获总RNA并通过TaqMan基因表达分析(TaqMan Gene Expression assay)检查COX-2mRNA水平。

如图11A所示，蓝花楹酮(化合物D1)抑制H9N2/G1感染后的COX-2mRNA水平并且所述抑制以剂量依赖的方式发生。蓝花楹酮在10μg/ml下抑制COX-2mRNA水平约20％，在20μg/ml下抑制40％。

用蓝花楹酮(化合物D1)孵育细胞48小时后，通过前列腺素E₂EIA试剂盒(Prostaglandin E₂EIA Kit)(Cayman)测量细胞培养上清液中的前列腺素E₂(PGE2)水平。图11B显示出，与假处理的细胞相比，单独用蓝花楹酮(化合物D1)处理未被感染的巨噬细胞不引起PGE2水平的任何改变。用H9N2/G1感染显著诱导PGE2水平。与RNA结果一致，蓝花楹酮(化合物D1)以剂量依赖的方式抑制PGE2水平。

实施例8-YQS配方对流感病毒复制的抑制作用

将MDCK 细胞用H1N1(A/HK/54/98)或H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)进行感染，m.o.i.为2。随后将细胞用银翘散(YQS)(100μg/ml)或DMSO孵育48小时。之后，收集细胞培养上清液，通过在MDCK细胞中进行滴定来测量病毒效价(TCID₅₀)。

图13A显示出YQS抑制H1N1和H9N2/G1病毒复制。除YQS之外，将细胞在用H9N2/G1(A/Quail/HK/G1/97)感染后用YQS级分(F1-F5)(100μg/ml)(如图12所示)或DMSO孵育。

48小时孵育后，收集细胞培养上清液，通过在MDCK细胞中进行滴定来测量病毒效价(TCID₅₀)。如图13C所示，级分F2-F5显示出病毒抑制作用。在F2-F5之中，级分F2和F3具有最强的抗病毒作用。

实施例9-YQS配方对白细胞介素-1β的诱导

将原代人血巨噬细胞用H1N1(A/HK/54/98)进行感染，m.o.i.为2，或进行假感染。随后将H1N1感染的细胞用YQS(100μg/ml)或DMSO孵育3小时。之后，收获总RNA，通过TaqMan基因表达分析检查白细胞介素(IL)-1βmRNA水平。图15A显示出YQS提高由H1N1诱导的IL-1βmRNA的产生。

将原代人血巨噬细胞在用H1N1感染后用YQS级分[S1-S-13，100μg/ml](如图14所示)或DMSO孵育。图15B显示出，与假感染的细胞相比，H1N1感染使IL-1βmRNA水平增加约3倍(DMSO)。与假感染的细胞相比，用YQS级分S11处理使IL-1β水平增加约20倍。

本文所列举的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引证的方式纳入本文，就如同每份参考文献分别且具体地被指明是通过引证的方式纳入本文且在本文中以其全部内容提出。

在描述本发明的上下文中所使用的术语“一(a，an)”和“所述(the)”和类似指代物应解释为涵盖单数和复数形式，除非在本文中另外说明或明显与上下文相悖。

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应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，对本领域技术人员暗示了基于它们的多种修改或改变，这些修改或改变包括在本申请的精神和范围内。

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17.Methods and Techniques in Virology 1993，edited by Payment P andTrudel M，Marcel Dekker Inc.pp.32-33.

Claims

1.组合物在制备用于预防和/或治疗受试者流感病毒感染的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的选自以下的分离的化合物：

a)化合物D1

b)a)的盐。

2.权利要求1的用途，其中所述受试者是人、猪或鸡。

3.权利要求1的用途，预防和/或治疗由甲型流感病毒引起的感染。

4.权利要求3的用途，预防和/或治疗由选自以下的甲型流感病毒引起的感染：H1N1、H9N2、H3N2、H5N1、H2N2、H7N7和H7N1。

5.权利要求3的用途，预防和/或治疗由选自以下的甲型流感病毒引起的感染：A/HK/54/98，奥塞米韦敏感的毒株H1N1、A/Vicotria/07159200/07，奥塞米韦抗性毒株H1N1、A/Quail/HK/G1/97H9N2、A/H3N2/1174/99H3N2、A/H5N1/97H5N1、A/54/98H1N1、H9N2/G1和A/Teal/HK/W312/97H6N1。

6.权利要求1的用途，其中所述药物是以口服方式给药。

7.一种用于预防和/或治疗流感的草药制剂，所述草药制剂由相对重量的以下草药组成：连翘25％-35％、金银花25％-35％、牛蒡子1％-7％或15-25％、桔梗1％-7％、薄荷1％-7％、淡豆豉1.2％-7％、甘草8％-20％、淡竹叶1％-5％和荆芥1％-5％组成。

8.权利要求7所述的草药制剂，由相对重量的以下草药组成：连翘30％、金银花30％、牛蒡子5％、桔梗5％、薄荷5％、淡豆豉5％、甘草10％、淡竹叶5％和荆芥5％组成。

9.权利要求7所述的草药制剂，由以下相对重量的草药组成：连翘30％、金银花20％、牛蒡子20％、桔梗4％、薄荷4％、淡豆豉4％、甘草10％、淡竹叶4％和荆芥4％组成。

10.一种用于预防和/或治疗病毒感染的草药制剂，所述草药制剂由以下相对重量的草药组成：连翘25％-40％、金银花25％-40％、牛蒡子15-25％和甘草10％-20％组成。

11.一种用于预防和/或治疗病毒感染的草药制剂，所述草药制剂由以下相对重量的草药组成：连翘33％、金银花17％、牛蒡子33％和甘草17％组成。

12.权利要求7至11之任一项所述的草药制剂在制备用于预防和/或治疗流感的药物中的用途。

13.权利要求1的用途，用于预防或治疗奥塞米韦抗性的流感病毒感染。

14.权利要求13的用途，用于预防或治疗奥塞米韦抗性的甲型流感病毒感染。

15.权利要求7的草药制剂，其中淡豆豉的相对重量为3％-7％。

16.权利要求12的用途，用于预防和/或治疗甲型流感。

17.权利要求16的用途，用于预防和/或治疗H1N1、H9N2、H3N2、H5N1、H2N2、H7N7和/或H7N1。