CN102875670A

CN102875670A - 小鼠腹水诱导剂及其应用

Info

Publication number: CN102875670A
Application number: CN2012103871768A
Authority: CN
Inventors: 侯倩女; 宋秀丽; 俞宏; 顾斌; 张铭; 宋新华
Original assignee: HANGZHOU HUAAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU HUAAN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-10-11
Also published as: CN102875670B

Abstract

本发明提供了一种新型的小鼠腹水诱导剂，其有效成分为液体石蜡、羊毛脂、卡介苗、白介素及人B淋巴细胞刺激因子。该诱导剂可直接刺激杂交瘤细胞在小鼠体内快速增殖，并大量分泌抗体。腹水生产周期短，腹水量多，效价高。将本品用于小鼠腹水抗体的大量制备，节约了成本，具有可观的经济效益。

Description

小鼠腹水诱导剂及其应用

技术领域

本发明涉及抗体制备领域，具体地说，涉及小鼠腹水诱导剂及其应用。

背景技术

目前，小鼠腹水抗体制备中一般采用与杂交瘤SP20相同系的小鼠。常用的诱导剂为pristane和液体石蜡。这两种诱导剂都属于免疫抑制剂，抑制动物的正常免疫功能从而促进肿瘤生长（Hoogenraad,N.J.and Wraight,C.J.,The effect of Pristane on Pristane onascites tumor formation and monoclonal antibody production,MethodsEnzymol.,121,375,1986）。采用pristane进行诱导，每只小鼠可以采集约5-10ml腹水。然而诱导剂pristane成本很高，不适合大规模生产。另外，在免疫性动物疾病模型中也常使用pristane，比如关节炎，pristane肾病等，这表明pristane本身会对动物造成一定的健康损害，不符合动物福利的要求。此后，用液体石蜡或者不完全佐剂代替pristane。尽管液体石蜡成本低，但用其诱导小鼠后，小鼠体内易长实体瘤，易导致动物窘迫死亡，且腹水产量不高，约2-5ml。对于规模化生产来说，既费时又增加了成本。以上两种诱导剂，诱导周期在7-15天，腹水生产时间较长，一般诱导后10-21天开始采集腹水。相比而言，不完全佐剂比上述两种诱导剂的诱导效果更好，但这种预刺激方法会给腹水带来更多的细胞因子和其他炎性介质的污染。因此，开发新型的小鼠腹水诱导剂成为小鼠腹水抗体制备领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的小鼠腹水诱导剂。

本发明的另一目的是提供该新型的小鼠腹水诱导剂在小鼠腹水抗体制备中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种小鼠腹水诱导剂，其有效成分为液体石蜡、羊毛脂、卡介苗、白介素及人B淋巴细胞刺激因子。

各组分按重量份计为：

优选地，各组分按重量份计为：

本发明还提供上述小鼠腹水诱导剂的制备方法，将液体石蜡、羊毛脂、卡介苗、白介素及人B淋巴细胞刺激因子按比例混合均匀，-20℃保存。

本发明进一步提供上述小鼠腹水诱导剂在小鼠腹水抗体制备中的应用：用诱导剂腹腔注射小鼠，2-3天后，腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，测定腹水中抗体效价后，进行抗体纯化。

小鼠腹水抗体制备中优选使用的小鼠为BALB/c小鼠，小鼠鼠龄为40-80天（优选60天）。每只小鼠的诱导剂注射剂量为0.5ml/25g（按体重计），每只小鼠注射1×10⁶-2×10⁶个杂交瘤细胞。

本发明的优点及有益效果：

本发明的新型小鼠腹水诱导剂可直接刺激杂交瘤细胞在小鼠体内快速增殖，并大量分泌抗体。腹水生产周期短，腹水量多，效价高，小鼠腹腔很少出现实体瘤，因此不容易受到实体瘤压迫造成小鼠过早死亡。将本品用于小鼠腹水抗体的大量制备，节约了成本（成本降低5倍以上），节省了小鼠的饲养费及人工成本，具有可观的经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例6中westorn blot检测小鼠腹水抗体的结果；其中，1-3为A组小鼠腹水抗体检测结果，腹水稀释比例分别为1:500、1:1000和1:2000，4-6为B组小鼠腹水抗体检测结果，腹水稀释比例分别为1:1000、1:5000和1:10000。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1小鼠腹水诱导剂的制备

诱导剂配方为：

制备方法：将液体石蜡、羊毛脂、卡介苗、白介素及人B淋巴细胞刺激因子按比例混合，-20℃保存。

实施例2小鼠腹水诱导剂的制备

诱导剂配方为：

制备方法同实施例1中的描述。

实施例3小鼠腹水诱导剂的制备

诱导剂配方为：

制备方法同实施例1中的描述。

实施例4小鼠腹水诱导剂的制备

诱导剂配方为：

制备方法同实施例1中的描述。

实施例5小鼠腹水诱导剂的制备

诱导剂配方为：

制备方法同实施例1中的描述。

实施例6小鼠腹水诱导剂在小鼠腹水抗体制备中的应用

1BALB/c小鼠诱导

采用BALB/c小鼠，实验分成A、B两组，每组20只，雌雄各半，鼠龄60天。A组施用常规诱导剂（液体石蜡），B组施用实施例1中制备的小鼠腹水诱导剂。A、B组每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml的诱导剂。饲养3天。

2细胞注射及腹水采集

将A、B二组实验小鼠，每只小鼠腹腔注射1×10⁶个分泌针对GFP蛋白的杂交瘤细胞（B2-F7）。

1）A组小鼠饲养2周左右，被毛松，精神状态极差，腹部膨大有结节，平均每只采集腹水3ml。解剖结果显示，小鼠腹腔长满实体瘤。

2）B组小鼠饲养7天，腹部膨大明显，被毛紧，开始采集腹水，隔天可以采集1次，采集3次脱臼处死小鼠。平均每只小鼠腹水量可以达到20ml。解剖结果显示，有个别小鼠腹腔长少量几个实体瘤外，其余未见长实体瘤。

3腹水鉴定方法

3.1ELISA检测腹水抗体滴度

用包被缓冲液（coating buffer）稀释抗原至1μg/ml，按50μl/孔的量加入酶标板的各孔中，4℃过夜。

洗涤，，每孔用200μl洗涤缓冲液洗一次。封闭，将洗后的酶标板以60μl/孔加入1%牛血清白蛋白（BSA），然后37℃孵育1h。将待测腹水按1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000稀释后分别加入酶标板中，37℃孵育1小时。

用洗涤缓冲液洗板2次。每孔中加入用1%BSA稀释的HRP酶标二抗50μl，37℃孵育45min。

用洗涤缓冲液洗板3次。加入TMB底物（A液、B液以1:1体积比混合，临用前配制）100μl/孔，37℃孵育5min。加终止液：每孔加入2M硫酸100μl终止。

观察记录结果：用酶标仪测OD_450nm值。每种腹水进行两个复孔检测。

结果显示，A组：腹水中抗体效价，稀释度为1:10000，抗体效价0.3-0.5；B组：腹水中抗体效价，稀释度为1:240000，抗体效价可达到1.0以上。

3.2免疫印迹（westorn blot）检测

(1)灌胶

①蒸馏水清洗灌胶玻璃板，竖直晾干。

②配制10%分离胶10ml，加TEMED 10μl、10%过硫酸铵100μl，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2-3mm（预先做好标记），用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气，室温静置45min待胶完全聚合。

③待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。

④配制4%浓缩胶5ml，加TEMED 5μl、10%APS 50μl，混匀立即灌胶，灌至顶部，并垂直插入Teflon齿梳，室温静置20min待胶聚合。

⑤待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。

(2)电泳

①取一定体积的待测样品，与等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。

②将上样液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，12000转/min离心5min。

③吸取上清加入凝胶孔中，留一孔加3μl预染的Marker，加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用80v恒压电泳，约20min，当指示剂溴芬兰进入分离胶后改用110v恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。

(3)转印蛋白及免疫检测

①在电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH₂O漂洗1min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。

②撬开胶板，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡30min。

③按黑面（负极）→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→红面（正极）的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。

④接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。

⑤将电转仪置于冰水中，100V恒压转膜1h。

⑥转膜结束后，快速取出PVDF膜，放入5%脱脂奶粉，室温封闭2h。

⑦取出膜，于摇床上用ddH₂O洗膜8min×1次。

⑧孵育袋中加入TBST稀释的一抗anti-CUL4A/B(1:1000)，室温孵育2h。

⑨TBST洗膜8min×3次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（1：10000），室温孵育1h。

⑩TBST洗膜8min×3次。PVDF膜加入预混的化学发光检测试剂(联科生物）室温反应3min后甩去多余的液体，用塑料薄膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光1min、显影、定影。

A、B二组与杂交瘤上清一样，均有一条相同分子量的条带。但A组腹水稀释度为1:1000，而B组腹水稀释度可达1:5000-10000（图1）。

4结果分析

A组使用常规诱导剂，会刺激小鼠长实体瘤，再由实体瘤分泌抗体，因此小鼠诱导时间长，产腹水时间长，腹水量少，效价低，小鼠被实体瘤压迫后容易窒息死亡。

B组使用本发明的小鼠腹水诱导剂，诱导剂直接刺激杂交瘤细胞在小鼠体内快速增殖，并大量分泌抗体，因此腹水生产周期短，腹水量多，效价高，小鼠又不容易被实体瘤压迫而死亡。

采用实施例2-5中制备的小鼠腹水诱导剂，针对多批不同抗体的杂交瘤细胞注射实验后，得出的结果近似。

将本发明的小鼠腹水诱导剂用于小鼠腹水抗体的大量制备，节约了成本，可使成本降低5倍以上，节省了小鼠的饲养费及人工成本，具有可观的经济效益。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种小鼠腹水诱导剂，其特征在于，其有效成分为液体石蜡、羊毛脂、卡介苗、白介素及人B淋巴细胞刺激因子。

2.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，其含有以下重量份的各组分：

3.根据权利要求2所述的诱导剂，其特征在于，其含有以下重量份的各组分：

4.权利要求1-3任一项所述小鼠腹水诱导剂的制备方法，其特征在于，将液体石蜡、羊毛脂、卡介苗、白介素及人B淋巴细胞刺激因子按比例混合，-20℃保存。

5.权利要求1-3任一项所述小鼠腹水诱导剂在小鼠腹水抗体制备中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用诱导剂腹腔注射小鼠，2-3天后，腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，小鼠腹水抗体制备中使用的小鼠为BALB/c小鼠。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，小鼠鼠龄为40-80天。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，每只小鼠腹腔注射诱导剂0.5ml/25g（按体重计）。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，每只小鼠腹腔注射0.6×10⁶-3×10⁶个杂交瘤细胞。