CN102875667A - 一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HIV-1肽Env_120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明成功筛选出HIV-1肽Env_120-128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8⁺T细胞中，获得表达HIV-1肽Env_120-128特异TCR的CD8⁺T细胞。该经过TCR基因修饰的CD8⁺T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别HIV肽Env_120-128并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的应用价值，可为艾滋病及艾滋/结核共感染疾病的过继细胞免疫治疗开辟新径。

Description

一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种HIV-1肽特异性T细胞受体（TCR），以及利用该TCR制备得到的一种用于艾滋及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8⁺T细胞及其在制备抗艾滋及艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）即艾滋病病毒，入侵人体后将严重破坏人体免疫力，使各种罕见感染及癌症得以在人体内发生，最终形成艾滋病（获得性免疫缺陷综合症）。HIV主要存在于HIV感染者或艾滋病患者体液中，任何能够引起体液交换的行为都有传播HIV的可能，包括性接触传播、血液传播及母婴传播。自上世纪80年代HIV开始在人类中传播以来，将近6000万人感染，其中2500万人死亡。

目前尚无可根除HIV、根治艾滋病的药物，也没有证据表明人体会对HIV产生保护性免疫，因此大多数艾滋病病人死于反复继发感染及肿瘤。艾滋病的治疗一方面是抑制病毒在体内的繁殖，增强免疫功能；另一方面是防治机会性感染，缓解症状，延长生命。早期治疗和预防其它感染可延缓病程发展，提高生活质量。目前临床上常用的治疗方法有以下几个方面：（1）联合使用几种抗逆转录毒药物的“鸡尾酒疗法”实施抗逆转录病毒治疗，其在降低发病率和病死率、提高生活质量方面有明显作用；（2）针对各种机会性感染的抗生素对症治疗与预防，包括肿瘤的化疗和对症治疗；（3）其他，包括免疫调节治疗、营养支持治疗和中医药治疗等。

HIV-1肽Env_120-128，即艾滋病病毒HIV-1包膜蛋白gp160的第120-128位氨基酸构成的肽表位（KLTPLCVTL），存在于80%的多变性HIV-1肽序列中，在HIV-1 B亚型病毒株中具有最高度的保守性，可被表达HLA-A*0201的个体识别。

T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区（V区），恒定区（C区），跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区（Vα、Vβ）又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1、CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。

根据TCR Vα、Vβ基因的同源性，可将80多个TCR Vα基因分为32个家族、60多个TCR Vβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布（表现为单峰）的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCR CDR3序列。

发明内容

本发明的目的在于：筛选出HIV-1肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR基因，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8⁺ T细胞中，获得表达HIV-1肽Env_120-128特异TCR的CD8⁺ T细胞，以及该经过TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞在制备抗HIV药物中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

HIV-1肽Env_120-128特异性T细胞受体（TCR），包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β链的CDR3区含有SEQ ID NO: 4所示的序列。

优选的，所述HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的α链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

优选的，所述HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的α链氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

编码HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的基因。

一种HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。

一种重组逆转录病毒载体，含有编码HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的基因。

一种重组逆转录病毒载体，含有SEQ ID NO: 13所示基因。

优选的，上述重组逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

上述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

上述逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞。

HIV-1肽Env_120-128特异性TCR，编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒，该逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞在制备抗艾滋病、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。

实现上述技术方案的具体步骤流程如下：

1、筛选HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR

① 采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；

② 计数PBMC，调整PBMC数目为1×10⁶/孔, 每孔细胞分别加入含HIV肽Env_120-128 50ng/ml的10% FBS-1640培养基2ml；

③ 培养2h后，加入25U/ml IL-2, 第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天；

④ 磁珠分选出CD8⁺ T细胞，提取其mRNA，并逆转录为cDNA；

⑤ 互补决定区3（complementarity determining region 3，CDR3）谱型分析检测刺激前后CDR3谱型，找出刺激后呈单克隆增生的HIV肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR α、β基因家族。

2、构建重组逆转录病毒载体

① 根据GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区（variable region，V）和下游恒定区（constant region，C）基因序列，设计TCR α、β链全长基因上、下游引物，扩增出HIV肽特异的TCR α、β全长基因。

② 设计含TCR α、β链C区下游与CD3ζ分子融合位点的重组引物，将HIV肽特异的TCR α、β基因片段与CD3ζ分子进行融合。该步骤的目的在于减少内外源性TCR α、β链的错配，因为CD8⁺ T细胞存在内源性TCR α、β基因的表达，通过以CD3ζ链替换α、β全长基因部分C区可以促使外源性α与β基因表达的蛋白正确装配成TCR蛋白分子并稳定表达在CD8⁺ T细胞表面，同时可以避免竞争结合CD8⁺ T细胞表面的CD3分子，增强内外源性TCR的信号传导功能，提高修饰后CD8⁺ T细胞的抗HIV活性。当然，此处还可以采取其他策略来减少内外源性TCR α、β链的错配，如：将α、β链C区的9个氨基酸分别用鼠C区相应位点的氨基酸替换（Luo W, Zhang XB, Huang YT, Hao PP, Jiang ZM, Wen Q, Zhou MQ, Jin Q, Ma L. Development of genetically engineered CD4⁺ and CD8⁺ T-cells expressing TCRs specific for a 38 kDa M. tuberculosis antigen. J Mol Med. 2011,89(9):903-13）；在外源性α、β基因C区引入二硫键（Boulter, J.M. et al. (2003) Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng. 16, 707-711）；突变外源性α、β基因C区关键氨基酸以改变α、β链之间的静电荷（Voss, R.H. et al. (2008) Molecular design of the Cab interface favors specific pairing of introduced TCRab in human T cells. J. Immunol. 180, 391-401）；将外源性α、β基因V区合并为一条单链TCR并与CD3ζ链融合（Willemsen, R.A. et al. (2000) Grafting primary human T lymphocytes with cancer-specific chimeric single chain and two chain TCR. Gene Ther. 7, 1369-1377）；利用2A连接外源性α、β基因实现平衡表达（Leisegang M, Engels B, Meyerhuber P, Kieback E, Sommermeyer D, Xue SA, Reuss S, Stauss H, Uckert W. Enhanced functionality of T cell receptor-redirected T cells is defined by the transgene cassette. J Mol Med. 2008, 86:573-583.）等。

③ 通过F2A上的AgeI酶切位点将HIV肽特异的α-CD3ζ、β-CD3ζ融合基因进行拼接。

④ 将测序正确的hVβhCβ-CD3ζ-F2A-hVαhCα-CD3ζ融合基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP并酶切鉴定。

⑤采用脂质体转染法，将pMX-hVβhCβ-CD3ζ-F2A-hVαhCα-CD3ζ -IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293包装细胞。

⑥收集48h-72h病毒上清，低温超速离心浓缩纯化病毒。

⑦重组病毒感染NIH3T3细胞，流式细胞术检测病毒滴度，计算公式：病毒滴度（IU/ml）=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量（ml）。

3、鉴定重组逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗结核和抗HIV活性

① 采用Ficoll密度梯度离心法，分离HLA-A*0201型供者外周血PBMC；

② 磁珠分选CD8⁺ T细胞；

③ IL-2和抗CD3单抗活化分选出的T细胞；

④ 按感染复数（multiplicity of infection, MOI）=13将上述重组逆转录病毒感染CD8⁺ T细胞；

⑤ 使用IL-2和抗CD3单抗刺激感染后的CD8⁺ T细胞；

⑥ 流式细胞术检测病毒感染后GFP表达阳性细胞的百分比；

⑦ 测定病毒转染的CD8⁺ T细胞的抗HIV活性：

实验设置：阴性对照组（HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+树突状细胞（dendritic cells，DC））、未转染组（未转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、空载体转染组（空载体转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、无关肽组（HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+负载CMVpp65_495-503的DC）、HIVTd+HIV-DC组（HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）。

用酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测上述各组细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α的分泌水平；用时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmuno-assay，TRFIA）检测CD8⁺ T细胞对DC的杀伤活性。

其中，CD8⁺ T细胞是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离获得，并进行体外扩增培养，分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。

逆转录病毒载体是由一种逆转录病毒序列构建的基因运载工具，能够携带外源基因或DNA进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上，目前已成为商业化产品，容易购买和获得。

重组逆转录病毒载体的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，重组逆转录病毒转染方法是目前常用的生物技术手段，除本发明中使用的人工脂质体法外，还可以使用其它化学转染法，包括：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法；以及物理方法，包括：显微注射、电穿孔、基因枪等。

本发明的有益效果在于：

本发明成功筛选出HIV肽Env_120-128特异的TCR，携带该肽特异TCR基因的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别HIV肽Env_120-128并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的应用价值，可为艾滋病及艾滋/结核共感染疾病的过继细胞免疫治疗开辟新径。

附图说明

图1 HIV肽Env_120-128刺激前后CD8⁺ T细胞TCR α和β链CDR3谱型分析；

图2重组逆转录病毒载体pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES

-GFP构建示意图；

图3 pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP的酶切鉴定（M．DL15000 marker；1. pMX-IRES-GFP空载体；2. pMX-IRES-GFP空载体的XhoI酶切产物；3. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP；4. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP的XhoI酶切产物；5. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP的XhoI+NotI双酶切产物）；

图4荧光显微镜观察重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达(×10) (a. 明场；b. 荧光；c. 叠加图)；

图5 流式细胞术检测重组病毒转染后NIH3T3细胞的GFP表达阳性率(a．未转染；b. pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP)；

图6 荧光显微镜观察重组病毒转染后CD8⁺ T细胞GFP的表达（×10；EmTd：空载体转染组；HIV Td：重组病毒转染组）；

图7流式细胞术检测重组病毒转染后CD8⁺ T细胞GFP的表达（UnTd：未转染组；EmTd：空载体转染组；HIV Td：重组病毒转染组）；

图8 ELISA检测CD8⁺ T细胞IFN-γ的分泌水平；

图9 ELISA检测CD8⁺ T细胞TNF-α的分泌水平；

图10 TRFIA检测CD8⁺ T细胞的杀伤活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所有计量资料结果用±s表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较各组间细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌水平的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.0 for windows统计软件包进行数据分析。

实施例

1．筛选HIV-1肽Env _120-128  (KLTPLCVTL)特异的TCR

1.1 密度梯度离心法分离纯化PBMC

(1) 在15ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；

(2) 取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。18~20°C，1800~2000rpm/min水平离心20~30min；

(3) 离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；

(4) 用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI 1640液，18~20°C，1500rpm/min离心10min，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；

(5) 细胞计数及细胞活力检测：PBMC细胞悬液与1/10体积的0.4 %台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以10⁴即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率［活细胞率%=（活细胞数/总细胞数）×100%］。

1.2 制备HIV肽Env_120-128特异T细胞克隆：

(1) 计数PBMC，调整PBMC数目为1×10⁶/孔，分别加入含HIV-1肽Env_120-128 50ng/ml的10% FBS-1640培养基2ml；

(2) 37°C、5% CO₂条件下培养2h后，加入IL-2 25U/ml；

(3) 第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2 100U/ml，之后以此浓度继续培养11天。

1.3免疫磁珠（德国美天旎生物公司）分选CD8⁺ T细胞：

1.4总RNA提取试剂盒（OMEGA）提取上述收集到的细胞沉淀的总RNA：

1.5逆转录（RT）试剂盒（Fermentas）合成cDNA。

1.6 PCR扩增34个TCR Vα基因家族CDR3片段（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405-415.）：

利用34条TCR Vα家族特异性上游引物和共用下游Cα外、内侧引物做半巢式PCR：

第一轮PCR：每样本做34个PCR反应管，第1~34管分别加入TCR Vα1至Vα34家族上游引物，每管加共用下游Cα外侧引物1μl，各引物浓度均为10μM。每PCR反应管体积为25μl，含cDNA模板1.0μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/LMgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：95°C预变性3min；95°C 30s，60°C 30s，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。                 

第二轮PCR：反应总体积为25μl，含第一轮PCR产物2μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U，TCR Vα34条家族上游引物1μl，下游FAM标记内侧Cα引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应条件：95°C 2min；60°C 2min，72°C 10min，4个循环。

1.7 PCR扩增24个TCR Vβ基因家族CDR3片段（参照文献：XIN-SHENG等，2006，Clinical & Laboratory Haematology, 28: 405–415.）：

每样本做24个PCR反应管，每管加入TCR Cβ-FAM下游引物1μl，第1至第24管分别加入TCR Vβ1至TCR Vβ24上游引物1μl，各引物浓度均为10μM。PCR反应体积为25μl，含cDNA模板1μl，10mmol/L dNTP 0.5μl， 10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，Taq DNA聚合酶0.625U。PCR反应条件：94°C变性3min；94°C 1min，55°C 1min，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。 

1.8琼脂糖凝胶电泳：

取34个TCR Vα和24个TCR Vβ基因家族PCR产物各5μl，2%琼脂糖凝胶电泳，110V，20min，采用凝胶成像系统照相。剩余PCR产物-20°C保存备用。

1.9 CDR3谱型分析：

取34个Vα、24个Vβ基因家族FAM荧光标记PCR产物2μl，在373DNA序列分析仪（ABI，Perkin Elmer）上进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集电泳过程中不同时间出现的不同强度的荧光信号，GeneScan 672软件自动分析收集的数据，转换为不同位置、高度和形态的峰，代表各TCR家族CDR3成员出现的频率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有单峰分布的TCR家族即是抗原特异性单克隆增生的TCR家族。

CDR3谱型分析结果显示，抗原肽刺激CD8⁺ T细胞后，部分TCR基因家族谱型发生改变，由原来的8个或多于8个峰型的高斯分布变为少于8个峰的单寡峰分布，表明这些家族是由于抗原肽持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化，找出刺激前为多克隆，HIV肽刺激后分别呈单克隆扩增的Vα11、Vβ18基因家族（图1）。

测序显示，HIV-1肽Env_120-128 (KLTPLCVTL)特异的TCR Vα11、Vβ18的CDR3区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，两条CDR3序列编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示。

2．构建重组逆转录病毒载体（构建流程见图2）

2.1合成引物

依据TCR CDR3谱型，筛选出刺激前呈多克隆峰型、刺激后为单峰的TCR Vα、Vβ基因家族，依据GeneBank报道的该基因家族V区序列设计全长基因上、下游引物，依据文献报道设计与CD3ζ分子融合处的重组引物，依据F2A肽连接序列设计重组引物，全部引物由Invitrogen上海英骏生物技术有限公司合成，引物名称和序列（5’ to 3’）如下：                                               

2.2 PCR扩增hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ融合基因：

(1) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P1与P2，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增中至hCβ 393bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S1（hVβ18hCβ区）。hVβ18hCβ全长基因序列如SEQ ID NO: 5所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。

(2) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P3与P4，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCβ 393bp前部分序列、连接序列ggggat、CD3ζ全长序列及5’端F2A序列S2（hCβ_393bp -CD3ζ-5’端F2A区）。

(3) 以步骤(1)得到的S1和步骤(2)得到的S2作为模板，利用引物P1与P4，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增hVβ18hCβ_393bp-CD3ζ-5’端F2A序列S3（其中hVβ18hCβ_393bp-CD3ζ段的序列如SEQ ID NO: 7所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示）。

(4) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P5与P6，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增3’端F2A-hVα11hCα（其中hVα11hCα的核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示）中至hCα 284bp处片段及连接序列ggggat与5’端CD3ζ的序列S4（3’端F2A -hVα911hCα区）。

(5) 以步骤1.5制备的cDNA为模板，利用引物P7与P8，Pfu DNA聚合酶，PCR扩增hCα 284bp前部分序列、连接序列ggggat及CD3ζ全长序列S5（hCα_284bp-CD3ζ区）。

(6) 以步骤(4)得到的S4和步骤(5)得到的S5作为模板，利用引物P5与P8，Pfu DNA聚合酶，重组PCR扩增3’端F2A-hVα11hCα_284bp-CD3ζ序列S6。其中，hVα11hCα_284bp-CD3ζ段的序列如SEQ ID NO: 11所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

(7) 利用限制性内切酶AgeI单酶切S3与 S6，凝胶回收试剂盒（Omega）分离回收酶切后的片段并用T4 DNA连接酶进行连接以获得hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ（SEQ ID NO: 13）基因片段。

以上常规PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.8μl，模板DNA 0.5μl。常规PCR反应条件：95°C 变性5min；95°C 1min，63°C 1min，72°C 1min，35个循环；72°C延伸10min。

重组PCR反应体系25μl，含10×Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.8μl，Pfu DNA聚合酶0.2U，10μM引物各0.6μl，两种PCR产物模板各6μl。PCR反应条件：95°C变性5min；95°C 1min，50°C 30s，72°C 1min，3个循环；95°C 90s，65°C 30s，72°C 90s，32个循环；72°C延伸10min。

2.3构建含hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段的克隆载体

（1）用胶回收试剂盒（Omega）回收hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段；

（2）用DNA A-Tailing试剂盒（TaKaRa）在上述基因片段末尾加A；

（3）将hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ基因片段接入pGEM-T载体中，连接反应体系10μl：pGEM-T载体1μl、10×ligation Buffer 1μl、T4 DNA连接酶1μl、0.2pmol已加A纯化的PCR产物，16°C连接过夜。

（4）常规方法将连接正确的质粒转化 E.coli DH5α感受态菌。然后将菌涂布在4μl 200mg/ml IPTG、40μl 20 mg/ml X-gal的氨苄青霉素平板上，培养过夜。重组质粒转化的菌落呈为白色，而空质粒转化的菌落呈蓝色。选择平板上白色菌落，转到装有3ml Amp⁺ LB培养液的试管中，37°C，160rpm振摇12-16h。

（5）用质粒抽提试剂盒（Omega）提取质粒，用相应的限制性内切酶对初筛阳性重组质粒进行鉴定，并以重组质粒为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。最后将初筛阳性质粒送Invitrogen上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果表明，该重组质粒含有的外源基因序列与预测序列完全一致。

2.4重组逆转录病毒载体的构建

(1) 用限制性内切酶Xho I、Not I酶切含hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα- CD3ζ融合基因的T载体与pMX-IRES-GFP空质粒，分别胶回收hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ融合基因片段与载体基因片段（方法同步骤2.3）；

(2) 将酶切后的hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVα11hCα-CD3ζ融合基因片段连接入pMX-IRES-GFP载体（方法同步骤2.3）后，转化感受态细菌XL-10，涂布于含氨苄青霉素的固体培养基培养12-16h后，挑选单个菌落，摇菌过夜；

(3) 抽提质粒，酶切鉴定结果显示，基因片段插入正确（图3）；

(4) 选择阳性菌落进行扩增培养，大量抽提质粒DNA。

2.5逆转录病毒重组载体的包装

重组质粒与包膜蛋白质粒VSV-G以1:1的比例混合，采用脂质体转染法转染GP2-293细胞，包装逆转录病毒，实验按Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒说明操作。

2.6重组逆转录病毒的浓缩纯化

(1) 收集病毒上清，10000g，4°C离心10min； 

(2) 回收病毒上清，50000g，4°C离心2h； 

(3) 1%-3%原体积的TNE重悬，病毒完全溶解后，分装，-80°C贮存；；

2.7流式细胞术测定病毒滴度

(1) 预先将NIH3T3细胞（2×10⁵/孔）接种培养24h；

(2) 加入聚凝胺（PB）至终浓度8mg/L，加入10μl待测滴度的病毒上清；

(3) 感染24h后，更换新鲜培养液，去除假病毒颗粒； 

(4) 37°C继续培养3d后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达；

(5) 37°C继续培养5d后，胰酶消化、PBS洗涤3次后，用200-300μl PBS重悬，制备密度为1-5×10⁶/ml的单细胞悬液，流式细胞仪检测其GFP表达阳性率，按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度（GFU/ml）=NIH3T3细胞数×阳性率/转染病毒上清量（ml）。

荧光显微镜下观察，经GP2-293细胞包装过的逆转录病毒感染的NIH3T3细胞表达绿色荧光，表明GFP在细胞中的表达（图4）。计算得重组病毒的滴度为1.59×10⁷IU/mL（图5）。

3. 重组逆转录病毒感染CD8 ⁺  T细胞

3.1 将CD8⁺ T细胞感染前一天以 5×10⁵个/孔接种于24孔板；

3.2 转染当日弃细胞培养旧液，按MOI为13加入病毒贮存液，加入PB至终浓度为8mg/L，37°C培养4h；

3.3 加入培养基，稀释PB至2mg/L，继续培养5天；

3.4 离心收集细胞，PBS洗涤2次，2%多聚甲醛固定；

3.5 流式细胞仪分析CD8⁺ T细胞GFP表达阳性率为29.5%（图6、7）。

4．鉴定重组逆转录病毒转染的CD8 ⁺  T细胞的抗HIV活性

4.1 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）测定CD8⁺ T细胞的IFN-γ、TNF-α分泌水平 

实验对照组设置：阴性对照组（HIVTd+DC：HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+DC）、未转染组（UnTd+DC-HIV：未转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、空载体转染组（EmTd+DC-HIV：空载体转染CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）、无关肽组（HIVTd+DC-CMV：HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+负载CMVpp65的DC）、HIVTd+HIV-DC组（HIV肽Env_120-128特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞+负载HIV肽Env_120-128的DC）。以下实验对照设置均同此。实验重复3次，方法如下：

(1) DC以5×10³个/孔接种于96孔板，按已摸索好的E:T（测IFN-γ的分泌量时E:T=7，测TNF-α的分泌量时E:T=20）加入CD8⁺ T细胞，每组设三个复孔；

(2) CD8⁺ T细胞与DC混合培养一定时间（测IFN-γ时混合培养18h，测TNF-α时混合培养24h），收集各孔培养上清，按试剂盒说明书进行操作。

ELISA结果显示：

① 在效靶比（E:T）=7，与负载HIV肽Env_120-128的DC混合培养18h时，HIV肽特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞IFN-γ分泌水平达到最高值1401.667±81.969pg/ml，显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载HIV肽或负载其它非相关肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞（P<0.001），见图8；

② 在E:T=20，与负载HIV肽Env_120-128的DC混合培养24h时，HIV肽特异TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞TNF-α分泌水平达到最高值1009.22±67.073pg/ml，显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载HIV肽或负载其它非相关肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞（P<0.001），见图9。

4.2时间分辨荧光免疫分析试剂盒（PerkinElmer）测定CD8⁺ T细胞杀伤活性，按试剂盒说明书进行操作。

时间分辨免疫荧光检测结果显示：在E:T=30，与负载HIV肽Env_120-128的DC混合培养4h时，TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞杀伤活性最高，达到46.45%，显著高于未转染、空转染的CD8⁺ T细胞和与未负载HIV肽或负载其它非相关肽的DC共培养的TCR基因修饰的CD8⁺ T细胞的杀伤水平（P<0.001），见图10。

上述实验结果显示：携带HIV肽Env_120-128特异TCR基因的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别HIV肽Env_120-128并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有艾滋病及与结核共感染疾病基因治疗的应用价值，可为艾滋病及结核病的过继细胞免疫治疗开辟新径。

<110>  南方医科大学

<120>  一种HIV-1肽Env_120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用

<130> 

<160>  21   

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  63

<212>  DNA

<213>  human

<400>  1

gcctctgggg gttaccagaa agttaccttt ggaactggaa caaagctcca agtcatccca       60

aat                                                                     63

 

<210>  2

<211>  57

<212>  DNA

<213>  human

<400>  2

gcccgggacg gttcctacga gcagtacttc gggccgggca ccaggctcac ggtcaca          57

 

<210>  3

<211>  21

<212>  PRT

<213>  human

<400>  3

Ala Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu

1               5                   10                  15     

Gln Val Ile Pro Asn

            20     

 

<210>  4

<211>  19

<212>  PRT

<213>  human

<400>  4

Ala Arg Asp Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu

1               5                   10                  15     

Thr Val Thr

           

 

<210>  5

<211>  942

<212>  DNA

<213>  human

<400>  5

atggacacca gagtactttg ctgtgcggtc atctgtcttc tgggggcagg tctctcaaat       60

gccggcgtca tgcagaaccc aagacacctg gtcaggagga ggggacagga ggcaagactg      120

agatgcagcc caatgaaagg acacagtcat gtttactggt atcggcagct cccagaggaa      180

ggtctgaaat tcatggttta tctccagaaa gaaaatatca tagatgagtc aggaatgcca      240

aaggaacgat tttctgctga atttcccaaa gagggcccca gcatcctgag gatccagcag      300

gtagtgcgag gagattcggc agcttatttc tgtgccagct cacgcgcccg ggacggttcc      360

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg      420

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag      480

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg      540

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag      600

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc      660

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat      720

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg      780

ggtagagcag actgtggctt cacctccgag tcttaccagc aaggggtcct gtctgccacc      840

atcctctatg agatcttgct agggaaggcc accttgtatg ccgtgctggt cagtgccctc      900

gtgctgatgg ccatggtcaa gagaaaggat tccagaggct ag                         942

 

<210>  6

<211>  312

<212>  PRT

<213>  human

<400>  6

 

Asp Thr Arg Val Leu Cys Cys Ala Val Ile Cys Leu Leu Gly Ala Gly

1               5                   10                  15     

Leu Ser Asn Ala Gly Val Met Gln Asn Pro Arg His Leu Val Arg Arg

            20                  25                  30         

Arg Gly Gln Glu Ala Arg Leu Arg Cys Ser Pro Met Lys Gly His Ser

        35                  40                  45            

His Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Glu Glu Gly Leu Lys Phe Met

    50                  55                  60                 

Val Tyr Leu Gln Lys Glu Asn Ile Ile Asp Glu Ser Gly Met Pro Lys

65                  70                  75                  80 

Glu Arg Phe Ser Ala Glu Phe Pro Lys Glu Gly Pro Ser Ile Leu Arg

                85                  90                  95     

Ile Gln Gln Val Val Arg Gly Asp Ser Ala Ala Tyr Phe Cys Ala Ser

            100                 105                 110        

Ser Arg Ala Arg Asp Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

        115                 120                 125            

Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

    130                 135                 140                

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

145                 150                 155                 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

                165                 170                 175    

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

            180                 185                 190        

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

        195                 200                 205            

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

    210                 215                 220                

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

225                 230                 235                 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

                245                 250                 255    

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

            260                 265                 270        

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

        275                 280                 285            

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

    290                 295                 300                

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305                 310        

 

<210>  7

<211>  1224

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

atggacacca gagtactttg ctgtgcggtc atctgtcttc tgggggcagg tctctcaaat       60

gccggcgtca tgcagaaccc aagacacctg gtcaggagga ggggacagga ggcaagactg      120

agatgcagcc caatgaaagg acacagtcat gtttactggt atcggcagct cccagaggaa      180

ggtctgaaat tcatggttta tctccagaaa gaaaatatca tagatgagtc aggaatgcca      240

aaggaacgat tttctgctga atttcccaaa gagggcccca gcatcctgag gatccagcag      300

gtagtgcgag gagattcggc agcttatttc tgtgccagct cacgcgcccg ggacggttcc      360

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg      420

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag      480

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg      540

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag      600

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc      660

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat      720

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg      780

ggtagagcag actgtgggga tctggatccc aaactctgct acctgctgga tggaatcctc      840

ttcatctatg gtgtcattct cactgccttg ttcctgagag tgaagttcag caggagcgca      900

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga      960

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag     1020

ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg     1080

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat     1140

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag     1200

gccctacccc ctcgcggctc cgga                                            1224

 

 

<210>  8

<211>  430

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  8

Asp Thr Arg Val Leu Cys Cys Ala Val Ile Cys Leu Leu Gly Ala Gly

1               5                   10                  15     

Leu Ser Asn Ala Gly Val Met Gln Asn Pro Arg His Leu Val Arg Arg

            20                  25                  30         

Arg Gly Gln Glu Ala Arg Leu Arg Cys Ser Pro Met Lys Gly His Ser

        35                  40                  45              

His Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Glu Glu Gly Leu Lys Phe Met

    50                  55                  60                 

Val Tyr Leu Gln Lys Glu Asn Ile Ile Asp Glu Ser Gly Met Pro Lys

65                  70                  75                  80 

Glu Arg Phe Ser Ala Glu Phe Pro Lys Glu Gly Pro Ser Ile Leu Arg

                85                  90                  95     

Ile Gln Gln Val Val Arg Gly Asp Ser Ala Ala Tyr Phe Cys Ala Ser

            100                 105                 110        

Ser Arg Ala Arg Asp Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

        115                 120                 125            

Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

    130                 135                 140                 

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

145                 150                 155                 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

                165                 170                 175    

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

            180                 185                 190        

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

        195                 200                 205            

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

    210                 215                 220                

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

225                 230                 235                 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

                245                 250                 255    

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Asp Leu Asp Pro Lys Leu Cys

            260                 265                 270        

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

        275                 280                 285            

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

    290                 295                 300                

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

305                 310                 315                 320

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

                325                 330                 335    

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

            340                 345                 350        

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

        355                 360                 365            

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

    370                 375                 380                

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

385                 390                 395                 400

Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe

                405                 410                 415    

Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

            420                 425                 430

 

<210>  9

<211>  813

<212>  DNA

<213>  human

<400>  9

atgaagccca ccctcatctc agtgcttgtg ataatattta tactcagagg aacaagagcc       60

cagagagtga ctcagcccga gaagctcctc tctgtcttta aaggggcccc agtggagctg      120

aagtgcaact attcctattc tgggagtcct gaactcttct ggtatgtcca gtactccaga      180

caacgcctcc agttactctt gagacacatc tctagagaga gcatcaaagg cttcactgct      240

gaccttaaca aaggcgagac atctttccac ctgaagaaac catttgctca agaggaagac      300

tcagccatgt attactgtgc tctaagtgcc tctgggggtt accagaaagt tacctttgga      360

actggaacaa agctccaagt catcccaaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag      420

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa      480

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac      540

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt      600

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca      660

gaaagttcct gtgatgtcaa gctggtcgag aaaagctttg aaacagatac gaacctaaac      720

tttcaaaacc tgtcagtgat tgggttccga atcctcctcc tgaaagtggc cgggtttaat      780

ctgctcatga cgctgcggct gtggtccagc tga                                   813

 

 

<210>  10

<211>  269

<212>  PRT

<213>  human

<400>  10

Lys Pro Thr Leu Ile Ser Val Leu Val Ile Ile Phe Ile Leu Arg Gly

1               5                   10                  15     

Thr Arg Ala Gln Arg Val Thr Gln Pro Glu Lys Leu Leu Ser Val Phe

            20                  25                  30         

Lys Gly Ala Pro Val Glu Leu Lys Cys Asn Tyr Ser Tyr Ser Gly Ser

        35                  40                  45             

Pro Glu Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Ser Arg Gln Arg Leu Gln Leu

    50                  55                  60                 

Leu Leu Arg His Ile Ser Arg Glu Ser Ile Lys Gly Phe Thr Ala Asp

65                  70                  75                  80 

Leu Asn Lys Gly Glu Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Phe Ala Gln

                85                  90                  95     

Glu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Ala Ser Gly Gly

            100                 105                 110        

Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Gln Val Ile Pro

        115                 120                 125            

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

    130                 135                 140                

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

145                 150                 155                 160

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

                165                 170                 175    

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

            180                 185                 190        

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

        195                 200                 205            

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

    210                 215                 220                

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

225                 230                 235                 240

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

                245                 250                 255    

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

            260                 265                

 

<210>  11

<211>  1095

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

atgaagccca ccctcatctc agtgcttgtg ataatattta tactcagagg aacaagagcc       60

cagagagtga ctcagcccga gaagctcctc tctgtcttta aaggggcccc agtggagctg      120

aagtgcaact attcctattc tgggagtcct gaactcttct ggtatgtcca gtactccaga      180

caacgcctcc agttactctt gagacacatc tctagagaga gcatcaaagg cttcactgct      240

gaccttaaca aaggcgagac atctttccac ctgaagaaac catttgctca agaggaagac      300

tcagccatgt attactgtgc tctaagtgcc tctgggggtt accagaaagt tacctttgga      360

actggaacaa agctccaagt catcccaaat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag      420

ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa      480

acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac      540

atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt      600

gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca      660

gaaagttcct gtggggatct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc      720

atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac      780

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga      840

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg      900

cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg      960

gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc     1020

ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc     1080

ctaccccctc gctaa                                                      1095

 

<210>  12

<211>  363

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  12

Lys Pro Thr Leu Ile Ser Val Leu Val Ile Ile Phe Ile Leu Arg Gly

1               5                   10                  15     

Thr Arg Ala Gln Arg Val Thr Gln Pro Glu Lys Leu Leu Ser Val Phe

            20                  25                  30          

Lys Gly Ala Pro Val Glu Leu Lys Cys Asn Tyr Ser Tyr Ser Gly Ser

        35                  40                  45             

Pro Glu Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Ser Arg Gln Arg Leu Gln Leu

    50                  55                  60                  

Leu Leu Arg His Ile Ser Arg Glu Ser Ile Lys Gly Phe Thr Ala Asp

65                  70                  75                  80 

Leu Asn Lys Gly Glu Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Phe Ala Gln

                85                  90                  95     

Glu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Ala Ser Gly Gly

            100                 105                 110        

Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Gln Val Ile Pro

        115                 120                 125            

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

    130                 135                 140                

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

145                 150                 155                 160

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

                165                 170                 175    

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

            180                 185                 190        

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

        195                 200                 205            

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Gly

    210                 215                 220                

Asp Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile

225                 230                 235                 240

Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

                245                 250                 255    

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

            260                 265                 270        

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

        275                 280                 285            

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn

    290                 295                 300                

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

305                 310                 315                 320

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

                325                 330                 335    

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

            340                 345                 350        

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

        355                 360            

 

<210>  13

<211>  2391

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

atggacacca gagtactttg ctgtgcggtc atctgtcttc tgggggcagg tctctcaaat       60

gccggcgtca tgcagaaccc aagacacctg gtcaggagga ggggacagga ggcaagactg      120

agatgcagcc caatgaaagg acacagtcat gtttactggt atcggcagct cccagaggaa      180

ggtctgaaat tcatggttta tctccagaaa gaaaatatca tagatgagtc aggaatgcca      240

aaggaacgat tttctgctga atttcccaaa gagggcccca gcatcctgag gatccagcag      300

gtagtgcgag gagattcggc agcttatttc tgtgccagct cacgcgcccg ggacggttcc      360

tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg      420

ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag      480

gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg      540

gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag      600

cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc      660

tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat      720

gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg      780

ggtagagcag actgtgggga tctggatccc aaactctgct acctgctgga tggaatcctc      840

ttcatctatg gtgtcattct cactgccttg ttcctgagag tgaagttcag caggagcgca      900

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga      960

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag     1020

ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg     1080

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat     1140

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag     1200

gccctacccc ctcgcggctc cggagcaccg gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc     1260

aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca gggcccatga agcccaccct catctcagtg     1320

cttgtgataa tatttatact cagaggaaca agagcccaga gagtgactca gcccgagaag     1380

ctcctctctg tctttaaagg ggccccagtg gagctgaagt gcaactattc ctattctggg     1440

agtcctgaac tcttctggta tgtccagtac tccagacaac gcctccagtt actcttgaga     1500

cacatctcta gagagagcat caaaggcttc actgctgacc ttaacaaagg cgagacatct     1560

ttccacctga agaaaccatt tgctcaagag gaagactcag ccatgtatta ctgtgctcta     1620

agtgcctctg ggggttacca gaaagttacc tttggaactg gaacaaagct ccaagtcatc     1680

ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg taccagctga gagactctaa atccagtgac     1740

aagtctgtct gcctattcac cgattttgat tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat     1800

tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc     1860

aacagtgctg tggcctggag caacaaatct gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac     1920

agcattattc cagaagacac cttcttcccc agcccagaaa gttcctgtgg ggatctggat     1980

cccaaactct gctacctgct ggatggaatc ctcttcatct atggtgtcat tctcactgcc     2040

ttgttcctga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag     2100

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag     2160

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa     2220

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg     2280

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc     2340

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctac cccctcgcta a              2391

 

<210>  14

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

ccgctcgagg ccaggatgga caccagagta ctttgctg                               38

 

<210>  15

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

agagtttggg atccagatcc ccacagtctg ctctacccca gg                          42

 

<210>  16

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

ggtagagcag actgtgggga tctggatccc aaactctgct acctg                       45

 

<210>  17

<211>  46

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

gtttcaccgg tgctccggag ccgcgagggg gtagggcctg catgtg                      46

 

<210>  18

<211>  97

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

gcaccggtga aacagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc       60

aacccagggc ccatgaagcc caccctcatc tcagtgc                                97

 

<210>  19

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  19

agagtttggg atccagatcc ccacaggaac tttctgggct gg                          42

 

<210>  20

<211>  43

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  20

cccagaaagt tcctgtgggg atctggatcc caaactctgc tac                         43

 

<210>  21

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  21

ataagaatgc ggccgcttag cgagggggta gggcctgcat gt                          42

Claims (10)

1.HIV-1肽Env_120-128特异性T细胞受体（TCR），包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β链的CDR3区含有SEQ ID NO: 4所示的序列。

2.根据权利要求1所述的HIV-1肽Env_120-128特异性TCR，其特征在于，所述TCR的α链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的HIV-1肽Env_120-128特异性TCR，其特征在于，所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

4.编码权利要求1～3任一项所述TCR的基因。

5.一种HIV-1肽Env_120-128特异性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。

6.一种重组逆转录病毒载体，含有权利要求4或5所述的基因。

7.根据权利要求6所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，出发载体包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。

8.权利要求6或7所述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。

9.权利要求8所述的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞。

10.权利要求1～3任一项所述的HIV-1肽Env_120-128特异性TCR、权利要求4或5所述的基因、权利要求6或7所述的重组逆转录病毒载体、权利要求8所述的逆转录病毒、权利要求9所述的逆转录病毒转染的CD8⁺ T细胞在制备抗艾滋病、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。

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