CN102875660A - 一种病毒诱导蛋白Mig1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎病毒诱导蛋白Mig1及其应用。病毒诱导蛋白Mig1为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。应用方法：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增Mig1基因，PCR产物连接表达载体后得质粒pMig1，将其转染头肾白细胞，得含有pMig1的转染子。所述pMig1转染子具有显著增强的抗病毒能力。

Description

一种病毒诱导蛋白Mig1及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种病毒诱导蛋白Mig1及其应用。

背景技术

近年来，随着海水鱼类养殖业集约式和工厂化快速发展，病害问题日益严重。病毒是养殖鱼类病害的主要病原，其中虹彩病毒等能感染多种鱼类，造成危害严重的传染性疫病。研究表明，病毒感染鱼类后可诱发一系列机体免疫应答反应，包括产生各种天然免疫和获得性免疫因子，如干扰素、Mx、viperin、各种干扰素刺激基因产物等，这些因子在不同程度上可协助机体抑制病毒的复制、粘附、释放等过程，从而抵抗病毒感染。

发明内容

本发明目的在于提供一种病毒诱导蛋白Mig1及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种病毒诱导蛋白Mig1，病毒诱导蛋白Mig1为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

病毒诱导蛋白Mig1的制备方法，

1）质粒pMig1的构建：

以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与EcoRV酶切的质粒pID2用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pMig1；所述F1为5’-GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’，R1为5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。

病毒诱导蛋白Mig1的应用，所述病毒诱导蛋白Mig1用于制备抗病毒药物。

本发明具有如下优点：本发明的病毒诱导蛋白Mig1转染细胞后能够明显提高细胞的抗病毒能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）；酵母转化按Invitrogen公司的方法（Catalog no.V175-20）；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）按照Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

本发明的病毒诱导蛋白Mig1为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No.1为：

MQISGRVQSCCVALVFALTTASAVKQLKSIHDLKKINFGQTVPKHSLVLLHWFANVVNIDNNNIVRLTFNPNSGDYGSHHYGNYEGLLDPPPPGQQYYTLGNLNQGSSELPDHVVHSQGEYAGRNLDRIILRVRNHNTGRQRLQRVYQVYITQHYAASENHGTMYDLHNTYCITTDLLRQIQEFSVGTDQQPLSALRDDFQSNADDFQLRHIKLSWGELACLALFLFIVIEDKYCPKRASKGPQRSVRNNIETDYAIDNKYHPKRASTEPQRSVRNNIQSHYVVEIPEHLLYSDDGIHLQVTTGTNGKARIIWNGVPQHRLENGAMVVLFRNNKDNEASSTYKYISNKESGSFDTSVPLNDGLQARLHKVRIKYCFWKVVGEEICRGPEFKNPQTATNIGNYGAKLQLFVKDGKACARLFVQKSFTEWRSEFVNSWVGFYTSSDKATNEYSWWQWQWAIKFKPNTDVKDFFYDVYDFHSELAIAPGVQARFMLSNKDVRATTISSWR

（a）序列特征：

●长度：507

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：半滑舌鳎

结构特点：该蛋白预期含有一个信号肽（氨基酸1－23）。

实施例2

病毒诱导蛋白Mig1的细胞转染：

1）质粒pMig1的构建：

以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA,然后94°C 40s,50°C 60s,72°C 60s,5个循环后改为94°C 40s,65°C 60s,72°C 60s,30个循环后再在72°C延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pID2（pID2构建过程参见Hu YH,Sun L.A bivalent Vibrio harveyi DNA vaccine inducesstrong protection in Japanese flounder(Paralichthys olivaceus).Vaccine 2011;29:4328－33）用限制性内切酶EcoRV酶切后回收6kb片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pMig1，由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’；R1为5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。

2）pMig1转染头肾白细胞

制备半滑舌鳎头肾白细胞（具体方法参见Sun J,Li Y,Sun L.Cynoglossus semilaevis thioredoxin: a reductase and an antioxidantwith immunostimulatory property. Cell Stress Chaperon.

2012;17:445-55。将1－2μg上述步骤1）制备的pMig1或pID2(对照)用Lipofect(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)转染头肾白细胞（具体方法参见Hu Y,Deng T,Sun L.The Rab1 GTPase of Sciaenopsocellatus modulates intracellular bac terial infection. FishShellfish Immunol.2011;31:1005-12.），获得含有pMig1的转染子和含有pID2的对照转染子。

实施例3

病毒诱导蛋白Mig1的抗毒病作用

将上述实施例2步骤2）的pMig1转染子和对照转染子置于含有L－15培养基（购于Thermo Scientific HyClone,北京）的96－孔平板（每孔10⁵个细胞），每孔加入10⁶个虹彩病毒，25℃保温4h。细胞用PBS洗3次。用绝对定量PCR方法（该方法具体参见：Zhang M,Xiao ZH,Hu YH,Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),in China.Aquac Res.2012;43:556–64）计算胞内感染的病毒数。该实验重复3次。结果表明，pMig1转染子中的病毒平均数比对照转染子中的病毒平均数低4.5倍（显著差异P<0.01），说明病毒诱导蛋白Mig1能够显著保护细胞抵抗病毒的侵染。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。

Claims (3)

1.一种病毒诱导蛋白Mig1，其特征在于：病毒诱导蛋白Mig1为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

2.一种权利要求1所述病毒诱导蛋白Mig1的制备方法，其特征在于：

1）质粒pMig1的构建：

以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与EcoRV酶切的质粒pID2用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pMig1；所述F1为5’-GATATCGCCACCATGCAGATTTCAGGAAGA-3’，R1为5’-GCGCGGATATCTCTCCAACTTGAAATTGTT-3’。

3.一种权利要求1所述病毒诱导蛋白Mig1的应用，其特征在于：所述病毒诱导蛋白Mig1用于制备抗病毒药物。