CN102870764A

CN102870764A - 一种新型灌注保存液

Info

Publication number: CN102870764A
Application number: CN201110195800XA
Authority: CN
Inventors: 刘斌; 郑剑桥; 余海; 周棱; 李茜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明为一种新型的灌注保存液，能用于灌注并保存人体或动物的器官、组织或细胞，属于生物医学领域。本发明由人体或动物生理范围内的电解质成分、营养底物、胶体活性物质、酸碱缓冲系统和有效浓度的特异性钠氢通道1型(NHE1)抑制剂HOE642组成。该灌注保存液性能稳定，能减轻人体或动物的器官、组织或细胞在缺血保存期和再灌注期的损伤，有效地保存器官、组织或细胞的生理结构和功能。该灌注保存液适用于人体或动物的自体移植、同质移植、同种异体移植及异种移植中移植物的灌注和保存，也可于相关的医学研究和实验室研究。

Description

一种新型灌注保存液

技术领域

本发明为一种新型的灌注保存液，用于灌注并保存人体或动物的器官、组织或细胞。本发明可用于人体或动物移植手术中移植物的灌注和保存，也可用于相关的医学研究和实验室研究。

背景技术

大量研究表明，钠氢通道(Na⁺/H⁺exchangers，NHEs)广泛存在于心肌、肺、脑、肾、肝脏、胰腺等器官中。哺乳动物NHE有9种亚型，分别称之为NHE1～9。(参见Masereel B，Pochet L，Laeckmann D.An overview of inhibitors ofNa⁺/H⁺exchanger.Eur J Med Chem.2003；38(6)：547-554)。在正常情况下，NHE1对调节细胞内pH梯度和细胞内Na⁺浓度具有十分重要的作用，从而维持细胞的各种生理功能和化学感受器的调节。有大量研究显示，低氧可增加肺血管内皮细胞内[H⁺]，通过激活NHE1而引起内皮细胞损伤。(参见Cutaia M，Tollefson K，Kroczynski J，et al.Role of the Na/H antiport in pH dependent cell death in pulmonary artery endothelial cells.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2000；278：536-544；和Rios EJ，Fallon M，Wang J，et al.Chronic hypoxia elevates intracellular pH and activates Na⁺/H⁺exchange in pulmonary arterial smooth muscle cells.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2005；289(5)：L867-L 874；和Shimoda LA，Fallon M，Pisarcik S，et al.HIF-1 regulates hypoxic induction of NHE1 expression and alkalinization of intracellular pH in pulmonary arterial myocytes.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2006；291：L941-L949)。

研究证实，钠氢通道(Na⁺/H⁺exchangers，NHEs)抑制剂能够减轻心肌、脑、肾、肝、胰腺等器官的缺血再灌注损伤。(参见Bobulescu IA，Di Sole F，Moe，O.Na⁺/H⁺exchangers：physiology and link to hypertension and organ ischemia.Curr opin Nephrol Hypertens.2005；14：485-494；和Wang D，Dou K，Song Z，et al.The Na⁺/H⁺exchange inhibitor：a new therapeutic approach for hepatic ischemia injury in rats.Transplant Proc.2003；35：3134-3135；和Masuoka H，Fujimori K，Sekiquchi S，et al.Beneficial effect of FR 183998，a Na⁺/H⁺exchanger inhibitor，on porcine pancreas allotransplantation retrieved from non-heart-beating donors.Transplant Proc.2005；37：223-225)。非选择性钠氢通道(Na⁺/H⁺exchangers，NHEs)抑制剂Amiloride能防治肺动脉高压，能显著降低缺血后急性肺损伤，降低肺毛细血管通透系数的增加。(参见Khoury J， Langleben D.Heparin-like molecules inhibit pulmonary vascular pericyte proliferation in vitro.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2000；279(2)：L252-61；和Moore TM，Khimenko PL，Taylor AE.Restoration of normal pH triggers ischemia-reperfusion injury in lung by Na⁺/H⁺exchange activation.Am J Physiol.1995；269(4Pt 2)：H1501-505)。含非选择性钠氢通道(Na⁺/H⁺exchangers，NHEs)抑制剂Amiloride及其混合物的灌注保存液已成功用于心脏的灌注和保存，且具有较好的心肌保护作用。(参见Raymond；Richard M.Organ transplant solutions and method for transplanting an organ[P].US563，462.1997-12-2)。因此，如能进一步减轻移植物缺血再灌注损伤，将能更好的保存移植物的生理结构和功能。

发明内容

为了提高现有灌注保存液的保护性能，进一步减轻移植物在缺血保存期和再灌注移植期的损伤，有效地保存移植物的生理结构和功能，同时基于目前的科研结果和本小组的前期研究，本研究小组发明一种可用于灌注并保存人和动物器官、组织或细胞的含特异性钠氢通道1型(Na⁺/H⁺exchanger 1，NHE1)抑制剂的新型灌注保存液。

为进一步减轻移植物在缺血期和再灌注移植期的损伤，本发明小组将特异性钠氢通道1型(Na⁺/H⁺exchanger 1，NHE1)抑制剂HOE642加入到移植物灌注保存液中，并将其浓度控制在10umol/L～100umol/L范围内。本发明的溶液可用作灌注溶液或保存溶液。作为灌注溶液，将其泵入到器官、组织的循环系统以保护器官组织和细胞。作为保存溶液，其用作浸没器官、组织或细胞的浴液。优选的，将移植物用本发明的溶液灌注并且浸没在本发明的溶液中。

本发明的新型灌注保存液能够有效的减轻移植物在缺血保存期和再灌注移植期的损伤，有效地保存移植物的生理结构和功能，而且本发明的有益效果已在本小组的前期研究中已得到证实。本小组在用含有10umol/L特异性钠氢通道1型(Na⁺/H⁺exchanger 1，NHE1)抑制剂HOE642的改良KHHB灌注液灌注离体大鼠肺脏发现，HOE642能明显减轻离体大鼠肺缺血灌注损伤过程中PAP、MDA、W/D的升高和肺泡II型上皮细胞内钙超载，提高SOD活性。同时能减轻肺缺血再灌注损伤，减轻肺血管内皮及肺泡上皮细胞的病理改变。HOE642在预处理和缺血过程中给予有明显的保护效果。

附图说明

图1为电镜下三组肺泡II型上皮细胞超微结构(×8000)。其中a：对照组，b：缺血再灌注组，c：卡立泊来德组。

图2为光镜下三组肺组织形态学的改变。a：对照组(×100)，b：缺血再灌注组(×100)，c：卡立泊来德组(×100)，d：对照组(×200)，e：缺血再灌注组(×200)，f：卡立泊来德组(×200)。

具体实施方式：

该灌注保存液成分如下：1)细胞外液电解质成分：Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Cl^-，SO₄ ^2-；2)有效缓冲系统：HPO₄ ^2-，H₂PO₄ ^-，HCO₃ ^-；3)胶体活性物质：右旋糖酐40或白蛋白或羟乙基淀粉HES(130/0.4)；4)细胞新陈代谢所需的底物：葡萄糖；5)特异性钠氢通道1型(Na⁺/H⁺exchanger 1，NHE1)抑制剂HOE642。

本发明的溶液可以如下制备：将固体钠氢通道1型(Na⁺/H⁺exchanger 1，NHE1)抑制剂HOE642、右旋糖酐40或白蛋白或羟乙基淀粉(HES130/0.4)、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷分别溶于含有无菌蒸馏水的容量瓶中，进行充分搅拌大约30分钟。用NaOH将pH值调整到7.0～7.6，并用50um微孔过滤器进行过滤，除去不溶残渣后便得到无菌的新型灌注保存液。钠氢通道1型(Na⁺/H⁺exchanger 1，NHE1)抑制剂HOE642还可以溶解于已知的保存液中，例如Krebs-Henseleit溶液、UW液、St.Thomas II溶液、Collins溶液、Stanford溶液等中，且上述溶液中HOE642的优选浓度范围与本发明灌注保存液中的优选浓度相同。

该灌注保存液成分优选浓度范围如下：NaCl：85.0mmol/L～145mmol/L；KCl：3.0mmol/L～30mmol/L；Na₂HPO4：0.7mmol/L～1.3mmol/L；NaH₂PO₄：0.7mmol/L～1.3mmol/L；NaHC0₃：15.0mmol/L～35.0mmol/L；葡萄糖：1.0mmol/L～50mmol/L；MgSO₄：0.9mmol/L～4.8mmol/L；HES(130/0.4)：30g/L～100g/L或右旋糖酐40：2g/L～20g/L或白蛋白50g/L～100g/L；渗透压280mOsm/L～320mOsm/L；pH维持在7.4～7.6，更优选为约7.2～7.4的生理学pH。

当该灌注保存液用于心脏灌注时，K⁺浓度范围为16mmol/L～30mmol/L，20mmol/L～26mmol/L为宜，最佳23mmol/L，Mg²⁺增加到1.2mmol/L～1.6mmol/L，最佳1.5mmol/L～1.6mmol/L，HOE642优选浓度为20μmol/L。当该灌注保存液用于心脏保存时，K⁺浓度范围为3.O mmol/L～8.0mmol/L，4.0mmol/L～6.0mmol/L为宜，HOE642优选浓度为20μmol/L。当该灌注保存液用于肺、肝脏、肾脏、胰腺、小肠及其他移植物灌注保存时，K⁺浓度范围为3.0mmol/L～6.0mmol/L，4.0mmol/L～5.0mmol/L为宜，HOE642优选浓度为30μmol/L～100μmol/L，优选50μmol/L。

举例：

例1用于心脏灌注时，成分如下：

例2用于心脏保存时，成分如下：

例3用于肝脏、肾脏、肺、胰腺、小肠等移植物灌洗和保存时，成分如下：

动物实验

卡立泊来德预处理减轻离体大鼠肺热缺血再灌注损伤机理的研究

实验动物为250～300gSD成年雄性大鼠。用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)和600IU肝素进行腹腔注射麻醉和全身肝素化，等后爪疼痛反射消失后，颈部正中切开，暴露气管并行气管切开插管，接动物呼吸机行控制呼吸。正中切开胸骨暴露心肺，游离肺动脉备用。经右心室插入20G Y型导管针至肺动脉主干，连接压力换能器后，结扎近端并固定，剪开左心耳引流。迅速完整取下整个心肺组织，置于37±1℃、保湿的灌流保温装置后，立即经肺动脉主干导管针用灌注液进行恒流灌注(40ml/kg·min)，并用多道生理记录仪连续监测平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure，MPAP)，呼吸功能监护仪连续监测气道峰值(peak airway pressure，pAwP)。灌注液为37℃并经95％O₂+5％CO₂气体饱和的含5％羟乙基淀粉的改良KHHB液，其成分为(mmol/L)：NaCl118.5，NaHCO₃12.5，KH₂PO₄1.2，KCl4.8，MgSO₄1.2，CaCl₂1.8，葡萄糖11.0；pH值范围为：7.35～7.45；渗透压为：300～320mOsm/kgH₂O。

将开始平衡后呈现白色并且无血栓、无不张、无肿胀的灌注肺随机分组并进行下面处理①对照组(C组)：KHHB液持续灌注离体肺120min，灌注期间进行双肺通气；②缺血再灌注组(IR组)：KHHB液平衡灌注、双肺通气30min后，常温37℃停止灌注和通气60min，KHHB液再灌注并通气30min；③卡立泊来德(HOE642)组(CP组)：10μmol/L卡立泊来德(HOE642)+KHHB液平衡灌注、双肺通气30min，常温37℃停止灌注和通气60min，KHHB液再灌注并通气30min。实验中模型肺出现水肿液超出气管导管1cm即停止试验，并将再灌注开始到停止试验的时间作为再灌注时间。

再灌注结束进行右支气管肺泡灌洗，记录支气管肺泡灌洗液(bronchoaveolar lavage fluid，BALF)回收率(BALF recovery rate，BALFRR)，测定其总蛋白和白蛋白含量；取左肺组织测定肺组织含水量(lung water content，LWC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，并进行肺组织病理学观察。

脂质过氧化程度的结果显示，IR组和CP组肺组织MDA含量显著高与C组，但CP组明低于IR组。CP组和IR组的SOD活性强于C组，但CP组的SOD活性明显强于IR组。

肺内皮血管通透性和肺水肿程度的结果显示，BALF白蛋白含量在三组间没有统计学差异。IR组的BALFRR、BALF总蛋白含量及LWC均明显高于C组。CP组BALF中总蛋白含量和LWC明显降低与IR组。BALF白蛋白含量三组间没有统计学差异。

肺组织病理学变化结果显示，电镜下(如图1所示)C组(见图1a)：肺泡II型上皮细胞核染色质分布均匀，核膜清晰可见，胞浆内线粒体、内质网、核糖体等细胞器形态结构基本正常，含有肺泡表面活性物质的板层颗粒较多，显示有轻微排空，细胞膜完整，表面有较多微绒毛突起。IR组(见图1b)：肺泡II型上皮细胞核染色质出现边集现象，核膜可见，胞浆内可见各细胞器，其中线粒体和内质网出现明显肿胀，板层颗粒较少并出现空泡化现象，细胞膜完整，表面有少量微绒毛突起。CP组(见图1c)：肺泡II型上皮细胞核内染色质分布均匀，核膜清晰可见，胞浆内线粒体、内质网、核糖体等细胞器形态结构基本正常，含有肺泡表面活性物质的板层颗粒保持较好，无明显排空，细胞膜完整，表面有较多微绒毛突起。光镜下(如图2 所示)C组肺组织结构完整，肺泡腔、肺血管、肺间隔及支气管结构无异常改变。IR组肺泡明显扩张，肺泡透明膜形成，肺间隔增厚，肺血管扩张，支气管内皮损害严重。CP组：肺泡轻度扩张，肺泡腔未见透明膜形成，肺间隔无明显增厚，支气管内皮损伤轻微。

综上，与IR组比较，CP组的BALF总蛋白、肺组织MDA含量、LWC以及再灌注后MPAP明显降低，肺组织SOD活性明显增高，组织病理形态学变化明显减轻。NHE1抑制剂卡立泊来德(HOE642)预处理可能通过抑制离子耦联机制降低再灌注过程细胞内钙超载，减轻钙依赖的黄嘌呤氧化酶途径的氧自由基释放，同时通过促进内源性抗氧化途径，增强组织抗氧化能力，从而有效减轻肺热缺血再灌注损伤。

Claims

1.一种新型灌注保存液，由人体或动物的生理范围内的电解质成分、营养底物、胶体活性物质、酸碱缓冲系统和钠氢通道1型(NHE1)抑制剂组成；灌注保存液中含NaCl：85.0mmol/L～145mmol/L、KCl：3.0mmol/L～30mmol/L、Na₂HPO4：0.7mmol/L～1.3mmol/L、NaH₂PO₄：0.7mmol/L～1.3mmol/L、NaHCO₃：15.0mmol/L～35.0mmol/L、葡萄糖：1.0mmol/L～50mmol/L、MgSO₄：0.9mmol/L～4.8mmol/L、羟乙基淀粉HES(130/0.4)：30g/L～100g/L或右旋糖酐40：2g/L～20g/L或白蛋白50g/L～100g/L、钠氢通道1型(NHE1)抑制剂HOE642：10umol/L～100umol/L、蒸馏水、其特征是：含有钠氢通道1型(HHE1)抑制剂。

2.根据权利要求1所述的新型灌注保存液，其特征是：钠氢通道1型(NHE1)抑制剂主要为HOE642。

3.根据权利要求1所述的新型灌注保存液，其特征是：钠氢通道1型(NHE1)抑制剂HOE642的浓度范围是10umol/L～100umol/L。

4.根据权利要求1所述的新型灌注保存液，其特征是：可用于人体或动物移植手术过程中，移植物的灌注和保存；也可用于相关的医学研究和实验室研究。

5.根据权利要求4所述的新型灌注保存液，其中所述的移植手术特征是：自体移植、同质移植、同种异体移植或异种移植。

6.根据权利要求4所述的新型灌注保存液，其中所述的移植物特征是：人体或动物的器官及其所属部分、组织及其所属部分或细胞。