CN102870743B - 水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)室内活体保存方法。本发明原理以小麦作为毒源寄主，让携带RBSDV的灰飞虱成虫在小麦幼苗上传毒、后代灰飞虱若虫从小麦上获毒，从而在室内饲养条件下短期内持续大量获得带毒灰飞虱。本方法有效克服了RBSDV室内长期大量活体保存的技术瓶颈，解决了RBSDV毒源难以连续活体保存、毒源常规获取周期长、饲毒植株难以长期提供、饲毒若虫虫龄最小化难以操作等一系列技术难题。获得的带毒灰飞虱可随时支持水稻和玉米品种抗性鉴定，亦可作为RBSDV纯化和血清制备材料，解决了常规提纯时材料获取难、病毒含量低等难题。该发明应用将大大加快RBSDV的研究、开发与利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术
水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reovirdae)斐济病毒属(Fijivirus)，是一种由灰飞虱以持久性不经卵方式传播的病毒，主要侵染玉米引发玉米粗缩病和侵染水稻引发水稻黑条矮缩病，感病植株表现为植株生长受严重抑制矮缩，叶色浓绿，叶片、叶鞘及茎杆上可出现蜡滴状突起，水稻上后期可形成黑条斑，玉米叶背面有明显的粗糙感，重病株不抽穗或散粉不良，严重影响玉米、水稻产量。目前RBSDV主要分布于中国、朝鲜、韩国和日本等东亚国家及地区，我国玉米上1954年在新疆南部和甘肃西部首次发现、水稻上1963年在浙江省余姚县首次发生，后长期在华北、西北、华中、华东等地的玉米上、上世纪90年代主要在浙江中南部的籼稻上常年发生危害，并间断性爆发。水稻上2007年以来在江苏、山东各地呈暴发流行态势，目前该病在安徽、江西以及福建北部在内的长江流域中东部均有分布，对水稻生产造成了巨大经济损失。据江苏省植保站数据统计，2007年RBSDV引起的水稻黑条矮缩病在江苏盐城、连云港、泰州、淮安、扬州和徐州等地严重发生，当年发生危害的面积达2.05万hm2，2008年发展到2.67万hm2，绝收田块达2000hm2，2009年持续增长至33.3万hm2，严重影响了江苏等地水稻的安全生产。玉米上2005年以来在河北、山东、山西、江苏等省的夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米发生危害严重。据统计，2008年山东省发生面积达73.3万hm2，绝产1.67万hm2；大连市大面积发生，重病田块发病率达60％-80％，玉米粗缩病成为该区玉米上的重要病害。
病毒病的防治最为理想的方法是选育和利用抗病品种，这一工作的开展需要建立科学的抗性鉴定方法。由于RBSDV等由昆虫作为媒介的特殊传播方式，不能使用病汁液摩擦进行直接接种。研究者多采用在病株上饲喂方式获得携带RBSDV的灰飞虱进行病毒的接种，而罹病植株往往长势较差或受环境影响较大难以长期保存，病株在采集后需尽快饲毒，极大地限制了研究时间。另有报道可使灰飞虱从冷冻病株中获得RBSDV，但其获取带毒灰飞虱的效率与可操作性以及短期内获得大量带毒灰飞虱的可行性还有待进一步检验，且每次均需病株作为毒源。以上所述种种因素给围绕RBSDV开展的抗病品种选育工作和需要RBSDV活体材料进行各方面研究的工作带来了很大的难度。为解决这一技术瓶颈，发明人从田间小麦易感染RBSDV而普遍发生水稻黑条矮缩病的现象中得到启发，研究了一种在实验室内可长期活体保存RBSDV的方法，通过多次验证及连续循环试验证明这一方法可常年不间断获得大量高带毒率灰飞虱，可为水稻抗黑条矮缩病和玉米抗粗缩病的品种选育、病毒提纯和血清制备、病毒致病性及其分子机理研究等提供基本的材料和技术手段。
发明内容
本发明提供了一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法。
本发明的原理是以小麦作为毒源寄主，让携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱成虫在小麦幼苗上传毒、后代灰飞虱若虫从小麦上获毒，从而可以在室内饲养条件下短期内获得大量带毒灰飞虱。
在上述方法中“携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱成虫”初次是通过以下手段获得的。从田间采集的具有植株显著矮缩、平行于叶脉的短条状叶片皱折和白色蜡滴状突起等水稻黑条矮缩病或小麦绿矮病症状的新鲜植株，应用分子方法检测其携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条纹病毒，利用刚孵化的无毒灰飞虱若虫饲喂48h后移入健康水稻苗上过循回期，待灰飞虱长至4-5龄时，取出50头灰飞虱应用免疫学方法检测其携带水稻黑条矮缩病毒的带毒率。后期此带毒灰飞虱成虫可用本试验方法获得。
在上述方法中，带毒灰飞虱的有效接种虫量为4-6头/株。
所述用于接种灰飞虱的麦苗需用清水浸种24h，催芽48h，待麦种出现白色芽后播于1000ml烧杯中，每杯播15粒有效麦种，待麦苗长至2-4叶期时可用于接种。
所述孵化的灰飞虱在麦苗上的时间为15-20天，可根据麦苗实际生长状况，按常规方式管理尽量控制其不低于15天，待麦苗长势较弱时将灰飞虱移入健康水稻苗上过循回期。
所述为增加麦苗上孵化灰飞虱的数量，在接完有毒灰飞虱后以5头/株的虫量接入刚羽化无毒灰飞虱雌虫用于产卵，产卵时间为36h-48h。
所述获得可应用于接种鉴定试验携带RBSDV的灰飞虱需通过以下两种方法确认：一是从过循回期后的灰飞虱群体中随机抽取50头灰飞虱，采用免疫学方法检测其是否携带RBSDV，若全部或部分携带RBSDV，则可确认其已从麦苗上获得该病毒。二是从循回期过后的灰飞虱群体中随机抽取一定数量的灰飞虱，采用人工接种的方法接种健康小麦，若接种后的麦苗表现出水稻黑条矮缩病症状并通过分子手段证实其含有该病毒，则确认此灰飞虱已获毒。
本发明提供了一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法，利用其建立的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病的品种抗性鉴定方法有效地克服了灰飞虱从患病植株获毒其植株难以长期保存的技术瓶颈，拓宽了品种抗性鉴定时间。同时获得了进行RBSDV研究的动植物材料带毒灰飞虱和小麦病株，解决了水稻黑条矮缩病毒在室内难以持续活体保存的技术难题，为该病毒研究提供了可靠材料。这一方法可应用于水稻和玉米等品种资源的发掘鉴定、抗病品种选育和病毒致病性、血清学鉴定和分子生物学研究等众多领域。
附图说明
图1为携带RBSDV的灰飞虱成虫接种麦苗示意图。
图2为麦苗上孵化灰飞虱示意图。
图3为接种小麦发病症状示意图(A为感染RBSDV植株，B为健康植株)。
图4为接种RBSDV后小麦的RT-PCR检测示意图(M为Marker III；CK+为感染RBSDV植株；CK-为健康植株；1-10为接种小麦植株)。
图5为麦苗上扫出灰飞虱循回期后Dot-ELISA检测示意图(+为携带RBSDV灰飞虱；-为健康灰飞虱)。
具体实施方法
实施例1，水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法
①携带水稻黑条矮缩病毒的新鲜植株获得。
2010年9月于江苏赣榆县重病区采集具有典型“绿矮”症状的水稻。参照Trizol(Reagent)说明书方法提取水稻总RNA。根据已发表的RBSDV-S5-ORF2序列设计引物(引物由上海英俊生物技术公司合成)：
F：5′-TAATCAGCGCGATGTCTAC-3′
R：5′-CCCCCGCATCTAAGGAG-3′。
采用RT-PCR检测确定病株是否携带水稻黑条矮缩病毒。反转录按照M-MLV反转录酶(Promega)说明书进行。PCR扩增体系为：cDNA模板3.0μL，Taq plus酶0.5μL，dNTP(每份10mmol.L-1)0.5μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL，5’端引物(10pmol.L-1)1.0μL，3’端引物(10pmol.L-1)1.0μL，ddH2O16.5μL，合计25μL。反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带(800bp)(图4)。同时采用斑点免疫结合法(Dot-ELISA)确定病株不携带水稻条纹病毒(RSV)。挑选出3株仅含有水稻黑条矮缩病毒的水稻植株饲毒。
②无毒灰飞虱的获得
2010年4-5月从江苏农科院小麦田中采集灰飞虱若虫，在武育粳3号上饲养至成虫后，将灰飞虱雌虫单头置于饲养容器中产卵，取出雌虫进行水稻条纹病毒(RSV)带毒情况的鉴定，留取无毒虫的后代再同上法纯化一次，所获后代单雌系或混合群体即为无毒灰飞虱群体。后续饲养中每代次随机抽取群体中10％的灰飞虱采用Dot-ELISA法检测RSV，确保其不带RSV。为避免传毒介体污染，每次使用无毒虫前取60头Dot-ELISA法检测RSV和RBSDV(图5)，确定其为无毒虫。
③初始携带RBSDV灰飞虱成虫的获得
利用刚孵化的无毒灰飞虱若虫饲喂①述新鲜水稻或小麦病株，48h后移入健康水稻苗上过循回期，待灰飞虱长至5龄或成虫，取50头灰飞虱应用Dot-ELISA法检测其RBSDV带毒率。
④接种麦苗的获得
选用生产上常规使用的小麦品种均可，推荐品种有扬麦158、扬麦13、扬麦15、郑麦9023等。清水浸种24h，催芽48h，待麦种露白后播于1000ml烧杯中，每杯播15粒有效麦种，待麦苗长至2-4叶期时可用于接种。
⑤最佳有效接种虫量的确定
设不接虫空白对照CK，接无毒虫(4头/株)0、1、2、3、4、5、6、7、8头有效带毒虫/株的接种量共十个处理，每个处理4个重复。将③述灰飞虱成虫接于④述小麦苗上(图1)，48h后移走灰飞虱，然后按5头/株的接虫量接入②述刚羽化无毒灰飞虱雌虫，48h后移走。灰飞虱在麦苗上孵化并饲养至2龄左右(视麦苗生长情况决定，从卵出现时算起尽量在麦苗上待15天以上)(图2)。卵孵化后5-7天每日观察，根据观察结果决定将灰飞虱移至健康水稻苗上继续饲养过循回期。移到水稻苗上之前数一下总虫数，5龄或成虫时取虫检测灰飞虱带毒率时再数一下虫数计算存活率。灰飞虱移至水稻苗上之后收集麦苗用①述RT-PCR法检测麦苗病株率(图3)，剩下苗连根移至盆钵或-20℃保存研究RBSDV备用。由表1可见在有效接种虫量为4-6头/株时，灰飞虱的带毒率在60％以上，其存活率也在80％以上，所以确定最佳有效接种虫量为4-6头/株。
表1(4个重复平均值)
⑥最佳有效接种虫量的可靠性验证
按⑤述方法，设置4-6头/株有效接种虫量用⑤得到的带毒灰飞虱成虫继续接种小麦，每个处理仍4个重复，记录灰飞虱存活率、带毒率及小麦病株率，连续接种3次，验证此毒源保存方法的有效性。表2显示连续3次后灰飞虱带毒率在50％以上，确定4-6头/株有效接种虫量保存毒源方法是可靠的。同时从3个处理后麦苗的发病率88.9％以上可见此带毒灰飞虱具有较强的传毒能力，也具有显著的存活力(80.69％以上)。
表2(4个重复平均值)
本发明主要服务于针对水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病开展的抗性资源筛选、抗病品种选育、病毒致病性、分子生物学研究等工作。同时该项技术还可在植物抗病遗传学和抗水稻黑条矮缩病毒转基因的研究工作中作为生物学检测方法应用，为该领域的研究提供可靠的试验材料和技术，将大大加快该方面研究的进程。
上述实施不以任何形式限定本发明。
Claims (1)
1.一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法，其特征在于：将携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱，移到长至一定程度麦苗上36-48h，移出前述灰飞虱接入刚羽化的无毒灰飞虱雌虫若干头，36-48h后移出接入灰飞虱，待麦苗上孵化的灰飞虱长至2龄左右移至健康水稻苗上常规饲养至5龄或成虫，即获得携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱，将获得的带毒灰飞虱重复上述步骤即可连续获得灰飞虱带毒虫，实现水稻黑条矮缩病毒室内连续活体保存，该方法的关键在于：1)毒源保存程序中，麦苗为毒源寄主；2)接入麦苗灰飞虱对水稻黑条矮缩病毒的带毒率不低于25％；3)初始接入灰飞虱时麦苗苗龄为2-4叶期；4)接入麦苗的对水稻黑条矮缩病毒带毒的灰飞虱虫量为4-6头/株；5)灰飞虱饲养温度为23-27℃。
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