CN102864088A - 一种基因工程乳酸杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明用物理化学诱变育种一种新型的能够分解多种尿毒素的乳酸工程菌,是将尿毒症患者血清作定向诱导,经双重多次诱变改变乳酸杆菌的基因而获得,可以将其制成生物制剂口服,让其定植于肠粘膜,持续分解尿毒素,用于治疗尿毒症或慢性肾功能衰竭。乳酸杆菌是人体肠道益生菌,定植于肠粘膜内层,其本身有增强免疫抑制病原菌,合成多种维生素及降胆固醇等功能。乳酸杆菌基因工程菌在降低多种尿毒素的基础上弥补了慢性肾衰患者免疫力低下、维生素缺乏和脂肪代谢紊乱的缺陷。为慢性肾衰提供一种综合治疗的生物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变的乳酸杆菌,具体涉及一种通过人为干预手段使乳酸杆菌突变后获得的一种基因工程菌。
本发明还涉及该基因工程菌的制备过程。
本发明还进一步涉及该基因工程菌的用途。
背景技术
慢性肾衰关键致病环节是尿毒症毒素在体内的过度潴留。而潴留于患者体内的尿毒素主要为尿素、肌酐、尿酸,其他毒素多为由此三种转化,衍生、结合的产物,如尿素可衍生为胍类和氨基甲酰化合物,肌酐可衍变为氢氧化肌酐和甲基胍。三种毒素及其衍生物在尿毒症患者体内蓄积,可导致心肌损伤,肾小球功能进行性丧失,血小板功能障碍,高血压,神经系统损害以及甲状腺功能紊乱等,是引起尿毒症症状,导致机体内环境紊乱,器官损害包括肾功能进行性恶化、判断透析疗效及病人预后的主要物质。因此,清除这些尿毒素对于慢性肾衰的治疗是十分重要的。目前,慢性肾衰仍缺乏满意的治疗,主要靠血透、腹透和肾移植治疗。但这些治疗均存在其固有的弊端。由于经济费用高,耗时长,操作复杂,全世界仅有15%的肾衰患者可以接受透析治疗,某些尿毒素在血液中与白蛋白结合,血透难以将其清除,如硫酸吲哚酚和同型半胱氨酸,它们能刺激血管平滑肌细胞增殖,减少肾脏清除超氧化物质,不仅加重残余肾衰竭而且是并发心血管病变的主要危险因素。且血透并发症较多,在美国大约每年有80000肾衰患者死于透析相关的各种并发症。肾移植供求矛盾尖锐,在美国肾源和需要移植的比例为1∶8,接受透析的病人中,因存在至今尚未突破的医疗难题,透析患者中约有50%在3年内死亡。由于在我国大部份地区仍处于发展中甚至贫困状态,能接受透析和肾移植的CRF患者仅达15%,而85%的CRF患者得不到有效的救治。而另一类不可忽视的状况是已出现肾功能不全但未达到透析标准的病人比需要透析病人多5-10倍。而对于这一部分病人的治疗,疗效被公认的是用血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotension converting enzyme inhibitors,ACEI)和血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin II receptor antagonists,ARB),这两类药主要通过降低肾小球内高压力,高灌注和高滤过,延缓肾功能恶化,但忽略了已积聚在体内的代谢产物对包括肾脏在内的所有组织细胞的损害和功能恶化。因而探索 一种经济、创伤小的慢性肾衰替代治疗显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种能表达多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌,能使之应用于持续分解多种尿毒素,从而提供一种能用于治疗慢性肾脏衰竭、尿毒症等疾病的药物。
本发明提供了具有保藏号为:CCTCC NO:M2011171的基因工程乳酸杆菌。
其保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心,地址为中国武汉武汉大学(邮编:430072)。保藏菌种的分类命名为保加利亚乳杆菌突变株25号(Lactobacillus bulgaricus mutant 25号)。保藏日期为2011年5月17日。
本发明提供的基因工程乳酸杆菌是可以用保加利亚乳酸杆菌经尿毒症患者血清定向诱导后,再经紫外线和硫酸二乙酯双重多次诱变后,通过尿毒素筛选平板反复筛选获得。
一种产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的制备方法如下:
运用尿毒症患者血清定向诱导原始保加利亚乳杆菌(L.Bulgaria,L.B),使其对各种尿毒素均具有一定的降解能力(见图1)。以定向诱导后分解能力最强的L.B诱导株为出发菌株,运用紫外线(UltraViolet,UV)及硫酸二乙酯(Diethylsulfate,DES)对其进行双重多次诱变,在尿毒素筛选培养基中筛选出具有高效分解尿毒素能力的L.B突变株(见图2)。
所述的定向诱导方法为:使L.B在尿毒症患者血清中连续培养25代。
所述的双重多次诱变的具体方案见图14:
UV诱变的条件为:取细菌对数生长期的中后期14--16h为诱变的时间点,细菌浓度为1.5×108cfu/ml为诱变浓度,30W紫外灯,照射距离30cm,照射时间为15s进行诱变。
DES诱变条件为:取细菌对数生长期的中后期12--14h为诱变的时间点,细菌浓度1.5×108cfu/ml为诱变浓度,DES浓度为1%,处理时间为20min进行诱变。
所述的初筛平板1为尿毒素浓度梯度MRS培养基,其具体配制方法为:先倒入普通MRS琼脂培养基,倾斜培养皿约15°,待凝固后平放,再倒入含20%(v/v)尿毒症患者血清的MRS琼脂培养基。冷却凝固后,倒置于4℃贮存。
所述的初筛平板2为尿毒素为唯一氮源培养基,其具体配制方法为:葡萄糖20g,乙酸钠5.0g,柠檬酸二铵2.0g,吐温801ml,MgSO4·7H2O 0.2g,MnSO4·4H2O 0.05g, K2HPO4 2.0g,琼脂15g,调pH值到6.12~6.2,蒸馏水定容至1.0L,115℃高压灭菌20min。待液体冷却到45℃左右,加入过滤除菌的尿毒症患者血清,使其终浓度为20%(v/v),再铺平板。冷却凝固后,倒置于4℃贮存。
所述的复筛培养基为:尿毒症患者血清。
本发明提供的产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌的具体制备步骤如下:
1、产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的定向诱导:将活化的L.B以4%(v/v)接种于尿毒症患者血清中,振荡混匀后厌氧培养24小时,为第1代。混匀后取1%置于新的尿毒症患者血清中,振荡混匀后37℃厌氧培养24h,为第2代。如此反复传代至25代后取出检测该菌分解尿毒素的能力。
2、产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的双重多次诱变:选择定向诱导后,分解尿毒素能力最强的L.B诱导株作为出发菌株,根据前述的诱变方案进行双重多次诱变。取细菌对数生长期的中后期(16小时)为诱变的时间点,细菌浓度为1.5×108cfu/ml,30W紫外灯,照射距离30cm,照射时间为15s进行紫外线诱变,反复诱变3次后,涂布初筛平板1和2。分别挑取尿毒素筛选平板1上尿毒素浓度高的部位、生长直径较大的菌落以及尿毒素筛选平板2上生长良好的菌落400株接种于尿毒症患者血清中培养24h,每株1管,检测培养前后,血清中尿毒素的浓度,计算尿毒素转化率[尿毒素转化率(%)=(培养基中尿毒素初含量-培养基中尿毒素终含量)/培养基中尿毒素初含量]。挑选出尿毒素转化率较出发菌株提高大于5%的菌株50株,接种于尿毒症患者血清中培养24h,每株4管,检测培养前后,血清中尿毒素的浓度,计算尿毒素转化率。选择尿毒素转化率最高的一株作为进一步DES诱变的出发菌株。取细菌对数生长期的中后期(14h)为诱变的时间点,细菌浓度为1.5×108cfu/ml,DES浓度为1%,处理时间为20min进行DES诱变。反复诱变3次后,涂布初筛平板1和2。分别挑取尿毒素筛选平板1上尿毒素浓度高的部位、生长直径较大的菌落以及尿毒素筛选平板2上生长良好的菌落400株接种于尿毒症患者血清中培养24h,每株1管,检测培养前后,血清中尿毒素的浓度,计算尿毒素转化率。挑选出尿毒素转化率较出发菌株提高大于5%的菌株50株,接种于尿毒症患者血清中培养24h,每株4管,检测培养前后,血清中尿毒素的浓度,计算尿毒素转化率。选择尿毒素转化率最高的一株为我们的目的菌株。
目的菌株降解尿毒素的能力较非诱变L.B显著提高,高浓度尿毒素血清中可以持续分解多种尿毒素。
本申请人还发现,本发明提供的乳酸杆菌,与非变异的乳酸杆菌一样,可以在动物 体肠道存活、繁殖,并持续发挥治疗慢性肾功能衰竭的作用。
鉴于此,本申请人认为,该基因工程乳酸杆菌可以用于制备治疗慢性肾衰竭、尿毒症等疾病的药物。本申请人通过实验证明前述推论。
附图说明
图1:尿毒症患者血清诱导L.B 25代之后对尿毒症毒素的作用(n=5)。a,诱导L.B肌酐的作用;b,诱导L.B对尿素的作用。A.空白对照组;B.诱导L.B组。*P<0.05vs空白对照组。
图2:双重多次诱变后L.B对尿毒症毒素的作用(n=4)。a:诱变L.B对肌酐的作用;b:诱变L.B对尿素的作用。A.空白对照组;B.诱导L.B组。C.诱变L.B组。*P<0.05vs空白对照组,#P<0.01vs诱导L.B组。
图3:L.B的生长曲线图
图4:诱导L.B行UV诱变的致死率曲线
图5:诱导L.B行DES诱变的致死率曲线
图6:产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌遗传稳定性试验。a:产肌酐水解酶L.B稳定性研究;b:产尿素酶L.B稳定性研究。*P<0.05vs空白对照组,#P<0.01vs诱导L.B组。
图7:产多种尿毒素分解酶的乳酸杆菌基因工程菌脲酶活性检测。
图8:各组大鼠不同时间点血肌酐,尿素氮水平。A:各组大鼠不同时间点血肌酐水平;B:各组大鼠不同时间点血尿素氮水平。*P<0.01vs假手术组,#P<0.01vs模型组,△P<0.05vs保加利亚乳杆菌组。
图9:各组大鼠不同时间点血脂的变化。A:各组大鼠0~8w血TG变化,B:各组大鼠0~8w血TC变化,C:各组大鼠0~8w血HDL变化。模型组大鼠血TG、TC明显升高,HDL明显下降,饲菌组血TG、TC较模型组明显升高,HDL较模型组明显下降 *P<0.05vs假手术组,#P<0.05vs模型组
图10:各组大鼠肾脏组织病理改变。A:(a-d)各组大鼠肾组织HE染色(×200);(e-h)各组大鼠肾组织Masson染色(×200)。
图11:肾间质损伤系数评分。*P<0.05,与假手术组比较,#P<0.05,△P<0.01与模型组比较,▲P<0.05与保加利亚乳杆菌组比较。
图12:肾间质胶原面积评分。*P<0.05,与假手术组比较,#P<0.05,△P<0.01与模型 组比较,▲P<0.05与保加利亚乳杆菌组比较。
图13:免疫组化检测各组大鼠肾脏组织中TGF-β1及FN表达情况。A:(a-d)各组大鼠肾组织TGF-β1表达情况(×400);(e-h)各组大鼠肾组织FN表达情况(×400).免疫组化:模型组大鼠肾组织TGF-β1及FN表达明显上调,饲菌组TGF-β1及FN的表达较模型组明显下调。(×400);B:肾组织TGF-β1免疫组化半定量分析,C:肾组织FN免疫组化半定量分析。*P<0.05,与假手术组比较,#P<0.05,△P<0.01与模型组比较,▲P<0.05与保加利亚乳杆菌组比较。
图14:双重多次诱变的具体方案流程图。
具体实施方式
以下实施方式及实施例旨在说明本发明,而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
1、产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的定向诱导:将活化的L.B以4%(v/v)接种于尿毒症患者血清中,振荡混匀后厌氧培养24小时,为第1代。混匀后取1%置于新的尿毒症患者血清中,振荡混匀后37℃厌氧培养24h,为第2代。如此反复传代至25代后取出检测该菌分解肌酐、尿素的能力。
2、产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌的双重多次诱变
选择定向诱导后,分解尿毒素能力最强的L.B诱导株作为出发菌株,根据权利要求4所述的诱变方案进行双重多次诱变。
1)UV多次诱变:取细菌对数生长期的中后期(16h)为诱变的时间点,细菌浓度为1.5×108cfu/ml,30W紫外灯,照射距离30cm,照射时间为15s进行紫外线诱变,反复诱变3次后,涂布初筛平板1和2。
2)DES多次诱变:选择尿毒素转化率最高的UV诱变株作为进一步DES诱变的出发菌株。取细菌对数生长期的中后期(14h)为诱变的时间点,细菌浓度为1.5×108cfu/ml,DES浓度为1%,处理时间为20min进行DES诱变。反复诱变3次后,涂布初筛平板1和2。
3)初筛:分别挑取尿毒素筛选平板1上尿毒素浓度高的部位、生长直径较大的菌落以及尿毒素筛选平板2上生长良好的菌落400株接种于尿毒症患者血清中培养24h,每株1管,检测培养前后,血清中肌酐、尿素氮的浓度,计算肌酐转化率[肌酐转化率(%)=(培养基中肌酐初含量-培养基中肌酐终含量)/培养基中肌酐初含量]和尿素转化率[尿素转化率(%)=(培养基中尿素氮初含量-培养基中尿素氮终含量)/培养基中尿素氮初含量]。
复筛:挑选出肌酐、尿素氮转化率较出发菌株提高大于5%的菌株50株,接种于尿毒症患者血清中培养24h,每株4管,检测培养前后,血清中尿毒素的浓度,计算肌酐、 尿素转化率。选择肌酐、尿素转化率最高的一株进行下述的试验。
实施例2
细菌分解肌酐、尿素能力的测定:将实施例1得到的L.B活化,制成菌液,按4%的量接种于MRS肉汤培养基充分混匀后,37℃厌氧培养至对数期后取出,用无菌生理盐水反复洗涤,离心3次后,生理盐水重悬,麦氏比浊法调整各管悬菌液OD625为0.08~0.1,约为1.5×108cfu/ml,各取200ul悬菌液加入800ul尿毒症患者血清中,37℃厌氧培养,分别于24h,48h取出,40000rmp/min,离心5min,取上清液检测肌酐、尿素氮浓度。取200ul生理盐水加入上述培养基中作为对照组,每组设5个平行管。培养前后运用jaffe氏法、UV-GLDH法,用Hitachi7170A型全自动生化仪上检测培养基中的肌酐或尿素氮的浓度。结果见图2。
出发菌株生长曲线的测定:将活化好的L.B菌株接种于MRS肉汤培养基中,37℃培养32h,按3%接种量接种到MRS肉汤培养基三角瓶中,置于厌氧培养罐中,37℃恒温培养。每间隔2h取3mL发酵液,在600nm波长下测定OD值,以时间为横坐标,OD值为纵坐标作图,得到该菌株的生长曲线。见图3。
细胞悬浮液的制备:将L.B于MRS肉汤培养基中培养至对数生长期的中后期,在10000rpm/min条件下离心10min,收集沉淀得菌体。用0.85%的生理盐水(已灭菌)将菌体制成悬浮液,再离心、洗涤菌体3次。将菌悬液适当稀释,用麦氏比浊法制备成108cfu/mL,将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内,振荡20~30min,以充分打散细胞,备用。
UV诱变处理:紫外灯照射前,先开灯预热20min~30min,然后取6mL菌悬液置于直径9cm的培养皿中,在磁力搅拌器搅拌的过程时,静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌,然后打开皿盖,用30W紫外灯分别照射5s、15s、30s、45s、60s、75s、90s和120s,紫外灯距离30cm下,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭搅拌和紫外灯(开启培养皿盖同时记时,达到要求时间后立即盖上皿盖)。
DES诱变处理:取4ml悬菌液,加入16ml pH7.0PBS,加入0.2ml DES(比重1.18,分子量154),使其终浓度分别为1.0%。于37℃震荡处理5、10、15、20、30、40min,诱变结束后,加入2.5倍25%的硫代硫酸钠终止反应。
测定相应的致死率:取0.1ml诱变后的菌液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度(-4、-5、-6)倾注MRS平板进行计数(避光培养)。致死率=(未经处理的每毫升活菌数-经处理的每毫升活菌数)/未经处理的每毫升活菌数。UV致死率见图4,DES致死率见 图5。
实施例2
本发明提供的产多种尿毒素分解酶乳酸杆菌稳定性研究:将诱变得到的目的菌株在尿毒素MRS肉汤培养基中培养,然后按4%的量传代,培养24h为1代,每间隔1代取出一定悬菌液,用生理盐水洗涤后,重悬,用麦氏比浊法调整各管悬菌液浓度为108cfu/ml,各取200ul悬菌液加入800ul尿素或者肌酐MRS肉汤培养基中,37℃培养24h,40000rmp/min,离心5min,取上清液检测肌酐、尿素氮浓度。取200ul生理盐水加入800ul尿素或者肌酐MRS肉汤培养基中作为对照组,每个菌株设5个平行管。见图6。
粗酶液的制备
①分别将非诱变L.B及诱变L.B在尿毒素MRS肉汤培养基中37℃培养16小时后挑取单菌落分别接种于2mLMRS肉汤中,过夜再培养。
②过夜培养的高产菌200ul接种于10mL含1%尿毒素MRS肉汤培养基中,37℃静置培养至OD600约1.0,随后4℃(离心机预冷)4000g/min,离心20min,弃上清液。
③沉淀用冰冷的50mmol/l pH7.5PBS洗涤3次(反复离心,弃上清,混匀),再用适量的上述缓冲液重悬菌体。
④超声破碎,功率300W,破碎时间10min(每开3秒,间停3秒)。整个过程在冰上进行。
⑤破碎液在4℃10000g/min离心30min,去除细胞碎片,取上清液,得到粗酶液。
肌酐水解酶的活性测定:取0.1mL上述粗酶液加入到37℃预温的0.9mL含100mmol/L肌酸的磷酸缓冲液(50mmol/L,pH7.5)中,混匀,37℃反应10min。迅速移取0.1mL反应液至1mol/LNaoH和0.5%苦味酸中(各1m)中终止反应,加入0.9mL蒸馏水,于25℃显色10min后于520nm处测吸光值为ODtest。同时,取0.1mL 50mmol/l PH7.5PBS加入到37℃预温的0.9mL含100mmol/L肌酸的磷酸缓冲液(50mmol/L,PH7.5)中,混匀,37℃反应10min。迅速移取0.1mL反应液至1mol/LNaoH和0.5%苦味酸中(各1m)中终止反应,加入0.9mL蒸馏水,于25℃显色10min后于520nm处测吸光值为ODblank。按下式计算酶活力:
酶活力(u/mL)=(Atest-Ablank)xVtxB/4.65xDxTxVe
式中:Vt显色反应液总体积(3mL);B酶反应液体积(1mL)/显色样品液(0.1mL);4.65橘红色物质的微摩尔消光系数;D比色杯光径(1cm);T酶反应时间(10min);Ve酶液体积(0.1mL)。
酶活力定义:37℃、pH7.5,每分钟催化生成1umol肌酐所需酶量为一个酶活力单 位(u)。
蛋白浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。
酶比活(u/mg):每毫克酶蛋白所具有的酶活性。酶比活=酶活性/蛋白浓度。见表1。
表1肌酐水解酶活性检测结果
脲酶活力测定:取50~100uL提取的脲酶蛋白液加入尿素缓冲液(50mmol/L尿素,50mmol/L EDTA,50mmol/L HEPES,pH 7.4)中,使终体积为1mL,37℃水浴温育6h。每隔2h吸取反应液,转入加有1.5mL酚-硝普纳的离心管中,并加入1.5mL碱-次氯酸钠,均匀混合。37℃水浴温育30min后,用分光光度计测定625nm波长下OD值。利用煮沸后的上清液作为空白对照。配制不同稀释倍数氨溶液做氨标准曲线(采用2∶1摩尔数的NaOH和(NH4)2SO4配制成1.0mM、2.5mM、5.0mM、10mM、25mM、50mM、100mM和500mM标准NH3溶液)。脲酶活力定义为:1U/g等于1g酶蛋白1min释放1μmolNH3。见图7。
实施例3
诱变菌株治疗实验性肾衰的疗效观察
肾切除模型建立:30只雄性6周龄SD大鼠,体重170-190g,适应性喂养1周,根据该周的饲料消耗量来决定实验开始时的饲料供给量。随机抽取8只作为假手术组,其余32只进行5/6肾切除。5/6肾切除模型制备方法:①第一步手术左肾2/3切除:称重后按10%水合氯醛0.35mL/100g麻醉,于下腹正中偏外消毒皮肤,抽药1mL皮试针垂直刺入腹壁,回抽无血液和尿液,即注入。麻醉成功后将四肢俯卧位固定于手术板。先触摸到左肋脊角,再确定左肋脊角下1cm、脊柱外0.8cm为中心向上下作切口,局部剪毛、碘伏消毒。带无菌手套,铺无菌洞巾。切开皮肤后,于皮下背肌红白交界处作为解剖标志,以平行脊柱作小切口,然后向深部分离肾周脂肪组织,即可在腹膜外分离出肾脏。剥离肾包膜后,于上极和下极以与水平线呈30°角等量切除肾,切除总量占左肾2/3。立即以小块明胶海绵贴于创面,用镊子夹在贴有明胶海绵的上下两极,轻轻还纳。肌层用4号缝合丝线、皮肤用7号缝合丝线缝合创口,单笼喂养7天后合笼,术后当日始腹 腔注射青霉素72万u/kg,每天1次,连用3天。②第二步手术右肾全切除:第一步手术1周后进行,称重、麻醉、固定、剪毛、消毒、切开皮肤皮下组织及分离出肾脏同第一步手术,剥离肾包膜至肾蒂近端,止血钳于肾蒂近端钳夹肾蒂,4号缝合丝线结扎肾蒂,再于远端切除肾脏。分别以4号和7号线缝合皮下组织及皮肤。单笼喂养7天后合笼,术后当日始腹腔注射青霉素72万u/kg,每天1次,连用3天。③假手术组同期也进行两步手术,第一步只分离出左肾,剥离肾包膜后,不作任何切除即还纳肾脏,其余同5/6肾切除第一步造模手术;第二步只分离出右肾,剥离肾包膜后,不作任何切除即还纳肾脏,缝合切口。单笼喂养7天后合笼,术后当日始腹腔注射青霉素72万u/kg,每天1次,连用3天。
实验分组:①假手术组(n=8):无菌生理盐水2mL/d,灌胃,每天1次;②5/6肾切除模型组(n=8),简称模型组:无菌生理盐水2mL/d,灌胃,每天1次;③保加利亚乳杆菌组(n=7):原始非诱变保加利亚乳杆菌悬菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d,灌胃,每天1次;④基因工程乳酸杆菌组(n=7),基因工程乳酸杆菌悬菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d,灌胃,每天1次。
各组大鼠不同时间点血肌酐、尿素氮水平变化:各组分别于给药前及给药后2,4,8周末,眼眶取血1-1.5ml,用Hitachi7170A型自动生化分析仪分别测定血清标本中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN),结果见图8。
各组大鼠不同时间点血脂的变化:各组分别于给药前及给药后2,4,8周末,眼眶取血1-1.5ml,用Hitachi7170A型自动生化分析仪分别测定血清标本中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL),结果见图9。
各组大鼠于给药后8周,10%水合氯醛0.35mL/100g麻醉大鼠,手术板固定大鼠,于腹中线剪开腹部皮肤及腹肌层,推开肠管残肾,迅速剥离残肾周围的结缔组织,摘除残肾,沿矢状面剖开残肾,无菌生理盐水冲洗,无菌纱布轻轻吸干组织表面水分,放入4%多聚甲醛溶液中固定24h,再依次浸入70%乙醇30min、80%乙醇30min、95%乙醇2次各30min、无水乙醇2次各30min、二甲苯透明2次各15min后,置于包埋盒中,60℃浸蜡3h。冷却后切片贴于多聚赖氨酸处理过的洁净玻片上,60℃烤片2h,2-3μm厚切片供常规HE,Masson染色,4μm厚切片供免疫组化检测。
各组大鼠肾脏组织病理改变:①苏木素-伊红(HE)染色:2-3μm厚石蜡切片常规脱蜡,经各级乙醇至水,苏木素室温染核7min,快速自来水冲30~60秒,1%盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗1min,伊红室温染2min,自来水冲洗1分钟。梯度酒精脱水,二甲苯透明1 分钟,中性树胶封片。结果核染蓝色,胞浆染红色。②Masson染色:2-3μm厚石蜡切片常规脱蜡,经各级乙醇至水,苏木素室温染核3min,快速自来水冲洗30~60秒,丽春红酸性品红液中染30-60min,自来水冲洗1分钟,1%磷钼酸中染1min,不洗直接入2%苯胺蓝液染3-5min,水速洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明1分钟,中性树胶封片。胶原纤维染蓝色,见图10③肾小管间质损伤评价:在200倍光学显微镜下依次观察左上、左下、右上、右下、中间共5个肾小管间质视野,按肾间质损伤8项指标评分,这8项指标分别为肾小管扩张、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞空泡变性、红细胞管型、蛋白管型、间质纤维化、间质水肿、间质炎性细胞浸润,计算均值作为该标本的肾小管间质损伤指数,见图11。④肾间质胶原面积评分:在400倍光学显微镜下,每个标本随机观察20个不重叠视野,计算肾间质阳性染色所占视野的百分比,将面积百分比进行半定量评分后取均值作为肾间质胶原面积评分见图12。
免疫组化检测各组大鼠肾脏组织中TGF-β1及FN表达情况:石蜡切片脱蜡,经各级乙醇至水,二甲苯I 2min,二甲苯II 2min,100%酒精2min,95%酒精3min,80%酒精1min,70%酒精1min,蒸馏水冲洗1min,PBS冲洗1min。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精入水后,置于3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2min×3次。然后浸入0.01M枸櫞酸盐缓冲液(pH6.0)中热修复抗原,冷却后滴加正常山羊血清封闭,室温孵育20分钟,继之按卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法(SP法)进行免疫组织化学反应,滴加一抗抗体稀释液(4℃孵育过夜);PBS冲洗,2min×3次。滴加生物素标记的羊抗兔IgG(37℃孵育30min);滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液(37℃孵育30min)。最后用葡萄糖氧化酶二氨基联苯胺(DAB)硫酸镍胺法显色,显微镜下掌握显色程度,适时蒸馏水终止。苏木素轻度复染,流水冲洗。依次用75%~80%~95%~100%脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、光镜观察。阴性对照组用PBS代替上述一抗进行反应,阳性着色为棕黄色颗粒,见图13A。图像半定量分析:200倍显微镜下观察,每组随机观察10个不含肾小球和动脉的肾小管间质视野,用Image-Pro PluS Version 6.0图像分析系统分析各视野下阳性目标光密度和阳性面积百分比,用平均光密度(IOD/area)代表指标表达量,见图13B,13C。
Claims (6)
1.一种基因工程乳酸杆菌,具有保藏号为:CCTCC NO:M2011171。
2.根据权利要求1所述的基因工程乳酸杆菌,其特征在于所述的基因工程菌是在保加利亚乳酸杆菌经物理化学诱变改变其基因,使其具有分解多种尿毒素的能力。
3.一种治疗尿毒症的药物,其特征在于含有权利要求1--所述的基因工程乳酸杆菌。
4.权利要求1或2所述基因工程乳酸杆菌的制备方法,其特征在于以下步骤:
运用尿毒症患者血清定向诱导原始保加利亚乳杆菌,使其对各种尿毒素具有一定的降解能力;以定向诱导后分解能力最强的保加利亚乳杆菌诱导株为出发菌株,运用紫外线及硫酸二乙酯对其进行双重多次诱变,在尿毒素症患者血清中筛选出产多种尿毒素分解酶的基因工程乳酸杆菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程乳酸杆菌的制备方法,其特征在于紫外线诱变的条件为:取细菌对数生长期的中后期14~16h为诱变的时间点,细菌浓度为1.5×108cfu/ml为诱变浓度,30W紫外灯,照射距离30cm,照射时间为10~20s进行诱变。
6.根据权利要求4所述基因工程乳酸杆菌的制备方法,其特征在于,硫酸二乙酯诱变条件为:取细菌对数生长期的中后期12~14h为诱变的时间点,细菌浓度1.5×108cfu/ml为诱变浓度,DES浓度为1%,处理时间为10~30min进行诱变。
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贺丽娟等: "乳酸菌对肠粘膜通透性及中小分子尿毒素清除的影响", 《中国血液净化》 * |
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