CN102863397B

CN102863397B - 喹喔啉酮酰胺类化合物、其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102863397B
Application number: CN201210382195.1A
Authority: CN
Inventors: 李荀; 施雷雷; 周建峰; 李志宇; 王海钠; 徐文方; 韩雪梅
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2032-10-10
Also published as: CN102863397A

Abstract

本发明公开了一种喹喔啉酮酰胺类化合物，结构通式如下，其中R₁为甲氧基或者氢，R为氢或卤素。本发明还公开了其制备方法和在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。该类化合物经过体外细胞水平和组织水平的活性评价发现能够有效抑制新生血管的生成，经MTT实验证明没有明显的细胞毒性，因此可用作新型抗肿瘤血管生成抑制剂。其中3个化合物（SLL-4，SLL-7，SLL-16）的抗血管生成活性优于阳性对照药物帕唑帕尼，进一步的体外筛选结果也可以初步说明这3个喹喔啉酮酰胺类化合物有望能够成为候选药物。总之，喹喔啉酮骨架用于设计合成抗肿瘤新生血管抑制剂是非常有前景的。

Description

喹喔啉酮酰胺类化合物、其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种喹喔啉酮酰胺类化合物，其制备方法和其在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。

背景技术

酪氨酸激酶抑制剂在抑制肿瘤血管新生过程中的成功应用，为靶向抗肿瘤药物的研发树立了典范。

新生血管形成于现存的微血管网，该过程极其复杂，主要由血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）信号通路介导。通常发生于伤口愈合、器官发生以及肿瘤增殖和转移等过程(Hoeben A，Landuyt B，Highley MS，et a/.Vascular endothelial

growth factor and angiogenesis.Pharmacol Rev.2004；56：549-80)。VEGF通过与细胞膜表面的受体(VEGF receptors，VEGFRs)结合诱导肿瘤血管的新生，该受体主要包括3个亚型：分别是VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。其中，VEGFR-2在肿瘤血管新生过程中起了关键作用(Niu G，Chen X.Vascular endothelial growth factor as an anti-angiogenic

target for cancer therapy.Current Drug Targets.2010；11：1000-17)。VEGFR-2与其配体VEGF结合后，VEGFR-2发生二聚化并激活胞内酪氨酸激酶区，而后自身磷酸化引发信号转导，从而诱导血管内皮细胞的增殖与迁移，同时血管通透性增加，这些过程均与肿瘤血管新生密切相关(Carmeliet P.Angiogenesis in life，disease and medicine.Nature

2005；438：932-6)。因此，开发VEGFR-2酪氨酸激酶小分子抑制剂来阻断肿瘤血管新生，这一策略对临床肿瘤的治疗具有非凡的意义。VEGFR-2已成为研发新型抗肿瘤血管生成药物的重要靶点。

迄今并未发现有关喹喔啉酮酰胺类衍生物作为VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂用于制备抗肿瘤血管生成药物中的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术的不足，提供一种喹喔啉酮酰胺类化合物，其制备方法和它在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。该类化合物具有特异性抑制肿瘤血管生成的活性，有望应用于靶向抗肿瘤药物领域。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种喹喔啉酮酰胺类化合物，具有以下结构通式的化合物：

式中，R₁为甲氧基或者氢，R为氢或者卤素。

当R₁＝H，R=3,4-二氯；R₁=OCH₃，R=H；R₁＝H，R=3-氯-4-氟，化合物SLL-4，SLL-7，SLL-16（图2）表现出了特异性抗肿瘤血管生成活性。且经MTT试验证明，上述化合物无细胞毒性。即所述通式化合物为以下化学物种之一：

本发明提供的喹喔啉酮酰胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：

a)用邻苯二胺或者取代的邻苯二胺与丙酮酸乙酯在乙醇中搅拌反应制备喹喔啉酮母核化合物(Ⅱ)；

b)化合物(Ⅱ)与溴代乙酸甲酯（或氯代乙酸甲酯）在弱碱、催化剂的作用下于丙酮中加热回流反应，分离纯化得化合物(Ⅲ)，然后将该化合物(Ⅲ)水解得到化合物(Ⅳ)；

c)化合物(Ⅳ)采用混合酸酐法，于反应溶剂中与苯胺或取代的苯胺缩合得到化合物(V)；

所述取代的邻苯二胺为4,5-二甲基邻苯二胺。所述取代的苯胺为3,4-二氯苯胺或3-氯-4-氟苯胺。

本发明所述的具有抗肿瘤新生血管活性的喹喔啉酮酰胺类衍生物的合成路线如下所示：

所述步骤b)中弱碱为K₂CO₃，催化剂为KI。

所述步骤b)中所述加热为油浴加热，回流反应时间为4～8小时。所述油浴温度为100℃～260℃。

所述步骤b)中分离纯化的具体步骤为：回流反应结束后将丙酮蒸干，固体残渣水洗过滤，滤饼烘干后用乙酸乙酯溶解，100～200硅胶拌样，进行柱层析分离纯化，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，浓缩溶剂后得雪白色晶体即为化合物(Ⅲ)。

所述步骤b)中水解反应的具体步骤是：称取上述步骤得到的化合物(Ⅲ)混悬于体积分数为67％的乙醇溶液中，搅拌下加入NaOH固体，室温反应待薄层色谱监测反应完全后将乙醇蒸干，1M的HCI调pH=3～4，反应体系中析出大量白色沉淀，静置过滤，干燥即得羧酸化合物(Ⅳ)。

所述步骤c)中混合酸酐法为：以无水四氢呋喃为溶剂，以4-甲基吗啉为催化剂，以氯甲酸异丁酯为反应的活化剂，冰盐浴下投料，而后在室温下反应生成混合酸酐。混合酸酐是一个活性中间体，生成后无需纯化可以直接和苯胺或取代的苯胺缩合成酰胺。

所述步骤c)中取化合物(Ⅳ)溶于无水THF中，冰盐浴下滴加4-甲基吗啉，而后滴加氯甲酸异丁酯，冰盐浴下反应生成混合酸酐后，往反应体系中加入苯胺或取代苯胺，撤去冰盐浴，反应在常温下反应至羧酸反应完全，蒸干THF，加入乙酸乙酯溶解后水洗，干燥，硅胶柱色谱分离，浓缩溶剂，收集产品得白色粉末状固体，即为化合物(Ⅴ)。

所述硅胶柱色谱分离的洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯=3∶2。

所述冰盐浴的温度是指：-5～-18℃；所述常温指的是10～30℃。

上述喹喔啉酮酰胺类化合物在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。

所述抗肿瘤血管生成药物为抗血管内皮细胞血管生成的药物。

所述血管内皮细胞为人脐静脉内皮细胞或大鼠动脉环内表面的内皮细胞。

本发明的有益效果是：本发明所述的具有抗肿瘤新生血管生成活性的喹喔啉酮酰胺类衍生物在体外细胞水平（人脐静脉内皮细胞，HUVEC）和大鼠动脉环水平做了抗血管生成活性筛选以及通过MTT验证了化合物的细胞毒活性。实验结果表明：三个化合物（SLL-4，SLL-7，SLL-16）均表现出明显的抗血管生成活性且强于阳性对照药—帕唑帕尼，MTT测试结果同时显示该类化合物无细胞毒活性。故本发明所述喹喔啉酮酰胺类衍生物有望开发出新型低毒，高效的肿瘤新生血管生成抑制剂。

附图说明

图1是喹喔啉酮酰胺类衍生物在细胞水平上抗新生血管生成结果图；

图2是喹喔啉酮酰胺类衍生物在大鼠动脉环水平上抗新生血管生成结果图；

图3是SLL-4的¹H-NMR谱图；

图4是SLL-7的¹H-NMR谱图；

图5是SLL-16的¹H-NMR谱图。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：

抗新生血管生成体外药理活性筛选（细胞水平），具体原理和测定程序简介如下：测定目标化合物对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）新生毛细血管管腔样结构形成的抑制作用。脐静脉内皮细胞在血管内皮生长因子的刺激下，在人工基底膜胶形成的凝胶体系中会形成毛细血管管腔样结构。原本呈卵石样外形的细胞，胞体被拉长并伴有芽生状管腔结构伸出而使胞体变得不规则。由此相邻的变形细胞间常以管状结构相互连接，沿细胞体纵轴或者外伸管状结构常可见有半透明的空泡或者裂隙出现。目前的研究认为：内皮细胞在人工基底膜的这些改变类似于其在体内的血管新生过程，因而可以用于评价不同药物对血管内皮细胞新生血管生成能力的综合影响。如果药物有效，则该过程被阻断，即管状结构无法形成。

取新生儿脐带，用D-Hanks液充分洗涤后，用2.5g/L的胰酶37℃水浴消化15min，离心收集脐静脉内皮细胞，重悬于含20％FCS（胎牛血清）的M199培养基中，接种于塑料培养瓶中，另向培养基中补加5ng/mL的VEGF₁₆₅（血管内皮生长因子165）及10ng/mL的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子，basic fibroblast growth factor）、0.3mg/mL的谷氨酰胺和青链霉素抗生素。于37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养12h后换液；4～6天后细胞融合，胰酶消化传代，取2～3代细胞用于实验。将Matrigel（基质胶）铺入预冷的96孔板中，每孔50μL，37℃固化1h；每孔加入含2×10⁴的HUVEC的培养基50μL，阳性对照组分别加入10μM，1μM，0.1μM三个浓度梯度的帕唑帕尼100μL，阴性孔以培养基作为对照，测试组加入和阳性对照药帕唑帕尼相同浓度梯度的化合物100μL，每组设3个平行孔；37℃和5％CO₂条件下孵育6h后采用Olympus荧光倒置显微镜观察实验结果。通过本次实验结果筛选出了SLL-4，SLL-7，SLL-16三个化合物。结果如图1所示。

实施例2：

测定目标化合物对大鼠动脉环体外微血管生成模型的抑制作用（组织水平）。原理如下：大鼠动脉环在人工基质胶的刺激下能够产生新的微血管网络，新形成的微血管由于和内皮细胞层相通，所形成的血管腔内表面的内皮细胞被拉长，互相交迭形成单细胞或多细胞桥。通过生成内皮细胞通路，大面积的纤维蛋白胶表面发生重构，网络和微血管得以形成。由于这种结构的形成跟血管发育的过程相同，所以该模型可以筛选评价不同药物对血管内皮细胞血管生成能力的综合影响。

取雄性大鼠一只，脱颈猝死，解剖取其主动脉，将其剪成厚度为1mm的动脉环洗净待用。将Matrigel（基质胶）铺入预冷的96孔板中，每孔60μL，而后每孔加入动脉环，37℃固化1h，固化完成后再加入40μL的Matrigel进行二次固化，动脉环固定完毕每孔加入100μL浓度为0.1μM的受试化合物(SLL-4，SLL-7，SLL-16)，阳性对照为帕唑帕尼，阴性孔加入100μL的培养基，进行3次独立实验。每隔48h换药一次，培养1周后采用Olympus荧光倒置显微镜观察结果。由大鼠动脉环实验结果（图2所示）可知：通过细胞水平筛选得到的化合物（SLL-4，SLL-7，SLL-16），其在组织水平上表现出的活性结果与细胞水平基本一致。

实施例3：化合物细胞毒分析（MTT法）

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞的数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。本次实验选择4种实体瘤贴壁细胞株用于受试化合物的细胞毒分析，分别是人子宫颈癌细胞HeLa，人卵巢癌细胞3AO，人乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞PC-3细胞株。

收集对数生长期细胞，调整细胞悬液密度，每孔加入100μL，铺入96孔板使其密度为5000个每孔，96孔板边缘加入PBS缓冲液填充。5％CO₂，37℃孵育24h，加入受试药物，药物浓度分别为100μM/L，10μM/L，1μM/L，0.1μM/L，每孔100μL，设置5个复孔。药物加完后于5％CO₂，37℃孵育48h。而后每孔加入20μLMTT（0.5％），继续培养4h。终止培养后倒掉96孔板中的培养基，每孔加入150μL的DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物彻底溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，通过吸光度值间接计算出受试化合物的半数抑制浓度IC₅₀值。测试结果见表1：

表1

实施例4：

SLL-4的制备：邻苯二胺5g（0.046mol）混悬于100mL的无水乙醇中，搅拌下滴加丙酮酸乙酯6.4g（0.055mol），于室温下搅拌反应，反应过程中析出大量的棉白色固体，TLC监测待原料消耗完后将反应液过滤，滤饼用无水乙醇洗涤3次，真空干燥即得化合物(I)，收率95％，m.p.=241～243℃。称取化合物(I)2g(12.5mmol)，溴乙酸甲酯2.3g（15mmol），K₂CO₃ 2.07g作缚酸剂，Kl0.2g（0.125mmol）作催化剂，将上述物质混悬于100mL丙酮中，于油浴上回流反应6h。旋转蒸发仪将丙酮蒸干后固体残渣水洗过滤，滤饼烘干后用乙酸乙酯溶解，用100～200目的硅胶拌样，进行柱层析分离纯化，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，除去溶剂后得雪白色晶体，收率86％，m.p.=121～123℃。

称取上述步骤得到的产物1g混悬于30mL体积分数为67％的乙醇溶液中，搅拌下加入0.4gNaOH固体，常温反应，待薄层色谱监测反应完全后将溶剂蒸干，用1mol/L的HCI溶液调节pH=3～4，反应体系中析出大量白色沉淀，静置过滤，干燥即得羧酸产物(IV)，收率95％。ESI：m/z=218.1；m.p.=225～226.5℃。

取0.2克羧酸产物(IV)溶于重蒸过的四氢呋喃中，冰盐浴下滴加4-甲基吗啉，而后滴加氯甲酸异丁酯，冰盐浴下继续反应30min，即生成混合酸酐，往反应体系中加入0.18克3,4-二氯苯胺，撤去冰盐浴，置于常温反应至羧酸(IV)反应完全（通过薄层板TLC监测）。蒸除溶剂，加入适量的乙酸乙酯溶解后水洗，无水硫酸钠干燥过夜，过滤滤液，100～200目的硅胶拌样，硅胶柱色谱分离，洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯=3∶2，浓缩并收集产品得白色粉末状固体，收率65％；m.p.=274～274.5°C；ESI：m/z=361.1；¹H-NMR(DMSO-d₆)：δ10.74(s，1H)，δ7.93（d，J=1.8Hz，1H），δ7.79(dd，J₁=8.4Hz，J₂=1.8Hz，1H)，δ7.59(d，J=8.4Hz，1H)，δ7.58(dd，J₁=8.4Hz，J₂=1.8Hz，1H)，δ7.50(m，2H)，δ7.38(t，J=8.4Hz，1H)，δ5.12(s，2H)，δ2.47(s，3H).

实施例5：

SLL-7的制备：SLL-7制备方法同SLL-4，产品为黄色絮状固体，质轻，收率70％；m.p.=257～258℃；ESI：m/z=353.1；¹H-NMR(DMSO-d₆)：δ10.42(s，1H)，δ7.57(t，J=7.8Hz，2H)，δ7.33(m，3H)，δ7.08(s，1H)，δ6.99(s，1H)，δ5.15(s，2H)，δ3.84(s，6H)，δ2.47(s，3H).

实施例6：

SLL-16的制备：SLL-16制备方法同SLL-4，产品为白色粉末状固体，收率46％；m.p.=260.5～261℃；ESI：m/z=345.1；¹H-NMR(DMSO-d₆)：δ10.66(s，1H)，δ7.87(dd，J₁=6.6Hz，J₂=2.4Hz，1H)，δ7.79(d，J=2.4Hz，1H)，δ7.78(d，J=6.6Hz，1H)，δ7.57(m，2H)，δ7.39(m，2H)，δ5.11(s，2H)，δ2.46(s，3H)。

Claims

1.一种喹喔啉酮酰胺类化合物在制备抗人脐静脉内皮细胞和大鼠动脉环血管生成药物中的应用，其特征在于，所述喹喔啉酮酰胺类化合物为以下化学物种之一：