CN102860419A - 含嗜酸乳杆菌的饲料添加剂在抗氧化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CGMCC No.5093的饲料添加剂在提高肉鸡抗氧化性能中的应用。本发明提供的嗜酸乳杆菌既对胃肠道环境具有较强的耐受性，由其制备的饲料添加剂添加进肉鸡饲料中后，可升高肉鸡血清中SOD、CAT，GSH-Px活力，降低血清和肝脏中的MDA含量。因此，该菌株可作为饲料添加剂或预混料添加进肉鸡的日粮中，提高肉鸡机体抗氧化性能，改善肉品质，具有广阔的应用前景。

Description

含嗜酸乳杆菌的饲料添加剂在抗氧化中的应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术，具体地说是涉及含嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）新菌株的饲料添加剂在抗氧化中的应用。

背景技术

动物体在新陈代谢的过程中会形成活性氧自由基，如超氧自由基(O₂ ^·_)、羟基自由基（HO·)、过氧化氢(H₂O₂)等，适量的自由基与稳定的氧分子维持着巧妙的生理平衡。活性氧自由基的消除主要依赖于机体的抗氧化防御系统的预防性或阻断性控制。机体内天然的抗氧化系统包括酶类及非酶类两大类，前者主要是指超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等。后者则是指一些小分子的有机物质，也称之为体内天然的抗氧化剂，如维生素E、维生素C、辅酶Q、半胱氨酸、谷胱甘肽及微量元素硒(Se)等。

由于许多化学合成的抗氧化物存在安全问题，因而发现安全的有抗氧化活性的天然产物，用以维持体内氧化还原的平衡，是一个人们长期关注和努力的问题。近年来的研究证实，乳酸杆菌具有不同的抗氧化活性，虽然其抗氧化活性己经得到了体内及体外实验的证实，但国内外的乳酸杆菌制品的研究状况表明还存在一些问题，尤其是应用于产品中的乳酸杆菌菌株的选择，既要有生理功能又要求菌体能耐受不利于生存的胃肠道的体内逆环境。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供含嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CGMCC No.5093的饲料添加剂在提高肉鸡抗氧化性能中的应用。

在本发明的一个实施方案中，所述饲料添加剂由嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093冻干粉和载体组成。

其中，所述载体优选为脱脂奶粉。

其中，嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093冻干粉和脱脂奶粉的重量比为：1～1.5：1～10。

其中，所述的嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093冻干粉的活菌数为10¹⁰-10¹¹cfu/g。

在本发明的一个实施方案中，将所述饲料添加剂添加到肉鸡基础日粮中，使所述嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093的活菌数在基础日粮中达到10⁷cfu/g以上。

本发明的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CGMCCNO.5093已在CN201110396544.0中公布。

本发明提供的嗜酸乳杆菌既对胃肠道环境具有较强的耐受性，由其制备的饲料添加剂添加进肉鸡饲料中后，可升高肉鸡血清中SOD、CAT，GSH-Px活力，降低血清和肝脏中的MDA含量。因此，该菌株可用于开发成饲料添加剂或预混料添加进肉鸡的日粮中，提高肉鸡机体抗氧化性能，改善肉品质，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1嗜酸乳杆菌的耐受性分析

益生菌在进入大肠之前必须适应或耐受胃中盐酸和小肠中高浓度胆盐的生活环境，能够与肠道内其它微生物竞争并达到可控制有害微生物繁殖所需的数量与存活率，这都是益生菌发挥作用的先决条件。

1.1耐酸性试验

嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌种活化2代后的液体培养物按2%（w/v）分别加入pH为2.0,3.0,4.0,7.0（对照）的PBS缓冲液中，混匀后置37℃培养箱处理2h，稀释到适当浓度，而后取0.1ml菌悬液，进行平皿菌落计数，计算酸处理过的菌株存活率：A₁/A₀×100%，A₁为处理2h后的每毫升活菌数（CFU/mL），A₀为pH 7.0时每毫升活菌数（CFU/mL）。

1.2胆汁酸盐耐受性试验

嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093菌种活化2代后的嗜酸乳杆菌液体培养物按2%接种量接入含猪胆汁酸钠分别为0%（对照），0.1%、0.2%和0.3%的PBS缓冲液中，混匀后置37℃培养箱处理2h,稀释到适当浓度，而后取0.1ml菌悬液，进行平皿菌落计数，计算酸处理过的菌株存活率：A₁/A₀×100%,A₁为处理2h后的每毫升活菌数（CFU/mL），A₀为pH 7.0时每毫升活菌数（CFU/mL）。

耐受性结果显示，经过37℃温育2h之后，嗜酸乳杆菌在pH2.0、pH 3.0、pH 4.0的存活率分别为49.2%、65.1%、89.6%。菌株在0.1%（w/v）、0.2%和0.3%浓度的猪胆盐经过37℃温育2h之后，存活率分别为95%，90%和78%。这表明该嗜酸乳杆菌菌株对胆盐有较好的耐受性。

实施例2嗜酸乳杆菌的饲料添加剂的制备

嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093的冻干粉的制备，包括如下步骤：

（1）菌株的活化：将-80℃冻存保存的嗜酸乳杆菌按10%的接种量向MRS液体培养基中，培养条件为37℃，转速为160rpm，培养20-24h；

（2）种子液的制备：将活化的发酵液按2%的接种量向发酵培养基中培养16h，所述的发酵培养基的成分及其质量体积比如下：葡萄糖1%，大豆蛋白胨2%，酵母膏1%,硫酸铵0.5%，磷酸氢二钾0.2%、氯化钠0.2%，硫酸镁0.05%；

（3）按1-2%的接种量向发酵培养基中接入（2）所提供的嗜酸乳杆菌种子液，发酵条件为：37℃，转速为160rpm，培养18h，得到的发酵液经5000rpm离心10min收集菌体，用灭菌蒸馏水洗涤后向菌体沉淀中加入20%（w/v）的冻干保护剂(配方为脱脂奶7%，海藻糖1.5%，甘油2.5%，谷氨酸钠1.5%，无菌水100mL)，-80℃冷冻干燥20h，制成活菌数为5×10¹¹cfu/g左右的冻干粉。

将制备的冻干菌粉中与脱脂奶粉按质量比1：10混合均匀，即可得到本发明的嗜酸乳杆菌活菌制剂。

实施例3含嗜酸乳杆菌的饲料添加剂在抗氧化中的应用

1.实验方法

1.1主要试剂

MDA、SOD、GSH-Px、CAT试剂盒由南京建成生物工程公司提供。

1.2实验动物及分组

选取健康1日龄商品代AA肉鸡48只，随即分成试验组和对照组两个处理，每个处理4个重复，每个重复6只鸡，试验期为21天。

1.3试验日粮与饲养管理

试验参照《家禽营养需要》（NRC,1994)设计，采用玉米-豆粕型日粮。对照组饲喂肉鸡常规日粮，试验组在常规日粮中添加实施例2所制备的活菌制剂（添加量为1‰），不含任何抗生素，使基础日粮中活菌数为5×10⁷cfu/g左右。

按照本试验鸡场的常规管理程序进行免疫和日常管理，试验在同一栏舍内进行，饲养方式为四层阶梯式笼养，每笼均放3只鸡，每日两遍给饲，即上午8:00，下午4:00。固定专人饲喂，自由采食，自动饮水器饮水，随时观察鸡群的生产情况，发现疾病及时治疗。

1.4测定指标

血清指标：超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)，丙二醛(MDA)，肝脏指标：MDA含量。各项指标按照南京建成生物工程公司试剂盒使用说明书进行测定。

1.5样品制备

第21天饲喂后禁食12h，每个重复组随即抽取3只鸡，取样测定各项指标。本发明中肉鸡血清的提取过程如下：肉鸡心脏取血，4℃静置24h，部分血液离心(10000rpm，10min)后分离红细胞和血清，测定SOD活力，GSH-Px活力，CAT活力，MDA含量。

本发明中肝脏组织匀浆的制备方法如下：肉鸡心脏采血后处死，取肝组织块，用预冷至4℃的生理盐水，除去血液，滤纸吸干，去掉结缔组织。称重后放入匀浆器中，加入9倍体积的预冷生理盐水，充分磨碎，使组织匀浆化。将稀释好的1:10组织匀浆液用低温离心机1500rpm离心10min，留上清液，测定MDA含量

1.6统计处理

所有数据均用统计软件SPSS16.0软件进行统计学处理，采用ANOVA过程进行方差分析，各处理间平均值的比较采用LSD多重比较进行差异显著性检验,以p<0.05为差异显著。各项指标结果以均值±方差（Means±S.D.）表示。

2.结果与分析

2.1肉鸡血清中SOD活力、GSH-Px活力的测定结果

SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。利用试剂盒所示方法测血清中SOD酶和GSH-Px活性值如表1所示。

表1嗜酸乳杆菌活菌制剂对肉鸡血清中SOD活性、GSH-Px活力的影响

注*：p<0.05，**：p<0.01

由表1可见，试验组肉鸡的血清中SOD活力和GSH-Px活力均高于对照组，而用血清中SOD活力显著升高（p<0.05），说明嗜酸乳杆菌活菌体制剂能够显著提高肉鸡血清中SOD活性，从而具有抵抗自由基损伤的作用；试验组GSH-Px活力与对照组相比有所提高，但统计学上无显著性差异（p>0.05），可能原因是GSH-Px酶已处于对抗衰老物质不敏感的状态。

2.2肉鸡血清中CAT活力和MDA含量的测定结果

表2嗜酸乳杆菌活菌制剂对肉鸡血清中CAT活力、MDA含量的影响

注：*：p<0.05，**：p<0.01

由2表可知，试验组肉鸡的血清中CAT活力显著高于对照组（p<0.05），而且试验组肉鸡的血清中MDA含量明显低于对照组（p<0.05）。在用嗜酸乳杆菌活菌制剂喂养后血清中的MDA含量都有所下降，且有显著性差异（p<0.05），说明嗜酸乳杆菌能够减少脂质过氧化物（LPO）的形成，具有良好的提高肉鸡抗氧化的功能。

2.3肉鸡肝脏组织中丙二醛(MDA)含量的测定结果

表3嗜酸乳杆菌对肉鸡肝组织中MDA含量的影响

注*：p<0.05，**：p<0.01

由表3可知，饲喂嗜酸乳杆菌活菌制剂的肉鸡肝脏组织中丙二醛（MDA）含量明显降低，与对照组相比达到显著水平(p<0.05)。由此可见，嗜酸乳杆菌活菌制剂对肉鸡肝脏组织中降低脂质过氧化物具有一定的作用，能够提高其中抗氧化酶活力。

可以看出，含嗜酸乳杆菌的饲料添加剂饲喂肉鸡后，能够升高肉鸡血清中SOD、CAT，GSH-Px活力，降低血清和肝脏中的MDA含量，从而提高肉鸡体的抗氧化功能，改善肉品质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.含嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）CGMCC No.5093的饲料添加剂在提高肉鸡抗氧化性能中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂由嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093冻干粉和载体组成。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的载体为脱脂奶粉。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，嗜酸乳杆菌CGMCCNo.5093冻干粉和脱脂奶粉的重量比为：1～1.5：1～10。

5.如权利要求2~4任一项所述的应用，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093冻干粉的活菌数为10¹⁰-10¹¹cfu/g。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述饲料添加剂添加到肉鸡基础日粮中，使所述嗜酸乳杆菌CGMCC No.5093的活菌数在基础日粮中达到10⁷cfu/g以上。