CN102854325A - 胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及胰岛素与血清蛋白结合指标的测定，具体涉及一种胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法及应用。本发明方法包括蛋白结合胰岛素、游离胰岛素、结合/游离胰岛素比值以及蛋白捕获胰岛素能力测定。经体外生化研究、培养细胞模型、病人血清指标检测、影响胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力的药物和血清成份、正常动物和糖尿病动物胰岛素与血清蛋白结合的亲和力改变对血糖的影响等试验验证，本发明方法获得的测定指标可进一步为糖尿病的预警、早期诊断、预后判断、药物筛选、指导预防和治疗提供实验数据和理论依据。

Description

胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及胰岛素与血清蛋白结合指标的测定，具体涉及一种胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法及应用。本发明方法可用于糖尿病的预警、早期诊断、预后判断、药物筛选、指导预防和治疗。

背景技术

现有技术公开了糖尿病是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病，其中90％以上为2型糖尿病(Type 2diabetes，T2DM)。胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中起重要作用，并贯穿于2型糖尿病全过程。胰岛素抵抗的发生机制尚不完全清楚，各种实验研究结果显示，胰岛素抵抗的发生多是与炎症反应、激素因子作用、内质网应激以及过量的营养产物在胰岛素敏感组织堆积等共同作用所致。妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期首次发生或发现的不同程度的糖代谢异常。GDM发病机制至今尚不清楚，它由多种因素作用所致，有研究报道，胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌降低是GDM发病机制的重要环节。

已知白蛋白是最主要的血浆蛋白之一，它可以作为一大类生物活性物质和药物的体内储存体和转运体。血清中的胰岛素大多与血清蛋白相结合。有研究表明：首先，在血清中存在两种不同形式的胰岛素，即游离胰岛素和与其它蛋白结合的胰岛素；游离胰岛素作为活性形式而结合胰岛素作为非活性形式存在；其次，血清白蛋白作为胰岛素的转运体和存储体。根据以上两点，研究者提出胰岛素抵抗发生机制的设想：假设并证实游离胰岛素是作为立即可供机体利用的形式，而结合胰岛素处于非活性状态，但可从结合蛋白质中分离从而保持游离胰岛素水平的稳定。研究者认为，在某些病理状态下则可以改变这种平衡，例如高脂血症和肥胖。如果血清白蛋白-胰岛素结合力增加，则可供利用的游离胰岛素水平降低；相反，如果血清白蛋白-胰岛素结合力降低，由于游离胰岛素半衰期很短，则可供利用的游离胰岛素水平在餐后上升而在空腹水平时下降；因此，不论是在哪种条件下，胰腺都要分泌更多的胰岛素以维持血糖在空腹和餐后状态下的正常水平；如果这种补偿机制失衡，则正常的空腹血糖水平无法维持。因此，本领域研究人员拟建立有关测定血清蛋白结合的胰岛素和未结合有其它蛋白的胰岛素的方法，为进一步证实上述设想并探讨影响白蛋白-胰岛素结合力的未知的病理因素及其发挥作用的机制，提供实验数据和理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰岛素与血清蛋白结合指标的测定方法，具体涉及一种胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法。本发明方法获得的测定指标可进一步为糖尿病的预警、早期诊断、预后判断、药物筛选、指导预防和治疗提供实验数据和理论依据。

本发明方法中，所述的亲和力指标，包括蛋白结合胰岛素、游离胰岛素、结合/游离胰岛素比值以及蛋白捕获胰岛素能力。

具体而言，本发明的胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法，其特征在于，其包括步骤：

1)检测胰岛素浓度

采用胰岛素检测试剂盒测定(Diagnostic System Laboratory，Webster，TX)血清和2％白蛋白中所含胰岛素水平；

为确定不同制备方法获得白蛋白中的胰岛素含量，本发明的实施例中，分别检测了4种市售白蛋白的胰岛素含量以及不同血清层及白蛋白溶液的胰岛素含量；

2)高压液相色谱分析(HPLC)分析白蛋白-胰岛素结合

HPLC检测胰岛素和白蛋白混合物中胰岛素含量，HPLC检测吐温处理的胰岛素和白蛋白混合物中胰岛素含量；

3)分离制备检测游离胰岛素和结合胰岛素

通过超滤离心柱(Microncon YM-30Centrifugal ultrafiltration tube，Millipore Corporation，Billerica，MA)分离溶液中的游离胰岛素和蛋白结合胰岛素；

4)测定白蛋白捕获胰岛素能力

采用一个固相系统检测胆固醇对白蛋白-胰岛素结合的影响，最大程度降低溶解胆固醇时需要的有机溶剂对实验的影响，包括白蛋白包被ELISA法检测不同血清层及白蛋白层的胰岛素含量。

本发明的进一步目的是提供所述的胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法的用途。

本发明中，进行了细胞增殖试验，采用MTT(Sangon，Shanghai，China)法检测实验大鼠主动脉内皮细胞(AEC)及实验小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)细胞活性的变化；

本发明中，进行了脂质和药物对胰岛素结合能力的影响试验，通过超滤离心柱分离所检标本，将超滤后的上下层溶液进行胰岛素检测；

本发明中，检测了脂质和药物影响胰岛素-白蛋白结合的作用对细胞增殖的影响；

本发明中，进行了动物实验，验证(1)含与不含胰岛素的白蛋白对正常和STZ诱导的I型糖尿病小鼠血糖的影响；(2)α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合以及血糖的影响；(3)外源性白蛋白对瘦素缺乏小鼠胰岛素抵抗的调节作用及机制。

本发明中，采用单因素方差分析和t检验，所有数据以平均值±标准误表示，以P＜0.05定义统计学有差异。

本发明中，进一步的从体外生化研究、培养细胞模型、病人血清相关指标检测、影响胰岛素与血清蛋白质可逆性结合的亲和力的药物和血清成份、正常动物和糖尿病动物胰岛素与血清蛋白结合的亲和力改变对血糖的影响等方面进行实验验证：

1)体外生化研究表明：市售的用冷乙醇沉淀法制备的白蛋白含有胰岛素(用热休克法制备的白蛋白不含胰岛素)；去垢剂可将胰岛素从白蛋白中分离，说明白蛋白-胰岛素结合是通过亲脂基团介导的非共价结合；亲脂基团介导的每个白蛋白分子平均结合约4个胰岛素分子，其中2个结合较松散，易解离；液体中蛋白结合的胰岛素和游离胰岛素的比例存在一种平衡，当游离胰岛素被清除后，结合于其它蛋白上的胰岛素可被释放，以补充被清除的游离胰岛素；白蛋白-胰岛素的解离与结合在化学是可逆的。

2)在体外培养细胞模型证实：白蛋白-胰岛素的解离与结合在维持细胞生长的功能上是可逆的。

3)病人血清指标检测显示，II型糖尿病人的血清未结合胰岛素和结合胰岛素的比例呈两极分化，或过高，或过低；含游离胰岛素的血清组份发挥促细胞增殖的能力快但持续时间很短，相反含蛋白结合胰岛素的血清组份发挥促细胞增殖的能力慢但持续时间长，总血清具有2者的共同作用，所有血清组份促细胞细胞增殖的功能均可被胰岛素受体酪氨酸激酶抑制剂HNMPA-(AM)3所抑制。

4)胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力受药物和血清成份调节：脂质如游离脂肪酸、甘油三酯、胆固醇和糖尿病治疗药物格列苯脲可以促进游离胰岛素的释放；低浓度α1抗胰蛋白酶明显增加结合胰岛素/游离胰岛素的比值；瘦素降低胰岛素与白蛋白的结合。

5)腹腔注射结合有胰岛素的白蛋白可降低正常小鼠的血糖，相反，注射未结合有胰岛素的白蛋白可升高正常小鼠的血糖；注射未结合有胰岛素的白蛋白可显著抑制胰岛素注射引起的血糖降低，防止低血糖休克，而注射结合有胰岛素的白蛋白则无此作用。

6)对STZ造成的胰岛素缺乏小鼠，注射可使正常小鼠休克的等量胰岛素对其血糖无显著影响，但事先注射结合有胰岛素的白蛋白，然后再注射胰岛素，则血糖显著下降，相反，如果事先改注未结合有胰岛素的白蛋白，则小鼠血糖明显高于仅注射胰岛素组；在体内，α1抗胰蛋白酶可通过与胰岛素竞争结合白蛋白，促使胰岛素从胰岛素-白蛋白复合物中解离和利用，从而调节血糖；白蛋白和瘦素两者竞争结合胰岛素，注射白蛋白可改变蛋白结合的胰岛素与游离胰岛素的比值，显著减轻瘦素缺乏糖尿病小鼠的病理异常和血糖升高，相反注射白蛋白可使非自发糖尿病的C57小鼠血糖升高。

本发明的胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法，尤其可测定血清蛋白结合的胰岛素和未结合有其它蛋白的胰岛素，该方法经实验证实了有关胰岛素抵抗发生机制的设想：假设并证实游离胰岛素是作为立即可供机体利用的形式，而结合胰岛素处于非活性状态，但可从结合蛋白质中分离从而保持游离胰岛素水平的稳定。本方法可用于探讨影响白蛋白-胰岛素结合力的未知的病理因素及其发挥作用的机制。

本发明方法获得的测定指标可进一步为糖尿病的预警、早期诊断、预后判断、药物筛选、指导预防和治疗提供实验数据和理论依据。

根据本发明方法获得的测定指标可进一步制备有关预防和治疗以及检测糖尿病的试剂盒，其中可包括检测白蛋白捕获胰岛素能力指标，白蛋白在血清中调节结合胰岛素、游离胰岛素浓度及其比值，高甘油三酯、胆固醇对胰岛素抵抗的影响指标，以及血清各组份结合胰岛素、游离胰岛素的功能指标等。

根据本发明方法，有关α-1抗胰蛋白酶与白蛋白相互作用可进一步应用于糖尿病诊断和治疗。根据本发明方法，有关瘦素与白蛋白相互作用可进一步应用于糖尿病诊断和治疗。

附图说明

图1白蛋白中胰岛素含量的检测，

ELISA 4种检测市售血清白蛋白BSA0281、A3803、HSA12666HSA、HSA126658中胰岛素含量，2nd Ab为不加抗白蛋白抗体的对照。

图2去污剂可将胰岛素从白蛋白中分离，

ELISA结果显示1％吐温20和2％SDS可以分别将35％和91％的胰岛素从白蛋白中释放出来(A)；HPLC结果显示对比不加吐温组，胰岛素-白蛋白混合液中加入吐温20可以将20.1％的胰岛素释放出来。

图3白蛋白具有持续释放游离胰岛素的能力，

ELISA方法检测溶液中第一次超滤和第二次超滤后游离胰岛素和结合胰岛素的量。

图4去除胰岛素的白蛋白可以再次结合胰岛素，

将白蛋白包被于酶标板上用以捕获胰岛素，包被用白蛋白浓度为20μg/ml，用以被捕获的胰岛素溶液浓度分别为5和10μIU/ml，被捕获的胰岛素含量用吸光度(OD405)表示。

图5白蛋白结合在功能上是可逆的，

采用无血清培养剂培养的主动脉内皮细胞，细胞培养后采用MTT法分别检测第1、3、5天细胞的增殖情况，细胞处理分别为2％白蛋白、10000倍生理浓度的纯胰岛素、吐温20处理的白蛋白、吐温20处理的白蛋白中加入胰岛素以及磷酸缓冲液对照。

图6白蛋白-胰岛素的结合可以受到药物的调节，

将格列苯脲(Glybenclamide)、甲基胍(Merform)和格列吡嗪(Gliplide)加入3％BSA0281溶液中，温浴30分钟后检测其中游离胰岛素和结合胰岛素的量。

图7脂质对游离胰岛素/结合胰岛素浓度平衡的影响，

在3％BSA0281中分别加入0.5mg/ml或2mg/ml游离脂肪酸，2mg/ml或5.0mg/mlLDL，5mmol/L甘油三酯和10mmol/L胆固醇后测定游离胰岛素和结合胰岛素，对照组采用PBS或溶解脂质的氯仿。

图8胆固醇抑制白蛋白对胰岛素利用的调节作用，

A：仅加胰岛素(12.5U/L)；B：仅加2％结合有胰岛素(19.23mU/L)的白蛋白；C：加胰岛素与白蛋白。*和**料表示两组同时间点比较P小0.05和0.01。

图9 2型糖尿病人中游离胰岛素和结合胰岛素的比例两极分化，

左：正常人的结合胰岛素/游离胰岛素比值；右：糖尿病人的结合胰岛素/游离胰岛素平均比值。

图10 2型糖尿病患者和正常对照血清组份促细胞增殖能力，

A：含游离胰岛素的血清组分促细胞增殖的能力；B：含结合胰岛素的组分促细胞增殖的能力；C：总血清含结合胰岛素的组分促细胞增殖的能力。上述血清组份在含与不含胰岛素受体酪氨酸激酶抑制剂HNMPA-(AM)3的条件下对血管内皮细胞增殖的影响。

图11白蛋白对小鼠低血糖性休克的保护作用，

注射胰岛素可诱发低血糖昏迷，而不含胰岛素的白蛋白预处理后则保持清醒。

图12含与不含胰岛素的白蛋白对不同血胰岛素作用的调节，

A：正常小鼠注射PBS；B：正常小鼠注射胰岛素；C：STZ引起的I型糖尿病小鼠注射胰岛素。a组：事先注射PBS；b组：事先注射结合有胰岛素的白蛋白；c组：事先注射未结合有胰岛素的白蛋白。

图13免疫共沉淀技术证明α1抗胰蛋白酶在血清中与白蛋白结合而不与胰岛素结合，

用α1抗胰蛋白酶的抗体去沉淀与之结合的蛋白，非特异IgG作为对照。

图14不同浓度α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合力的影响，

用高浓度、正常浓度和低浓度的α1抗胰蛋白酶(终浓度分别为10.3mg/ml，2.58mg/ml和0.645mg/ml)加入到预先混合有3％白蛋白和20mIU/L胰岛素的PBS溶液中，观察其对两者结合力的影响，不加α1抗胰蛋白酶的3％白蛋白和20mIU/L胰岛素的PBS溶液作为对照。

图15注射3％白蛋白和不同浓度α1抗胰蛋白酶的混合液后小鼠的不同反应，

C57BL/6J小鼠腹腔注射含有3％白蛋白和α1抗胰蛋白酶(终浓度分别为10.3mg/ml(A)，2.58mg/ml(B)和0.645mg/ml(C))的混合液1h后，再注射胰岛素，观察这三组小鼠的反应能力，图3A可以看出α1抗胰蛋白酶终浓度为10.3mg/ml小鼠呈昏迷状态，图3B和C则可以看出其余2组小鼠的活力和行为正常，精神良好。

图16α1抗胰蛋白酶的浓度与血糖水平的变化呈现出负相关关系，

用含有0，0.64mg/m l、2.58mg/m或10.30mg/ml α1抗胰蛋白酶和3％白蛋白的PBS溶液腹腔注射小鼠后1h，再经尾静脉注射胰岛素，观察血糖浓度，以注射不含白蛋白但含相应浓度的α1抗胰蛋白酶溶液为对照。

图17白蛋白和胰岛素对小鼠血清α1抗胰蛋白酶浓度的影响，

在不同初始白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值条件下，单独或同时注射白蛋白和胰岛素对血清α1抗胰蛋白酶浓度的影响。

图18瘦素对胰岛素与白蛋白力结合的影响，

在3％白蛋白(BSA0281 sigma-aldrich)溶液中加入2mg/ml的瘦素和1ng/l的胰岛素，常温孵育2h，用30kD的超滤管离心此溶液，测定上层中的结合胰岛素的浓度，以此检测瘦素对胰岛素与白蛋白结合的影响，图中：BSA+leptin vs BSA+insulin+leptin P＜0.01。

图19BSA对ob/ob和C57小鼠空腹血糖值的影响，

四组小鼠从4周龄用于实验起，每三天测定一次空腹血糖，测定前一天禁食12h，血糖测量后，腹腔注射3％的BSA。ob/ob小鼠：0.5ml/每只；C57小鼠：0.3ml/每只，连续测量8周，图中：ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P＜0.05 n＝10；C57+BSA vs C57+PBS P＜0.05 n＝10。

图20BSA对ob/ob和C57小鼠非空腹血糖值的影响，

小鼠从4周龄用于实验起，每周测定一次非空腹血糖，测定前一天小鼠正常饮食，连续测量8周，ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P＜0.05 n＝10(6、8、10、12周龄时间点)；C57+BSA vs C57+PBS P＞0.05 n＝10。

图21BSA对ob/ob和C57小鼠体重的影响，

ob/ob小鼠6周龄时体重约30g；C57小鼠6周龄体重约16g，每周测量一次各组小鼠的体重值，观测BSA对体重的影响，ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P＜0.05 n＝10；C57+BSA vs C57+PBS P＞0.05 n＝10。

图22BSA对ob/ob和C57小鼠血清中结合胰岛素与游离胰岛素比值的影响，

Elisa方法检测血清中总胰岛素浓度和上层血清中的结合胰岛素浓度，计算各组小鼠的结合胰岛素与游离胰岛素浓度的比值，图中：ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P＜0.05 n＝10；C57+BSA vs C57+PBS P＞0.05 n＝10。

图23BSA对ob/ob和C57小鼠胰岛胰腺体积比值的影响，

小鼠全胰岛组织的石蜡切片，每隔50μm取一张，做HE染色，用Image measurement统计软件测量每张切片中的胰岛总面积和胰腺总面积，计算两者比值，乘以间隔距离50μm，即胰岛胰腺的体积比值，ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS P＜0.05 n＝10；C57+BSA vsC57+PBS P＜0.05 n＝10。

图24BSA对C57小鼠血清瘦素水平的影响，

实验观察至12周龄时处死小鼠，提取血清测定血清瘦素浓度，Elisa方法测定血清中瘦素浓度，C57+BSA vs C57+PBS P＜0.05 n＝10。

具体实施方式

实施例1

1检测胰岛素浓度

血清和2％白蛋白中所含胰岛素水平依据厂家说明采用胰岛素检测试剂盒测定(DiagnosticSystem Laboratory，Webster，TX)。为确定不同制备方法获得白蛋白中的胰岛素含量，我们检测了4种白蛋白，分别是：2％无游离脂肪酸和免疫球蛋白的牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrichcatalogue number A0281，BSA0281，St.Louis，MO)，牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich cataloguenumber A3803)，人血清白蛋白(HSA，EMD Chemicals catalogue number 12666，San Diego，CA)，高纯度人血清白蛋白(EMD Chemicals catalogue number 126658)。其它检测包括：

ELISA检测上层血清的胰岛素含量，

ELISA检测下层血清的胰岛素含量，

ELISA检测总血清的胰岛素含量，

ELISA检测白蛋白的胰岛素含量，

ELISA检测白蛋白上层的胰岛素含量，

ELISA检测白蛋白下层的胰岛素含量。

2高压液相色谱分析(HPLC)分析白蛋白-胰岛素结合

同为5mg/ml浓度的白蛋白和胰岛素混合于PBST，37℃下放置2h。同时以PBS代替PBST作为对照。温育后，100μl混合物上样至gel filtration column(ULTRASPHERE ODSGF250，Beckman Coulter，Fullerton，CA)，并用HP Series 1100 solvent delivery system(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)以0.5ml/min流速进行分析。柱子以PBS作为流动相。用280nm吸光度监测蛋白含量。样本检测包括HPLC检测胰岛素和白蛋白混合物中胰岛素含量，HPLC检测吐温处理的胰岛素和白蛋白混合物中胰岛素含量。

3分离制备游离胰岛素和结合胰岛素

为了将游离胰岛素和蛋白结合胰岛素分离，溶液通过超滤离心柱(Microncon YM-30Centrifugal ultrafiltration tube，Millipore Corporation，Billerica，MA)进行分离。游离胰岛素分子量为5733KD，因此可以通过滤膜进入下层，而结合胰岛素则留在上层。上层用PBS恢复至原体积。包括超滤离心柱分离纯化血清上层和下层，超滤离心柱分离纯化白蛋白上层和下层。

4测定白蛋白捕获胰岛素能力

采用一个固相系统研究胆固醇对白蛋白-胰岛素结合的影响，从而最大程度降低了溶解胆固醇时需要的有机溶剂对实验的影响。普通白蛋白(BSA0281)、吐温20处理的白蛋白和胆固醇预处理的吐温20处理白蛋白分别包被于96孔酶标板上用于捕获不同浓度胰岛素。10％BSA0281室温孵育2小时，超滤管超滤去除胰岛素。同时用PBS代替PBST作为对照。一半PBST处理的BSA0281置于胆固醇溶液(0.5％in PBS containing 0.1％ethanol)孵育2小时。余下的PBST和PBS处理的BSA0281相同环境下放置2小时。超滤纯化后，蛋白浓度用PBS调至2％。上述蛋白的结合胰岛素能力采用下面方法测定：1)在96孔酶标板上分别每孔加入100μl 2％Tween-20-treated BSA0281、未处理BSA0281或胆固醇预处理的Tween-20处理BSA0281，常温孵育2h；2)用2％甘氨酸封闭未结合位点防止假阳性结果；3)每孔加100μl胰岛素标准品(5和10mU/l)，室温孵育2小时；4)用固定液(1％甲醇和3.7％甲醛)将胰岛素固定至酶标板上；5)每孔加入100μl抗人胰岛素单克隆抗体(1∶100)，室温孵育2h；6)每孔加入100μl抗鼠IgG-HRP复合物(1∶500)孵育1h；7)加入100μl TMB溶液(EMD Chemicals，San Diego)室温显色1h；8)加入100μl终止液(0.2mM sulfuric acid)并在酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上读取450nm处吸光度值。步骤4和7之间，采用PBST洗板3次x5min。阴性对照在第4步中采用PBS代替一抗。

样本检测包括：

白蛋白包被ELISA法检测上层血清的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测下层血清的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测总血清的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白上层的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白下层的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白下层的胰岛素含量。

实施例2细胞增殖试验

原代大鼠主动脉内皮细胞(AEC)根据文献报道从8-9周龄雄性Wistar大鼠分离。采用第4代细胞进行研究。小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)购自美国ATCC细胞库(ATCC，Manassas，VA)。AEC和bEnd.3细胞都用含10％胎牛血清(Invitrogen，carlsbad，CA)、100U/ml氨苄西林，和100mg/ml链霉素的DMEM(1000mg/L D-glucose)培养。0.25％胰酶-0.02％EDTA消化后，每孔加入150μl含3000个细胞的无血清培养剂，使其恢复12h。随后用上述制备好的实验培养剂代替普通培养剂。采用MTT(Sangon，Shanghai，China).法检测第1、3、5天细胞活性的变化变化。490nm出吸光度值采用酶标仪检测(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。

吐温20处理的白蛋白的促细胞增殖作用通过观察2％BSA0281，Tween 20-处理的BSA0281或Tween 20-处理的BSA0281中加入胰岛素(250mU/ml)对AEC细胞的作用来检测。纯胰岛素和PBS分别用于阳性和阴性对照。本实验采用无血清培养系统。

为了检测糖尿病人血清对细胞的作用，分别用2型糖尿病病人全血清、上层血清和下层血清组分代替胎牛血清。胰岛素的特异性作用通过比较加入200μM HNMPA-(AM)3的结果得出。HNMPA-(AM)3是一种可透过细胞膜的HNMPA。它能特异性抑制胰岛素受体酪氨酸激酶活性(IC50＝100μM)，并且可抑制小鼠脂肪细胞内的胰岛素诱导的葡萄糖氧化(IC50＝10μM)。HNMPA-(AM)3采用DMSO(dimethyl sulfoxide)溶解。DMSO在培养剂中的最大终浓度不超过0.1％。并用同剂量DMSO作为对照组。

细胞培养与分组包括：

MTT检测血清上层对细胞增殖的影响，

MTT检测血清下层对细胞增殖的影响，

MTT检测总血清对细胞增殖的影响，

MTT检测白蛋白对细胞增殖的影响，

MTT检测吐温处理的白蛋白对细胞增殖的影响，

MTT检测胆固醇处理的吐温预处理的白蛋白对细胞增殖的影响，

MTT检测加入胰岛素的吐温处理的白蛋白对细胞增殖的影响，

MTT检测加入HNMPA-(AM)₃处理的白蛋白对细胞增殖的影响，

MTT检测加入DMSO处理的白蛋白对细胞增殖的影响。

实施例3脂质和药物对胰岛素结合能力的影响

2％BSA0281中分别加入PBS、高浓度(5mmol/L)和低浓度(2mmol/L)甘油三酯(sigma intralipids)、高浓度(10mmol/L)和低浓度(5mmol/L)胆固醇(amresco)、2mmol/L游离脂肪酸(sigma FFAP)、5mmol/l LDL、1mg/L格列苯脲(sigma)、15mg/L格列齐特、5mg/L二甲双胍，室温下放置30分钟后，通过超滤离心柱(Microncon YM-30 Centrifugalultrafiltration tube，Millipore Corporation，Billerica，MA)进行分离，将超滤后的上下层溶液进行胰岛素检测。为了观察去除游离胰岛素的白蛋白是否还能继续释放游离胰岛素，将PBS组超滤后的上层溶液再加入PBS恢复至初始容量，并室温下放置30分后再次超滤，上下层溶液同样进行胰岛素检测。

实施例4脂质和药物影响胰岛素-白蛋白结合的作用对细胞增殖的影响

为了观察药物脂质对胰岛素结合能力的影响对细胞增殖的作用，96孔细胞培养板中，每孔小鼠Bend.3脑微血管内皮细胞的初始浓度为3000个，细胞培养液中加入2％人血清白蛋白组和胰岛素(250mU/ml)，并分为5个小组：分别加入5mmol/L甘油三酯(sigmaintralipids)、10mmol/L胆固醇(amresco)、2mmol/L游离脂肪酸(sigma FFAP)、1.5mg/L格列苯脲(sigma)或0.1％DMSO和1％氯仿。本实验采用无血清培养系统。纯胰岛素(250mU/ml)、2％人血清白蛋白和PBS作为对照组。

实施例5体内试验

(一)含与不含胰岛素的白蛋白对正常和STZ诱导的I型糖尿病小鼠血糖的影响

选取20g左右体重的雄性C57BL/6J小鼠48只。实验前，所有动物均饲养于清洁级环境，给予C57BL/6J小鼠啮齿类动物普通饲料；

将小鼠禁食12h，按200mg/kg体重腹腔注射STZ 1次，成功制备I型糖尿病小鼠模型，该模型具有高血糖、体重减轻、多饮多食多尿的特点，与临床I型糖尿病吻合。

1.所有C57BL/6J小鼠在实验前一天予以禁食12h。次日先检测空腹血糖，血糖均由Abott公司的Medisense Optium Xceed血糖仪和Medisense Optium Xceed血糖试纸进行检测。血液标本采取小鼠尾尖取血的方式。为消除血糖检测时小鼠可能的应激反应对血糖值的影响，所有小鼠在每次血糖检测之前均予以异氟醚吸入麻醉。

2.1随后，53只C57BL/6J小鼠分为6组，分别做如下处理：

第I组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射3％含有胰岛素的白蛋白(2ml/25g体重)溶液，1h后注射胰岛素溶液(2IU/kg体重)；n＝10，

第II组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液，1h后注射PBS溶液；n＝10，

第III组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有3％含有胰岛素的白蛋白(2ml/25g体重)溶液，1h后注射PBS溶液；n＝9，

第IV组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液，1h后注射胰岛素溶液(2IU/kg体重)；n＝9，

第V组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射3％不含有胰岛素的白蛋白(2ml/25g体重)溶液，1h后注射胰岛素溶液(2IU/kg体重)；n＝8，

第VI组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有3％不含有胰岛素的白蛋白(2ml/25g体重)溶液，1h后注射PBS溶液；n＝7，

2.2.27只STZ诱导的C57BL/6J I型糖尿病小鼠，分为3组，分别做如下处理：

第I组：腹腔注射3％含有胰岛素的白蛋白(2ml/25g体重)溶液，1h后注射胰岛素溶液(2IU/kg体重)；n＝10，

第II组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液，1h后注射胰岛素溶液(2IU/kg体重)；n＝8，

第III组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有3％不含含胰岛素的白蛋白(2ml/25g体重)溶液，1h后注射胰岛素溶液(2IU/kg体重)；n＝9，

3.注射完胰岛素的1h，2h和3h后分别检测每只小鼠的血糖值；

4.随后所有小鼠予以眼球取血：先使小鼠眼球突出充血后，以弯头眼科镊迅速钳取眼球，并将小鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液，让血液滴入Ep管，直至不流为止；

5.提取血清：将所有小鼠的血液标本于37℃条件下放置半小时，2,000rpm离心15分钟后取上清，-80℃保存。

(二)α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合以及血糖的影响

选取20g左右体重的雄性C57BL/6J小鼠96只。实验前，所有动物均饲养于清洁级环境，给予C57BL/6J小鼠啮齿类动物普通饲料。

1.所有C57BL/6J小鼠在实验前一天予以禁食12h。次日先检测空腹血糖。血糖均由Abott公司的Medisense Optium Xceed血糖仪和Medisense Optium Xceed血糖试纸进行检测。血液标本采取小鼠尾尖取血的方式。为消除血糖检测时小鼠可能的应激反应对血糖值的影响，所有小鼠在每次血糖检测之前均予以异氟醚吸入麻醉。

2.96只C57BL/6J小鼠分为16组，每组6只，分别做如下处理：

第I组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有5％白蛋白(2ml/25g体重)和α1抗胰蛋白酶(终浓度为10.3mg/ml)的PBS溶液；

第II组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射仅含有α1抗胰蛋白酶(终浓度为10.3mg/ml)的PBS溶液；

第III组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有5％白蛋白(2ml/25g体重)和α1抗胰蛋白酶(终浓度为2.58mg/ml)的PBS溶液；

第IV组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射仅含有α1抗胰蛋白酶(终浓度为2.58mg/ml)的PBS溶液；

第V组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射含有5％白蛋白(2ml/25g体重)和α1抗胰蛋白酶(终浓度为0.645mg/ml)的PBS溶液；

第VI组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射仅含α1抗胰蛋白酶(终浓度为0.645mg/ml)的PBS溶液；

第VII组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射仅含有5％白蛋白(2ml/25g体重)的PBS溶液；

第VIII组：C57BL/6J小鼠予以腹腔注射PBS溶液。

3.上述8组小鼠分别注射完1h之后，予以第二次检测各组小鼠的血糖值，每组小鼠均予以尾静脉注射胰岛素(2IU/kg体重)。

4.在注射完胰岛素的1h，2h和3h后分别检测每只小鼠的血糖值。

5.所有小鼠予以眼球取血：先使小鼠眼球突出充血后，以弯头眼科镊迅速钳取眼球，并将小鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液，让血液滴入Ep管，直至不流为止。

6.提取血清：将所有小鼠的血液标本于37℃条件下放置半小时，2,000rpm离心15分钟后取上清，-80℃保存。

第IX至XVI组处理与以上8组相同，但用PBS替代胰岛素进行腹腔注射。

(三)外源性白蛋白对瘦素缺乏小鼠胰岛素抵抗的调节作用及机制

雄性ob/ob小鼠，4周龄，体重28g左右，由上海中国科学院实验动物部提供，

雄性C57小鼠，4周龄，体重15g左右，由上海中国科学院实验动物部提供，

20只ob/ob mice分为两组：A组：10只注射3％BSA和B组：10只注射PBS。

20只C57分为两组：C组：10只注射3％BSA和D组：10只注射PBS。

所有动物每三天注射一次BSA，注射之前测空腹血糖，记录血糖值；每一周测一次非空腹血糖，记录血糖值；每一周称量一次体重，记录体重值。

病人血清标本采集

正常人和糖尿病人空腹血清标本通过中山医院和上海松江医院收集。受试者各组在年龄和性别上无统计学差异。受试者无心、肝、肺、肾及其它重要器官功能障碍，也无怀孕。

统计学方法采用单因素方差分析和t检验。所有数据以平均值±标准误表示。以P＜0.05定义统计学有差异。

本发明所采用的关键材料为：

胰岛素检测试剂盒(Diagnostic System Laboratory，Webster，TX)。牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich catalogue number A0281，BSA0281，St.Louis，MO)，BSA(Sigma-Aldrichcatalogue number A3803)，人血清白蛋白(HSA，EMD Chemicals catalogue number 12666，San Diego，CA)和高纯人血清(EMD Chemicals catalogue number 126658)。gel filtrationcolumn(ULTRASPHERE ODS GF250，Beckman Coulter，Fullerton，CA)，HP Series 1100solvent delivery system(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)。66份正常人血清(空腹血糖4.3-5.6mmol/l)和217份新诊断为糖尿病的病人血清(空腹血糖6.9-22.2 or 11.9±1.0mmol/l)。离心超滤管YM-30(Millipore Corporation，Billerica，MA)。原代培养的大鼠主动脉内皮细胞(按文献报道制备)和bend.3小鼠脑微血管内皮细胞(ATCC，Manassas，VA)。TMB溶液(EMD Chemicals，San Diego)。酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。MTT细胞活力检测试剂盒(Sangon，Shanghai，China)。HNMPA-(AM)3(EMD Chemicals，San Diego)。小鼠α1抗胰蛋白酶ELISA试剂(ADL公司)，小鼠瘦素Elisa检测试剂盒(Millipore Corporation Billerica，MA)，Optium Xceed血糖仪和试纸(美国雅培公司)。

结果显示：

1市售白蛋白含有胰岛素

4种市售胰岛素中只有一种显著含有胰岛素(BSA0281，Sigma，St.Louis，MO)，其它3种基本不含胰岛素(图1)，BSA0281采用改良Cohn法制备，第一步用冷乙醇沉淀，而其它的都是用经典法制备，第一步采用的是热休克的方法。因此BSA0281可以作为下述实验血清蛋白的替代。

2去污剂可将胰岛素从白蛋白中分离

如果白蛋白可以作为胰岛素的携带物和储存库，那么2者的结合必须是可逆的，以保证在血清中胰岛素可以从白蛋白上释放出来执行游离胰岛素的功能。ELISA结果显示1％吐温20和2％SDS可以分别将35％和91％的胰岛素从白蛋白中释放出来(图2A)。随后HPLC的结果进一步证实上述结果。HPLC结果显示对比不加吐温组，胰岛素-白蛋白混合液中加入吐温20可以将20.1％的胰岛素释放出来。由于胰岛素分子量为白蛋白的1/10，因此我们估算1个白蛋白分子可以释放出2个胰岛素分子(图2B)。

3白蛋白具有持续释放游离胰岛素的能力

将3％白蛋白溶液静置30分后，采用超滤管超滤，溶液中的游离胰岛素可以通过超滤膜进入下层，采用ELISA方法可以检测该溶液中的游离胰岛素含量。随后用PBS溶液将已经过滤掉游离胰岛素的上层白蛋白溶液恢复至原体积，再次静置30分钟，超滤，并检测游离胰岛素的含量。结果显示，当第一次游离胰岛素被滤出后，第二次超滤仍然有胰岛素被滤出，并且与第一次滤过后得到的游离胰岛素的浓度无明显差异(图3)，提示白蛋白可以连续释放游离胰岛素，并且游离胰岛素的浓度是相对固定的。

4白蛋白可以再次结合胰岛素

将不含胰岛素的白蛋白包被至96孔酶标板上，分别采用吐温20、PBS或胆固醇处理后，依次加入胰岛素和抗胰岛素抗体，并用羊抗鼠-AP检测，发现反应随着胰岛素浓度的升高而升高，提示释放出胰岛素的白蛋白可以继续结合胰岛素。没有用吐温20处理的白蛋白结合胰岛素能力明显不如处理后的白蛋白。如果再用胆固醇处理吐温20处理后的白蛋白，其结合能力则显著降低，并且明显低于不处理的白蛋白(图4)。提示白蛋白结合能力可以被胆固醇所封闭，而吐温20处理后则可以暴露出白蛋白上的结合位点。

5白蛋白结合在功能上是可逆的

采用无血清培养剂培养的主动脉内皮细胞，2％白蛋白和纯胰岛素的促细胞生长能力相当。根据sigma建议纯胰岛素的终浓度大约为生理剂量的10000倍以保证培养过程中活性的丢失。吐温20处理的白蛋白丧失了促细胞增殖的能力。在吐温20处理的白蛋白中加入胰岛素可以恢复其促细胞增殖能力(图5)。

6白蛋白-胰岛素的结合可以受到药物的调节

在3％BSA溶液中加入3种常用抗糖尿病药物，静置30分后检测其中结合胰岛素与游离胰岛素的含量，发现格列苯脲(Glybenclamide)能够促进游离胰岛素的释放，而另2个甲基胍(Merform)和格列吡嗪(Gliplide)则没有类似作用(图6)。

7白蛋白-胰岛素的结合可以受到脂质的调节

在3％BSA0281中分别加入2mg/ml游离脂肪酸，5.0mg/ml LDL，5mmol/L甘油三酯和10mmol/L胆固醇后，发现这些脂质都可以升高BSA溶液中的游离胰岛素并降低结合胰岛素，而低浓度的游离脂肪酸(0.5mg/ml)和LDL(2mg/ml)则没有这种效果。对照组采用PBS或溶解脂质的氯仿，二者也没有引起上述胰岛素比例的改变。

8胆固醇抑制白蛋白对胰岛素利用的调节作用

采用无血清培养剂培养的脑微动脉血管内皮细胞，在无白蛋白的条件下500倍生理浓度的纯胰岛素(12.5U/L)仅能维持细胞2天，而后细胞数逐日减少(图8A)。而结合有胰岛素的白蛋白(2％)，虽然胰岛素浓度(19.23mU/L)低，但可维持细胞生长最少5天(图8B)。白蛋白和胰岛素同时加入培养液中，则细胞生长最少维持5天，并且在第5天细胞数明显高于其它两组(图8C)。在无白蛋白的条件下，胆固醇对胰岛素的作用无影响(图8A)，相反，在白蛋白和胰岛素都存在的条件下，胆固醇的细胞生长有明显抑制作用(图8B，8C)。

92型糖尿病人中游离胰岛素和结合胰岛素的比例两极分化

本试验测定的正常人血清总胰岛素浓度范围是13.29±1.68mU/l，糖尿病人是4.38±1.00mU/l(P＜0.001)。正常人血清游离胰岛素含量在1.35-5.05(2.71±0.24)mU/l之间很窄的范围内变动。而糖尿病人的血清游离胰岛素浓度范围扩大(0.07-10.01，2.23±0.68mU/l)。正常人和糖尿病人的结合胰岛素/游离胰岛素平均平均比值相似(4.06±0.66vs 4.67±1.63)。但是糖尿病人极端化现象较突出。91.2％正常人比值在1.4-10。而仅有11.8％的患者比值在该范围内。其余的要么低于1.4(64.7％)要么高于10(23.5％)(图9)。所有高甘油三酯(fasting TG≥3.3mol/l)的糖尿病患者比值均大于10(和余下患者比较P＝0.010)。

为了确定低胰岛素水平是否影响其比值，总胰岛素含量正常的患者和正常人进行了比较。结果显示，所有总胰岛素含量正常(＞5mU/l)的患者其比值均小于1。

10糖尿病患者和正常对照血清组份促细胞增殖能力

1倍体积的血清组分加入9倍体积的无血清培养剂中进行内皮细胞培养。含游离胰岛素的组份在第一天具有明显的促细胞增殖的能力，第3天该作用消失(图10A)。相比较而言，含结合胰岛素的组份在第一天促细胞增殖活性不强，但是其活性持续至第五天(图10B)。总血清具有2者的共同作用(图10C)。高甘油三酯和无高甘油三酯的患者血清没有明显差异。令人惊奇的是，采用含10％糖尿病人的血清的培养剂培养的细胞增殖速度明显高于含10％正常人血清的培养剂，尤其是血清胰岛素浓度正常的血清，其生长速度明显高于正常血清。所有血清促细胞细胞增殖的功能都可以被胰岛素受体酪氨酸激酶抑制剂HNMPA-(AM)3所抑制(图10)。

11白蛋白结合胰岛素的能力可以保护小鼠的低血糖性休克

小鼠预先腹腔注射1ml 5％不含胰岛素白蛋白溶液或等剂量PBS，1h后静脉注射2U/Kg胰岛素，观测小鼠的低血糖休克反应。结果显示未经胰岛素预处理的小鼠注射胰岛素后发生了低血糖昏迷，而采用5％不含胰岛素白蛋白溶液预处理的小鼠则未发生低血糖性昏迷(图11)。

12含与不含胰岛素的白蛋白对不同血胰岛素浓度作用的调节

腹腔注射结合有胰岛素的白蛋白可降低正常小鼠的血糖，相反，注射未结合有胰岛素的白蛋白可升高正常小鼠的血糖(图12A)；注射未结合有胰岛素的白蛋白可显著抑制胰岛素注射引起的血糖降低，注射结合有胰岛素的白蛋白则无此作用(图12B)；对STZ造成的胰岛素缺乏小鼠，注射同等量的胰岛素对血糖无显著影响，但事先注射结合有胰岛素的白蛋白，然后在注射胰岛素，则血糖显著下降，相反，如果事先改注未结合有胰岛素的白蛋白，则小鼠血糖明显高于仅注射胰岛素组(图12C)。

13免疫共沉淀技术证明白蛋白与α1抗胰蛋白酶在血清中呈结合状态

用α1抗胰蛋白酶的抗体去沉淀与之结合的蛋白，非特异IgG作为对照。结果显示在α1抗胰蛋白酶抗体组可明显检测到α1抗胰蛋白酶的表达，同时也可以检测到白蛋白的表达；在control IgG组则未发现有α1抗胰蛋白酶的表达，但同时也检测到白蛋白的表达，但含量明显低于α1抗胰蛋白酶抗体组(P＜0.05)(图13)，分析可能是由于蛋白A/G琼脂糖珠制备过程中用白蛋白作为非特异吸附的封闭无所致。

14体外实验证明不同浓度α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素结合力的影响

分别用高浓度、正常浓度和低浓度的α1抗胰蛋白酶(终浓度分别为10.3mg/ml，2.58mg/ml和0.645mg/ml)加入到预先混合有3％白蛋白和20mIU/L胰岛素的PBS溶液中观察对两者结合力的影响，不加α1抗胰蛋白酶的3％白蛋白和20mIU/L胰岛素的PBS溶液作为对照。图14A和B显示的是加入不同浓度的α1抗胰蛋白酶后所测得的结合胰岛素和游离胰岛素的值，结果显示：与PBS组相比，低浓度的α1抗胰蛋白酶可以增加结合胰岛素的含量，同时也降低游离胰岛素的含量，高浓度和正常浓度的α1抗胰蛋白酶对结合胰岛素或游离胰岛素的含量没有影响。图14C显示的是加入不同浓度的α1抗胰蛋白酶后结合胰岛素/游离胰岛素的比值。结果显示：与正常浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组相比，低浓度α1抗胰蛋白酶明显增加了结合胰岛素/游离胰岛素的比值(2.41±0.17 vs 1.76±0.20，P＝0.0024)；低浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组和高浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组之间该比值更加明显(2.41±0.17vs 1.53±0.18，P＝0.0004)；而正常浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组和高浓度α1抗胰蛋白酶/白蛋白组之间该比值没有统计学意义(P＝0.1406)。

15动物实验证明不同浓度α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素相互作用和血糖的影响

1)注射3％白蛋白和不同浓度α1抗胰蛋白酶的混合液后小鼠的不同反应

图3显示的是予以C57BL/6J小鼠腹腔注射含有3％白蛋白和α1抗胰蛋白酶(终浓度分别为10.3mg/ml，2.58mg/ml和0.645mg/ml)的混合液1h后，再注射胰岛素，观察这三组小鼠的反应能力。图15A可以看出小鼠呈昏迷状态，图15B和C则可以看出小鼠的活力和行为都比较正常，精神良好。其余各组小鼠在行为和反应上均没有明显变化。

2)不同浓度的α1抗胰蛋白酶对白蛋白-胰岛素相互作用后血糖浓度的影响

用含有0.64mg/mlα1抗胰蛋白酶和3％白蛋白的PBS溶液腹腔注射小鼠后，该组小鼠的血糖水平明显升高，阻止了胰岛素诱导的低血糖反应。将α1抗胰蛋白酶的浓度增加到2.58mg/ml和10.30mg/ml后，胰岛素诱导的低血糖反应则出现加大且延长(图16)。α1抗胰蛋白酶的浓度与血糖水平的变化呈现出负相关关系(图16)。注射不含白蛋白的α1抗胰蛋白酶(分别为0.64，2.58和10.30mg/ml)则与注射正常浓度和高浓度的α1抗胰蛋白酶/白蛋白组类似。

16白蛋白和胰岛素对小鼠血清α1抗胰蛋白酶浓度的影响

白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值低于正常时，注射白蛋白可提高血清α1抗胰蛋白酶浓度(图17a，17b)，而白蛋白/α1抗胰蛋白酶比值正常或者高于正常时，白蛋白对α1抗胰蛋白酶浓度无影响(图17c，17d)。相反，注射胰岛素可显著降低注射PBS或者少量(0.64mg/ml)α1抗胰蛋白酶小鼠的血清α1抗胰蛋白酶浓度(图17a，17b)。

17白蛋白和瘦素对胰岛素体外自然灭活的影响

将单纯胰岛素溶液、胰岛素加白蛋白或者瘦素溶液以及三种物质混合液在室温下放置8小时，检测胰岛素含量，结果发现4种溶液胰岛素的降解率分别为99.2％、10.9％、70.2％和26.1％。进一步研究显示瘦素降低胰岛素与白蛋白的结合。

18瘦素对胰岛素和白蛋白结合的影响

瘦素可以降低BSA与游离胰岛素的结合(图18)。BSA+insulin+leptin上层结合胰岛素浓度为0.38±0.04；BSA+leptin的上层结合胰岛素浓度为0.49±0.06，两者相比有显著统计学意义(P＝0.00015)。

19BSA对ob/ob小鼠空腹血糖值的影响

血糖测量值结果显示，C57小鼠注射BSA(n＝10)后，空腹血糖相对值与注PBS(n＝10)对照组相比有增高趋势，且9周后血糖显著增高(P＜0.01)。至12周龄时，C57注BSA组(n＝10)血糖相对值比ob/ob注BSA组血糖相对值高3.2倍(P＜0.01)。ob/ob注BSA组(n＝10)空腹血糖相对值低于PBS对照组(n＝10)，血糖变化趋势与对照组一致(图19)。

20BSA对ob/ob小鼠非空腹血糖值的影响

血糖测量值结果显示：C57小鼠注射BSA后，非空腹血糖相对值与PBS对照组相差不明显，血糖变化趋势一致。ob/ob注BSA后，非空腹血糖相对值低于对照组，在6、8、10、12周时血糖相对值差异明显(P＜0.01)血糖变化趋势与PBS对照组一致(图20)。

ob/ob+BSA vs ob/ob+PBS在6、8、10、12周龄时血糖相对值分别为：0.64±0.06vs 0.88±0.04，P＝0.0036；0.57±0.04 vs 0.85±0.03，P＝4.4E-05；0.73±0.07vs0.95±0.04，P＝0.0113；0.78±0.07 vs 1.09±0.06，P＝0.0039。C57+BSA vs C57+PBS在8周龄时血糖相对值为0.72±0.04 vs 0.87±0.02，P＝0.0021。

BSA注入ob/ob小鼠体内，降低非空腹血糖值，BSA注入C57后，非空腹血糖变化不明显，只在8周龄时差别有统计学意义，其余各周龄无统计学意义(P＞0.05)。

21BSA对ob/ob小鼠体重的影响

C57注BSA组和PBS组的每周测定体重值没有差异(P＞0.05)，即BSA对C57小鼠的体重没有影响。ob/ob小鼠体重从第7周龄开始，BSA组的体重值明显低于PBS组，7、8、9、10、11、12周龄两组体重的平均值±标准误分别为41.41±0.43 vs 45.3±0.77；42.26±0.57 vs 45.7±0.76；46.02±0.72 vs 49.6±0.82；45.16±0.72 vs 49.29±0.91；45.11±0.87 vs 49.16±0.94；47.15±0.95 vs 51.03±0.96(各组P值均＜0.01)(图21)，所以BSA对ob/ob小鼠体重的增加有明显的抑制作用。

22BSA对ob/ob小鼠血清中结合胰岛素与游离胰岛素比值的影响

ob/ob小鼠的结合胰岛素与游离胰岛素浓度的比值高于C57小鼠(P＜0.05)。ob/ob注BSA后两者比值与注PBS对照组相比明显降低(3.46±0.89 vs 13.79±2.61)(P＝0.0354)。C57注BSA后比值与PBS对照组相比无变化(1.41±0.28 vs 1.27±0.49)，无统计学差异(P＝0.808)(图22)。

23胰岛胰腺体积比值的影响

ob/ob小鼠注BSA后胰岛胰腺体积比值与对照组相比降低24.3％(0.068±0.017 vs0.089±0.018)(P＝0.0036)；C57小鼠注射BSA后胰岛胰腺比值与对照组相比降低30％(0.014±0.009 vs 0.023±0.012)两者均有显著的统计学差异(P＝0.0082)(图23)。

24BSA注射降低血清中瘦素水平的测定

ob/ob小鼠血清中无瘦素。C57注BSA后血清瘦素浓度为1.54±0.1，PBS对照组血清瘦素浓度为2.4±0.25，两组瘦素水平差异有统计学意义(P＝0.0135)(图24)。

Claims (10)

1.胰岛素与血清蛋白可逆性结合的亲和力指标测定方法，其特征在于，其包括步骤：

1)检测胰岛素浓度

采用胰岛素检测试剂盒测定血清和2％白蛋白中所含胰岛素水平；

2)高压液相色谱分析分析白蛋白-胰岛素结合

HPLC检测胰岛素和白蛋白混合物中胰岛素含量，HPLC检测吐温处理的胰岛素和白蛋白混合物中胰岛素含量；

3)分离制备检测游离胰岛素和结合胰岛素

通过超滤离心柱分离溶液中的游离胰岛素和蛋白结合胰岛素；

4)测定白蛋白捕获胰岛素能力

采用一个固相系统检测胆固醇对白蛋白-胰岛素结合的影响，包括白蛋白包被ELISA法检测不同血清层及白蛋白层的胰岛素含量；超滤法测定蛋白结合胰岛素、非蛋白结合的游离胰岛素及其比值的方法。

2.按权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤1)中分别检测不同血清层及白蛋白溶液的胰岛素含量。

3.按权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤1)中分别检测下述血清层及白蛋白溶液的胰岛素含量：

ELISA检测上层血清的胰岛素含量，

ELISA检测下层血清的胰岛素含量，

ELISA检测总血清的胰岛素含量，

ELISA检测白蛋白溶液的胰岛素含量，

ELISA检测白蛋白溶液超滤上层的胰岛素含量，

ELISA检测白蛋白溶液超滤下层的胰岛素含量。

4.按权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤2)中，将同为5mg/ml浓度的白蛋白和胰岛素混合于PBST溶液，37℃下放置2h，以PBS代替PBST作为对照。

5.按权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述的游离胰岛素分子量为5733KD，通过滤膜进入下层，结合胰岛素留在上层；上层用PBS恢复至原体积，超滤离心柱分离纯化含白蛋白和胰岛素溶液的上层和下层。

6.按权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤4)中，包括：

白蛋白包被ELISA法检测上层血清的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测下层血清的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测总血清的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白上层的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白下层的胰岛素含量，

白蛋白包被ELISA法检测白蛋白下层的胰岛素含量。

7.权利要求1所述的方法在糖尿病预警、诊断、预后判断、药物筛选、预防和治疗中的应用。

8.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所获得的测定指标在制备预防和治疗以及检测糖尿病的试剂盒中的用途。

9.按按权利要求8所述的方法，其特征在于，所获得的测定指标包括：检测白蛋白捕获胰岛素能力指标，白蛋白在血清中调节结合胰岛素、游离胰岛素浓度及其比值，高甘油三酯、胆固醇对胰岛素抵抗的影响指标，以及血清各组份结合胰岛素、游离胰岛素的功能指标。

10.按权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的血清各组份结合胰岛素、游离胰岛素的功能指标在制备诊断和治疗糖尿病制剂中的用途。

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