CN102854308B - 一种果汁中的耐热菌的双抗体夹心elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法及应用，其是预先将兔源多克隆抗体包被在酶标板上再加入封闭液封闭后用铝箔袋真空包装，制备成一个标准试剂盒，能够实现ELISA快速检测方法的标准化，检测时将该试剂盒中加入样品中捕集的耐热菌抗原，再加入耐热菌鼠源多克隆抗体，形成抗体-抗原-抗体的双抗体复合物，与酶标抗体、底物工作液，使双抗体复合物上的酶催化底物，再通过酶标仪测定其分光光度值与阴性对照样品的cut off值比较，从而判定其为阴性或阳性，进而实现一种耐热菌双抗体夹心ELISA检测方法，检测时间短，检测结果稳定，大大提高了检测效率。

Description

一种果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法

技术领域

本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及到果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA快速检测所用的试剂盒的制备方法或应用。

背景技术

耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)在高温或不利环境中可以形成芽孢，具有很强的耐热性，能够耐受果汁加工中的巴氏杀菌过程以芽孢的形式存在于果汁中，是引起浓缩苹果汁变质的主要微生物之一，耐热菌超标也是苹果汁生产企业最急需解决的问题。

目前，生产企业多采用传统平板培养计数法检测耐热菌，平板培养计数法主要包括美国KFL方法(美国库克实验室法)和澳大利亚Berri公司方法。KFL方法主要是采用滤膜过滤，将耐热菌截留在滤膜上，再将滤膜置于培养基上培养计数，此法检测周期一般为4～5天，在实际生产中无法满足耐热菌的实时检测。也有用PCR法，即聚合酶链式反应法检测耐热菌，其具有快速、特异的优点，但该方法对设备、实验室条件及环境要求高，实验操作步骤较繁锁，且假阳性较难控制，限制了PCR检测法的推广应用。

为此发明人所在的课题组曾提出了耐热菌的ELISA快速检测方法，已申请了中国专利，专利申请号分别为200910022897.7和201010249781.X，该方法具有特异性高，操作简便，重复性好等特点，检测限可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超过1个／10mL的国际标准，操作过程可在20小时内完成，达到快速检测的效果。但是这种方法在实施耐热菌的ELISA检测时，首先要制备抗体，包被酶标板，检测时间较长。

抗体和酶标板制备对检测结果的可靠性很关键，也是实现ELISA检测方法标准化的关键环节，如能将抗体和酶标板提前制备成试剂盒，成为进一步研究的重要课题。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于克服现有技术中的耐热菌的ELISA检测方法所存在的不足，提供了一种能抗体和酶标板提前制备成试剂盒，操作简单，能够实现ELISA检测方法标准化的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供利用上述的制备方法所制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的新的检测方法。

本发明解决技术问题的技术方案是：用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：

（1）耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板

用浓度为0.05mol／L、pH值为9.6的碳酸缓冲液将耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4.8～5.2μg／mL，加入酶标板孔内，每孔加100μL，置于恒温培养箱37℃孵育1.9～2.1小时，将吐温-20与浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：1900～2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

（2）封闭酶标板

向步骤（1）拍干的酶标板的每个孔内加入100μL的封闭液，置于恒温箱中37℃保温封闭90～150分钟，取出，用步骤（1）配制的洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干，得到封闭的酶标板；

（3）试剂盒包装

将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒；

上述的封闭液是质量分数为1%～5%的明胶溶液或质量分数为1%～5%的牛血清蛋白溶液或质量分数为0.1%～0.5%的脱脂奶溶液。

上述封闭液是质量分数为3.8%～4.2%的明胶溶液。

利用上述制备的试剂盒进行果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：

（1）将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔100μL的量分别加入上述制备的试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37℃保温50～150分钟后取出，将吐温-20与浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸 盐缓冲溶液按照体积比为1：1900～2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

（2）将浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：190～220混合，加入步骤（1）的拍干后的酶标板中，每孔100μL，置于恒温箱中37℃孵育50～150分钟后取出，用步骤（1）中配制的洗液冲洗酶标板2~3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

（3）将浓度为0.01mol/L、pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为1：2500～11000混合，加入步骤（2）拍干的酶标板板孔中，每孔100μL，将其置于恒温箱中37℃孵育50～120分钟后取出，用步骤（1）配制的洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

（4）向步骤（3）的拍干后的酶标板板孔内加入底物工作液，每孔100μL，在恒温箱中37℃避光反应15～20分钟，加入50μL浓度为2mol／L的硫酸溶液终止反应；

（5）用酶标仪在450nm波长下测定步骤（4）反应终止酶标板的分光光度值，与步骤（1）的阴性样品的cut off值进行比较，确定待测果汁样品中耐热菌的存在，样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌，样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌，cut off值按下式计算：

$\mathrm{Cut\; off}=\stackrel{\‾}{X}+2\×\mathrm{SD}$

式中 表示阴性样品OD₄₅₀的平均值，SD表示阴性样品OD₄₅₀的标准差，OD₄₅₀是波长为450nm下的分光光度值。

上述步骤（2）中将浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照较佳体积比为1：195～210混合，加入步骤（1）的拍干后的酶标板中。

上述步骤（3）中将浓度为0.01mol／L、pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照较佳体积比为1：3000～6000混合，加入步骤（2）拍干的酶标板板孔中。

上述步骤（4）中的底物工作液的配制方法为取浓度为0.2mol／L的磷酸盐缓冲溶液和浓度为0.1mol／L的柠檬酸溶液与二蒸水混合，二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为1：0.514：0.486，配制成底物缓冲液；再将固液比为0.001g／mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为1：1混合，配制成混合溶液，加入质量分数为30%的H₂O₂溶液，混合溶液与H₂O₂溶液的体积比为1：0.002，摇匀，即配制成底物工作液。

上述的兔源多克隆抗体制备采用王峰，李建科等人报道的《苹果浓缩汁中嗜酸耐热菌多克隆抗体的制备及纯化》（食品与发酵工业，2009年第35卷第4期，33-36页）的方法。

上述的鼠源多克隆抗体采用名称为《耐热菌鼠源多克隆抗体制备》，专利申请号为201110427711.3的中国专利所公开的制备方法制备。

本发明预先将兔源多克隆抗体包被在酶标板上再加入封闭液封闭后用铝箔袋真空包装，制备成一个标准试剂盒，将抗体和酶标板提前制备好，制备方法简单，能够实现ELISA快速检测方法的标准化，大大缩短检测时间，使得ELISA检测更加方便、可靠，减少了操作步骤，实现了关键环节标准化，提高了检测结果的可靠性。检测时将该试剂盒中加入样品中捕集的耐热菌抗原，再加入耐热菌鼠源多克隆抗体，形成抗体-抗原-抗体的双抗体复合物，与酶标抗体、底物工作液，使双抗体复合物上的酶催化底物，再通过酶标仪测定其分光光度值与阴性对照样品的cut off值比较，从而判定其为阴性或阳性，进而实现一种耐热菌双抗体夹心ELISA检测方法，检测时间短，检测结果稳定，大大提高了检测效率。

附图说明

图1为阴性样品的OD₄₅₀值统计图表。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

以耐热菌兔源多克隆抗体为检测抗体制备用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其制备方法如下：

（1）耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板

用浓度为0.05mol／L、pH值为9.6的碳酸缓冲液将浓度为10μg/mL的耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为5μg/mL，加入酶标板孔内，每孔加100μL，置于恒温培养箱37℃孵育2小时，取1mL吐温-20溶解于2L浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，配制成体积比为1：2000的洗液，用洗液冲洗酶标板2.5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（2）封闭酶标板

向步骤（1）拍干的酶标板的每个孔内加入100μL质量分数为4%的明胶溶液作为封闭液，将酶标板置于恒温箱中37℃保温封闭120分钟，取出，用步骤1中配制的洗液冲洗酶标板2.5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，得到封闭的酶标板。

（3）试剂盒包装

将步骤（2）制备好的封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

本实施例的试剂盒可以置于冰箱中3℃～5℃保存，有效期为半年。

用上述方法制备的试剂盒进行果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒来检测果汁中的耐热菌，其检测方法如下：

（1）将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔100μL的量分别加入上述制备的试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37℃保温60分钟后取出，将1mL吐温-20与2L浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：2000混合配制成洗液，用配制的洗液冲洗酶标板2.5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

上述的待测果汁样品是经过集菌处理的，具体是：以无菌操作，取10ml浓缩清汁置于15ml灭菌的试管中，再移取10ml浓缩清汁置于另一个带有温度计的15mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子，将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟，冷却至室温，用100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤，将滤膜放置于盛有100mL的402培养基的三角瓶中，盖上瓶塞，放入恒温摇床中45℃， 190r/min，孵育13小时为集菌后的果汁。本实施例是将集菌处理后的果汁作为被检样品。

（2）将浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：200混合，加入步骤（1）的拍干后的酶标板孔中，每孔100μL，置于恒温箱中37℃孵育60分钟后取出，用步骤（1）中配制的洗液冲洗酶标板2.5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（3）将浓度为0.01mol／L、pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg／mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液以体积比为1：4000混合，加入步骤（2）拍干的酶标板孔中，每孔100μL，将其置于恒温箱中37℃孵育90分钟后取出，用步骤（1）配制的洗液冲洗酶标板2.5分钟，重复冲洗4次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（4）向步骤（3）拍干的酶标板孔内加入底物工作液，每孔100μL，在恒温箱中37℃避光反应18分钟，加入50μL物质的量浓度为2mol／L的硫酸溶液终止反应；

上述底物工作液的配制方法为：

称取7.16g Na₂HPO₄加蒸馏水定容至100mL，配制成物质的量浓度为0.2mol／L的磷酸盐缓冲溶液；称取2.1g柠檬酸加蒸馏水定容至100mL，配制成物质的量浓度为0.1mol／L的柠檬酸溶液；取25.7mL物质的量浓度为0.2mol／L的磷酸盐缓冲溶液和24.3mL物质的量浓度为0.1mol／L的柠檬酸溶液，加二次蒸馏水定容至100mL，即二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为1：0.514：0.486，摇匀，配制成底物缓冲液；将0.1g 3,3',5,5'-四甲基联苯胺用100mL无水乙醇溶解，加入100mL底物缓冲液中，即3,3',5,5'-四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为1：1混合，再加入400μL质量分数为30%的H₂O₂溶液，即混合溶液与H₂O₂溶液的体积比为1：0.002，摇匀，配制成底物工作液，底物工作液现配现用。

（5）用酶标仪在450nm波长下测定步骤（4）反应终止的酶标板的分光光度值，即测出酶标板待测样品孔的OD₄₅₀值和酶标板阴性样品孔的OD₄₅₀值，依据cut off值的计算公式：

$\mathrm{Cut\; off}=\stackrel{\‾}{X}+2\×\mathrm{SD}$

其中： 表示阴性样品OD₄₅₀的平均值，SD表示阴性样品OD₄₅₀的标准差，OD₄₅₀是波长为450nm下的分光光度值。

将待测样品的OD450值与阴性对照样品的cut off值进行比较，当样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌；当样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌。

实施例2

以耐热菌兔源多克隆抗体为检测抗体制备用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其制备方法如下：

（1）耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板

用浓度为0.05mol／L、pH值为9.6的碳酸缓冲液将浓度为10μg/mL的耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4.8μg/mL，加入酶标板孔内，每孔加100μL，置于恒温培养箱37℃孵育1.9小时，将吐温-20与浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：1900混合摇匀，配制成洗液，用洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（2）封闭酶标板

向步骤（1）拍干的酶标板的每个孔内加入100μL质量分数为3.8%的明胶溶液作为封闭液，将酶标板置于恒温箱中37℃保温封闭90分钟，取出，用步骤（1）中配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，得到封闭的酶标板。

（3）试剂盒包装

与实施例1相同，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

用上述制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒来检测果汁中的耐热菌，其检测方法如下：

（1）将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔100μL的量分别加入上述制备好的试剂盒的酶标板孔中，将其同时置于恒温箱中37℃保温50分钟后取出，将吐温-20与浓度为0.01mol／L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液以体积比为1：1900混合摇匀，配制成洗液，用配制的洗 液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板，其它的操作与实施例1相同。

（2）将浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：195混合，加入步骤1的拍干后的酶标板孔中，每孔100μL，置于恒温箱中37℃孵育50分钟后取出，用步骤（1）中配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（3）将浓度为0.01mol／L、pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg／mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为1：3000混合，加入步骤（2）拍干的酶标板孔中，每孔100μL，将其置于恒温箱中37℃孵育50分钟后取出，用步骤（1）配制的洗液冲洗酶标板3分钟，重复冲洗3次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（4）向步骤（3）拍干的酶标板孔内加入底物工作液，每孔100μL，在恒温箱中37℃避光反应15分钟，加入50μL浓度为2mol／L的硫酸溶液终止反应；其它的步骤与实施例1相同。

步骤5：与实施例1相同。

实施例3

以耐热菌兔源多克隆抗体为检测抗体制备用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其制备方法如下：

（1）耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板

用浓度为0.05mol／L、pH值为9.6的碳酸缓冲液将浓度为10μg/mL的耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为5.2μg/mL，加入酶标板孔内，每孔加100μL，置于恒温培养箱37℃孵育2.1小时，将吐温-20与浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：2200混合配制成洗液，用该洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（2）封闭酶标板

向步骤（1）拍干的酶标板的每个孔内加入100μL质量分数为4.2%的明胶溶液作为封闭液，将酶标板置于恒温箱中37℃保温封闭150分钟，取出， 用步骤（1）中配制的洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干，得到封闭的酶标板。

（3）试剂盒包装

与实施例1相同，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

用上述制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒来检测果汁中的耐热菌，其检测方法如下：

（1）将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔100μL的量分别加入上述制备好的试剂盒的酶标板孔中，将其同时置于恒温箱中37℃保温150分钟后取出，将吐温-20与浓度为0.01mol／L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：2200混合配制成洗液，用该洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。其它的操作与实施例1相同。

（2）将浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：210混合，加入步骤（1）的拍干后的酶标板孔中，每孔100μL，置于恒温箱中37℃孵育150分钟后取出，用步骤（1）中配制的洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（3）将浓度为0.01mol/L pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比值为1：6000混合，加入步骤（2）拍干的酶标板孔中，每孔100μL，将其置于恒温箱中37℃孵育120分钟后取出，用步骤（1）配制的洗液冲洗酶标板2分钟，重复冲洗5次，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干酶标板。

（4）向步骤（3）拍干的酶标板孔内加入底物工作液，每孔100μL，在恒温箱中37℃避光反应20分钟，加入50μL物质的量浓度为2mol／L的硫酸溶液终止反应；其它的操作与实施例1相同。

步骤5：与实施例1相同。

实施例4

在上述实施例1～3的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法中，在步骤（2）中的封闭液还可以用1%的明胶溶液或者是1%的牛 血清蛋白溶液或者是0.1%的脱脂奶溶液来替换。其它的步骤与相应的实施例相同。

实施例5

在上述实施例1～3的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒的制备方法中，在步骤（2）中的封闭液还可以用5%的明胶溶液或者是5%的牛血清蛋白溶液或者是0.5%的脱脂奶溶液来替换。其它的步骤与相应的实施例相同。

实施例6

在上述的实施例1～5的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法中，在步骤（2）中将浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：190混合，加入步骤（1）的拍干后的酶标板孔中，每孔100μL，本步骤其它的操作与相应的实施例相同。在步骤（3）中将浓度为0.01mol／L pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比值为1：2500混合，加入步骤（2）拍干的酶标板孔中，每孔100μL，本步骤中其它的操作与相应的实施例相同。

其它的步骤与相应的实施例相同，确定待测果汁样品中耐热菌的存在。

实施例7

在上述的实施例1～5的果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法中，在步骤（2）中将浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg／mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：220混合，加入步骤（1）的拍干后的酶标板孔中，每孔100μL，本步骤其它的操作与相应的实施例相同。在步骤（3）中将浓度为0.01mol／L pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比值为1：11000混合，加入步骤（2）拍干的酶标板孔中，每孔100μL，本步骤中其它的操作与相应的实施例相同。

其它的步骤与相应的实施例相同。

为了确定本发明检测步骤中的各最佳条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，每种实验重复三次，实验结果为三次重复试验的平均值，各种试 验情况如下：

试验材料与试剂：

浓缩苹果汁：pH值3.5～4.5，可溶性固形物含量为71±1°Brix，由陕西阿果安娜果汁股份有限公司提供；HRP酶标山羊抗大鼠抗体：Jackson ImmunoResearch进口分装；TMB（3,3'5,5'-四甲基联苯胺）：OURchem；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂：均购自Sigma公司；SDS-PAGE低分子量标准蛋白：Fermentas进口分装；考马斯亮蓝R250：USB进口分装；溴酚蓝：Sigma进口分装；TEMED（四甲基乙二胺）：Sigma进口分装；过硫酸铵（AP）：Amresco进口分装；SDS（十二烷基硫酸钠）：Sigma进口分装；甲叉双丙烯酰胺：Amresco进口分装；丙烯酰胺：Amresco进口分装；巯基乙醇：Amresco进口分装；明胶：Sigma进口分装；牛血清白蛋白：Amresco进口分装；脱脂奶：完达山牌脱脂奶粉。

其它试剂均为分析纯。

供试菌种：耐热菌标准菌株：Alicyclobacillus acidoterrestris DSMZ 3922，购自德国微生物菌种保藏中心，由本实验室保藏。大肠杆菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC 11778)、黑曲霉(Aspergillus niger ATCC 16404)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)由陕西师范大学生命科学学院微生物实验室提供。

实验动物：SD大鼠10只，成年雄性；大耳白兔，体重2.5±0.25kg，购自西安交通大学实验动物中心。

试验仪器：

可见分光光度计：UNICO WFJ2000型，上海龙尼柯仪器有限公司；紫外可见分光光度计：U-3010，日本HITACHI公司；隔水式恒温培养箱：GSP-9080-MBE型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；台式离心机：TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；超净操作台：SW-CJ-1F，苏净集团安泰公司；电热恒温水槽：HHW-21CU-600型，上海福玛实验设备有限公司；精密微量移液器：德国Eppendorf(10～100μL，0.1～10μL，30～300μL)；XW-80A漩涡混合仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；超声波清洗机：KQ3200B型， 昆山市超声仪器有限公司；酶标仪：伯乐680型，美国伯乐公司；D25mm透析袋：北京鼎国生物技术有限公司；Hitrap Protain G亲和层析柱，Hitrap Protain A亲和层析柱：GE Healthcare；恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；垂直平板凝胶电泳槽：北京六一仪器厂；微孔板振荡器：杭州奥盛仪器有限公司。

1、耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板

（1）确定抗体包被缓冲液

分别以物质的量浓度为0.05mol／L pH值为9.6的碳酸缓冲溶液、物质的量浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液、物质的量浓度为0.05mol／LpH值为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）缓冲溶液作为耐热菌兔源多克隆抗体包被缓冲液。检测抗原为耐热菌，浓度分别为1×10⁸个／mL、1×10⁶个／mL、1×10⁴个／mL，即分别为强阳性组、中阳性组、弱阳性组；同时设阴性对照，阴性对照分别用物质的量浓度为0.05mol／L pH值为9.6的碳酸缓冲溶液、物质的量浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液、物质的量浓度为0.05mol／L pH值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液，置于37℃孵育2小时，用吐温-20的质量分数为0.05%的物质的量浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板3次，每次2～3分钟，轻轻甩尽，在纱布上倒扣轻轻拍干。按照本发明的技术方案的检测方法进行操作，测定OD₄₅₀值，实验及计算结果见表1。

表1不同包被缓冲液的检测结果

注：cut off值为测定结果判断基线值，OD450值＞cut off值为阳性，OD450值＜cutoff值为阴性。

由表1可见，在强阳性组中，以物质的量浓度为0.05mol／L pH值为9.6的碳酸缓冲溶液或物质的量浓度为0.01mol／L pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液或 物质的量浓度为0.05mol／L pH值为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液作为耐热菌兔源多克隆抗体包被液，OD₄₅₀值均大于cut off值，其中，以物质的量浓度为0.05mol／L pH值为9.6的碳酸缓冲液作为包被液时，OD₄₅₀值最大。在中阳性和弱阳性组中，以物质的量浓度为0.05mol／L pH值为9.6的碳酸缓冲溶液为包被液，OD₄₅₀值均大于cut off值。本发明选择最佳包被液为物质的量浓度为0.05mol／L pH值为9.6的碳酸缓冲液。

（2）确定抗体包被浓度

采用方阵滴定法确定耐热菌兔源多克隆抗体包被浓度。将耐热菌兔源多克隆抗体稀释至浓度为10μg／mL，采用2倍倍比稀释，浓度分别为10μg／mL、5μg／mL、2.5μg／mL、1.25μgmL、0.625μg／mL、0.3125μg／mL、0.15625μg／mL、0.078125μg／mL，以上述抗体浓度分别包被96孔酶标板各列，每种浓度包被一列。最后一列为空白对照。明胶封闭后，加入浓度为10⁸个／mL，5×10⁷个／mL，10⁷个／mL，5×10⁶个／mL，10⁶个／mL，5×10⁵个／mL，10⁵个／mL的耐热菌菌悬液抗原，每种稀释倍数加一行，最后一行为空白对照，按照本发明专利技术方案中检测方法进行检测，比较不同抗体浓度和不同抗原浓度下的OD₄₅₀值，同时参照空白对照组的OD₄₅₀值，选择空白值最小，而阳性值最大的孔为耐热菌兔源多克隆抗体最佳包被浓度。实验及计算结果见表2。

表2方阵滴定法确定抗体包被浓度

分析表2结果可知，当包被抗原的浓度为10⁷个／mL，耐热菌兔源多克隆抗体浓度为5μg／mL时，OD₄₅₀值最大，即OD₄₅₀值为0.165。故选择耐热菌兔源多克隆抗体最佳包被浓度为5μg／mL。

（3）确定抗体包被条件

抗体包被条件为37℃2h或4℃过夜包被。试验结果如表3。

表3包被条件确定

由表3可知，以37℃2h为包被条件时，强阳性抗原组的OD₄₅₀值大于4℃过夜包被的OD₄₅₀值；而在中阳组和弱阳性组中，以37℃2h为包被条件时的OD₄₅₀值略高于4℃过夜包被的OD₄₅₀值；37℃2h为包被条件时的cut off值小于4℃过夜包被的cut off值。本发明选择最佳包被条件为37℃ 2h。

（4）封闭液的选择

耐热菌兔源多克隆抗体包被酶标板后，分别以牛血清白蛋白即BSA、明胶、脱脂奶分别包被酶标板。按照1%BSA、5%BSA、1%明胶、4%明胶、0.1%脱脂奶和0.5%脱脂奶分为六组，每组封闭两行酶标板，一行为阳性组，一行为空白对照组。抗原浓度分别为10⁸个／mL，10⁶个／mL，10⁴个／mL的耐热菌菌悬液，每种抗原浓度加入3列，第4、8、12列设定为空白对照组。反应结束后比较不同封闭液的强阳性组、中阳性组、弱阳性组及空白对照组的OD₄₅₀值。选择阳性值最大，且空白值最小的孔为最佳封闭液。余下步骤按照本发明专利技术方案中的检测方法进行操作，实验及计算结果见表4。

表4封闭液的选择

由表4可见，在强阳性组中，以明胶为封闭液时的OD₄₅₀值高于以其他两种溶液为封闭液的OD₄₅₀值；在中阳性组中，以明胶为封闭液时的OD₄₅₀值与 以BSA为封闭液时的OD₄₅₀值比较接近，高于以脱脂奶为封闭液时的OD₄₅₀值；在弱阳性组中，各组的OD₄₅₀值与均比较接近甚至低于相应的cut off值。各组的cut off值以明胶为封闭液时最小。因此本发明选择4%的明胶作为最佳封闭液。

（5）封闭时间的选择

以上述试验确定的4%明胶为封闭液，设定封闭时间分别为1h、1.5h、2h和2.5h，每种封闭时间设定两行，一行为阳性组，一行为空白对照组。抗原浓度分别为10⁸个／mL，10⁶个／mL，10⁴个／mL的耐热菌菌悬液，每种浓度加入3列，第4、8、12列设定为空白对照组。反应结束后比较不同浓度的明胶封闭下强阳性组、中阳性组、弱阳性组及空白对照组的OD₄₅₀值。选择阳性值最大，且空白值最小的孔为最佳封闭时间，余下步骤按照本发明专利技术方案中的检测方法进行操作，实验及计算结果见表5。

表5封闭时间的选择

由表5可见，封闭时间为2h时，三种抗原浓度OD₄₅₀值均最高高，且cutoff值也最低。因此选择2h为最佳封闭时间。本发明选择封闭时间为2h。

（6）试剂盒保存有效期

参考《中国生物制品检定规程》，对于包被的酶标板试剂盒在37℃保存3天进行加速破坏试验，以4℃条件保存对照，与4℃保存的试剂盒相比较测定同一样品的吸光度值下降不超过20%，认为其在4℃有效期在6个月左右。试剂盒保存有效期试验结果见表6。

表6试剂盒的保存有效期

由表6可知，试剂盒在37℃条件下避光保存中，阳性OD450值有下降的趋势，37℃保存3d时，各组的阳性OD450值均略有下降，但下降未超过20%；37℃保存7d时，各浓度下的阳性OD450值均出现大幅度下降，强阳性和中阳性组OD450值仅相当于保存前的10%左右，已经基本失去了检测能力。因此本研究中预包被的酶标板可以在密封避光条件下在4℃保存6个月。

（7）确定酶标板的cut off值

设定384个阴性样品，通过灭菌确定其中不含耐热菌抗原。按照本发明专利技术方案中的检测方法进行操作，测定384个样品的OD₄₅₀值，计算其平均值和标准差，cut off值按照下式进行计算。试验结果见图1。

$\mathrm{Cut\; off}=\stackrel{\‾}{X}+2\×\mathrm{SD}$

其中 表示384个样品OD₄₅₀的平均值，SD表示384个样品OD₄₅₀的标准差。

根据统计分析可得，由384个阴性样品OD450值所组成的样本平均值为0.0282，标准差为0.00458，根据cut off值计算公式，可以计算出cut off值为0.03736，取小数点后三位为0.038。

2、试剂盒应用与性能评价

为了证明本发明的有益效果，发明人应用实施例1制备的用于果汁中耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒，运用实施例1的检测方法检测果汁中的耐热菌，并从试剂盒的特异性、精密度、重复性、准确度、灵敏度等方面对试剂盒进行性能评价，并与传统平板培养计数法（KFL法）的测试结果进行了比较，各种试验情况如下：

（1）试剂盒的特异性试验

分别配制浓度为10⁸个/mL的耐热菌（A.acidoterrestris DSMZ 3922）、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC11778)、黑曲霉(Aspergillus niger ATCC16404)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)菌悬液。按照步骤1至步骤7所描述的耐热菌双夹心ELISA具体步骤进行试验，实验及计算结果见表7。所得OD₄₅₀值高于cut off值及判断为阳性，低于cut off值及判断为阴性。

表7特异性试验结果

菌液种类	OD450值
		金黄色葡萄球菌	0.02592
大肠杆菌	0.03242
		巨大芽孢杆菌	0.03350
白色念珠菌	0.03650
		枯草芽孢杆菌	0.03450
绿脓杆菌	0.02867
		蜡状杆菌	0.03567
耐热菌	0.82792

注：cut off值：0.038。

由表7可见，除耐热菌外，其他7种菌的阳性值均为小于cut off值，即均为阴性，证明本发明所建立的ELISA检测方法与所试的7种菌无交叉反应，方法具有较高的特异性。

（2）试剂盒的精密度和重复性试验

①板内重复试验

以板内各孔OD₄₅₀值的变异系数反映试剂盒的精密度。在同一块酶标板内设定耐热菌菌悬液浓度分别为1×10⁶个/mL、1×10⁷个／mL、1×10⁸个/mL。每种浓度加入三列，同时设定空白对照。本发明专利技术方案中的检测方法进行操作进行测定，通过计算各浓度下OD₄₅₀值的平均值、标准差和变异系数评价耐热菌双夹心ELISA方法的批内变异系数。实验及计算结果见表8。

表8板内重复性试验

抗原浓度个/mL	平均值	标准差	变异系数
				108	1.554	0.055	3.55%
107	1.296	0.025	1.91%
				106	0.619	0.023	3.77%

由表8可见，试剂盒测定值的批内变异系数小于5%，表明本试剂盒紧密度高。

②板间重复性试验

以不同批次的板间各孔OD₄₅₀值的变异系数反映试剂盒的重复性。设定7个耐热菌菌悬液样品，每种浓度分别加入4块不同批次酶标板，每块酶标板加入3孔，同时设定空白对照。先计算每个酶标板内同一样品的变异系数， 当变异系数小于5%时，计算每种浓度下的不同批次的批间变异系数。实验及计算结果见表9所示。

表9板间重复性试验

由表9可见，不同批次试剂盒的批间的变异系数均小于10%，说明本试剂盒具有很好的重复性。

（3）试剂盒对耐热菌的检出限试验

①人工培养样品的检出限验证

取人工培养的耐热菌，分别制备成浓度为10⁸个／mL，5×10⁷个／mL，10⁷个mL，5×10⁶个／mL，10⁶个／mL，、5×10⁵个／mL，10⁵个／mL，5×10⁴个／mL，10⁴个／mL，5×10³个／mL，10³个／mL的耐热菌菌悬液，每个浓度加入一列，同时设定空白对照。按照2.3.6.2中所描述的耐热菌双夹心ELISA具体步骤进行测定，所得OD₄₅₀值高于cut off值及判断为阳性，低于cut off值及判断为阴性。实验及计算结果见表10。

表10耐热菌人工培养样品检出限的确定

由表10可见，当耐热菌浓度大于5×10³个/mL时，OD₄₅₀值大于cut off 值，即可以得到正确的阳性结果；当耐热菌浓度为10³个/mL时，OD₄₅₀值小于cut off值，出现假阴性的结果。因此可以确定，本发明所建立的双夹心ELISA检测的耐热菌的最低检测限为5×10³个/mL。

②对耐热菌人工回添果汁样品的检出限验证

浓缩苹果汁通过121℃，20min高压蒸汽灭菌得到无菌果汁，将无菌果汁用无菌水稀释10倍，配制一定浓度的耐热菌菌悬液，回添到稀释后的无菌果汁中，保证回填后的果汁样品中耐热菌终浓度分别为1×10⁴个／mL、1×10⁵个／mL、1×10⁶个／mL、1×10⁷个/mL、1×10⁸个/mL，每个浓度设定3个平行孔，参照技术方案中的检测方法进行测定，所得OD₄₅₀值高于cut off值及判断为阳性，低于cut off值及判断为阴性。实验及计算结果见表11。

表11耐热菌人工回添果汁样品的检测结果

菌液浓度（个/mL）	OD450值
		1×108	1.427
1×107	0.772
		1×106	0.406
1×105	0.158
		1×104	0.047

由表11可知，在果汁中耐热菌浓度为10⁴个/mL以上时，样品阳性OD₄₅₀值高于cut off值，即可以直接检出稀释后果汁中的耐热菌。由于浓缩苹果汁10倍稀释，可以推断得出当浓缩苹果汁中耐热菌浓度达到10⁵个/mL时，说明本发明方法可检测出说明本发明方法可检测出人工回添果汁中1×10⁵个/mL以上含量的耐热菌。

（4）试剂盒对实际果汁样品中耐热菌检测的灵敏度及准确度试验

应用试剂盒对实际果汁样品进行检测。以检测结果可判断出果汁中耐热菌是否超过1个/10mL个的国际标准，为灵敏度判断标准；以与国际通行的果汁中耐热菌检测方法——美国KFL传统平板培养计数法对比，评价试剂盒准确度。

参照申请号分别为200910022897.7、201010249781.X的中国专利所公开的对果汁中耐热菌集菌和预增菌方法，对果汁样品预先进行集菌和预增菌，再按照本发明实施例1中的方法进行操作，同时按照美国KFL法对比检测，检测果汁中的耐热菌，实验结果见表12。

表12实际果汁样品中耐热菌的检测结果

1、检测结论：按＜1个/10gAJC为合格的标准。

2、ELISA测定值为OD值，阳性判断标准为>0.038。

由表12可见，9个样品中，有2样品KFL检测结果分别为每10克或10mL浓缩汁中耐热菌含量为2个和4个，同时用ELISA法测定结果均为阳性；其余7个样品KFL检测结果为耐热菌含量为＜1个/10g，与之对应ELISA法检测结果均为阴性。9份品采用本发明方法检测结果与传统培养计数法完全符合，说明本发明试剂盒配套用于果汁耐热菌ELISA检测方法中，检测结果可靠，准确度高，可以实际应用。

Claims (1)

1.一种果汁中的耐热菌的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将经过灭菌处理的果汁样品作为阴性样品与待测果汁样品按照每孔100μL的量分别加入检测试剂盒的酶标板孔中，置于恒温箱中37℃保温50～150分钟后取出，将吐温-20与浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：1900～2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

(2)将浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.3mg/mL的耐热菌鼠源多克隆抗体溶液按照体积比为1：195～210混合，加入步骤(1)的拍干后的酶标板中，每孔100μL，置于恒温箱中37℃孵育50～150分钟后取出，用步骤(1)中配制的洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

(3)将浓度为0.01mol/L、pH值为7.6的磷酸盐缓冲溶液与浓度为0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠抗体溶液按照体积比为1：3000～6000混合，加入步骤(2)拍干的酶标板板孔中，每孔100μL，将其置于恒温箱中37℃孵育50～120分钟后取出，用步骤(1)配制的洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；

(4)向步骤(3)的拍干后的酶标板板孔内加入底物工作液，每孔100μL，在恒温箱中37℃避光反应15～20分钟，加入50μL浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应；

(5)用酶标仪在450nm波长下测定步骤(4)反应终止酶标板的分光光度值，与步骤(1)的阴性样品的cut off值进行比较，确定待测果汁样品中耐热菌的存在，样品分光光度值大于cut off值，为阳性，表明样品中存在耐热菌，样品分光光度值小于cut off值，为阴性，表明样品中无耐热菌，cut off值按下式计算：

$\mathrm{Cut\; off}=\stackrel{\‾}{X}+2\×\mathrm{SD}$

式中表示阴性样品OD₄₅₀的平均值，SD表示阴性样品OD₄₅₀的标准差，OD₄₅₀是波长为450nm下的分光光度值；上述步骤(4)中的底物工作液的配制方法为取浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液和浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液与二蒸水混合，二蒸水与磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸溶液的体积比为1：0.514：0.486，配制成底物缓冲液；再将固液比为0.001g/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺乙醇溶液与底物缓冲液以体积比为1：1混合，配制成混合溶液，加入质量分数为30％的H₂O₂溶液，混合溶液与H₂O₂溶液的体积比为1：0.002，摇匀，即配制成底物工作液；

上述步骤(1)中的检测试剂盒由下述方法制备：用浓度为0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸缓冲液将耐热菌兔源多克隆抗体溶液稀释至浓度为4.8～5.2μg/mL，加入酶标板孔内，每孔加100μL，置于恒温培养箱37℃孵育1.9～2.1小时，将吐温-20与浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液按照体积比为1：1900～2200混合配制成洗液，用洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干酶标板；向拍干的酶标板的每个孔内加入100μL的封闭液，置于恒温箱中37℃保温封闭90～150分钟，取出，用步骤(1)配制的洗液冲洗酶标板2～3分钟，重复冲洗3～5次，拍干，得到封闭的酶标板；将封闭的酶标板用铝箔袋真空包装，得到耐热菌双抗体夹心ELISA检测试剂盒；

上述封闭液是质量分数为3.8％～4.2％的明胶溶液或质量分数为1％～5％的牛血清蛋白溶液。