CN102854276A - 米伐木肽的高效液相色谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种米伐木肽的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法和蒸发光散射检测器，对样品进行等度洗脱，避免了使用易损害仪器的正相色谱法，洗脱程序简易，出峰峰形好，主峰与杂质峰的分离度好，能科学便捷的控制米伐木肽的纯度及含量，为该药物生产过程中的质量控制提供一个简单有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及米伐木肽的高效液相色谱分析方法。
背景技术
米伐木肽是一种脂质体包裹的胞壁三肽磷酸酯酰乙醇胺，为化学合成二肽衍生物。本品由Ciba-Geigy(现为诺华)在80年代研究开发，2003年IDM Pharma公司收购该产品并进行临床研究，于2005年生产出首批米伐木肽。
米伐木肽是一种分支杆菌胞壁成分，为一种天然免疫刺激剂，本品制成球形脂质体，囊泡内是胞壁酰三肽(MTP)。此脂质触发巨噬细胞去消耗米伐木肽。一旦消耗完，MTP刺激尤其是在肝、脾和肺内的巨噬细胞去寻找并杀灭肿瘤细胞。2009年3月，欧洲批准IDM Pharma公司的米伐木肽注射剂(mifamurtide，L-MTP-PE，Mepact)上市，用于治疗非转移性可切除的骨肉瘤(少见但主要造成儿童和青年死亡的骨瘤)。本品是20余年来首个获准上市治疗骨肉瘤的新药。本品可在欧盟27个成员国以及冰岛、列支敦士登和挪威销售。
米伐木肽及其成盐产品的分子式分别为C59H109N6O19P和C59H108N6O19P·Na·X H2O(X＝0～5)，结构式分别为：
米伐木肽及其成盐产品为两性分子，其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团(含两个丙氨酸，一个谷氨酸的三肽类)构成的亲水头和由脂肪酸链构成的疏水尾。磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近。米伐木肽及其金属盐产品溶解性相似，可以采用相同的高效液相色谱方法进行质量分析。
目前米伐木肽及其成盐产品的含量检测方法未见报道，因而缺乏对米伐木肽原料及其成盐产品的质量监控方法。对于与米伐木肽结构类似的的磷脂酰乙醇胺，国内国外目前大部分文献资料采用正相系统进行洗脱。药典中测定磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺采用HPLC-ELSD进行色谱分析，色谱柱为硅胶柱，流动相涉及有甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、正己烷、异丙醇多种试剂，流动相配制复杂。且采用复杂的梯度洗脱程序。国内文献(HPLC同时测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱含量，中国现代应用药学2011，28(6)，564-567)报道的方法是采用正相硅胶柱，流动相系统有正己烷-异丙醇-水(5∶80∶20)，在正相色谱柱中，水相比例接近20％，对硅胶色谱柱有一定的溶解作用，使色谱柱的柱效降低。Journal ofChromatography B，2001(754)，127-133报道采用反相高效液相色谱分析磷脂酰乙醇胺，采用三乙基硅烷化学键合硅胶为固定相的反相色谱柱(C1)，采用的流动相为氯仿∶甲醇∶水(1∶33∶6)，但峰形对称性不好。
发明内容
本发明提供了一种米伐木肽的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法和蒸发光散射检测器测定米伐木肽的含量和纯度，能科学便捷的控制米伐木肽的纯度及含量，为该药物生产过程中的质量控制提供一个简单有效的方法。
本发明提供的米伐木肽的高效液相色谱分析方法，其特征在于，该方法为以蒸发光散射检测器为检测器的等度洗脱的反相高效液相色谱方法。蒸发光散射检测器(ELSD)的响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响，ELSD的响应值与样品的质量成正比，灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定。发明人曾采用紫外检测器，检测时出峰不明显，且杂质甚至不出峰，存在溶剂峰干扰测定的现象。而高效液相色谱等度洗脱和ELSD的联用，可以检测出在紫外和荧光检测器中无法检测的杂质，且不受官能团的影响。更能够真实反映米伐木肽及其成盐产品的含量及杂质含量。
所述反相高效液相色谱方法的色谱条件为：固定相为辛烷键合硅胶或十八烷基键合硅胶； 流动相为甲醇：水溶液系统，甲醇∶水体积比为60～100∶40～0，优选甲醇∶水体积比为80∶20，流动相用甲酸铵调PH至6.0～9.0，优选7.0；流速为0.5～1.5ml/min，优选1ml/min；色谱柱温20～40℃，优选30℃；进样体积为5μl；蒸发光散射检测器检测漂移管温度为30～45℃，载气压力为2.0～5.0psi；样品的溶解试剂为甲醇。
本发明通过对不同色谱柱和流动相溶剂，缓冲盐加入后的pH值，样品溶解试剂，检测器等方面进行考察，提供了一种米伐木肽的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法和蒸发光散射检测器，对样品进行等度洗脱，避免了使用易损害仪器的正相色谱法，洗脱程序简易，出峰峰形好，主峰与杂质峰的分离度好，能科学便捷的控制米伐木肽的纯度及含量，为该药物生产过程中的质量控制提供一个简单有效的方法。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
说明书附图
附图1米伐木肽对照品的HPLC-ELSD色谱图
附图2米伐木肽碱破坏样品的HPLC-ELSD色谱图
附图3米伐木肽的UPLC-TOF/MS质谱图
具体实施方式
1.仪器与试剂
1.1 仪器与试剂
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪，
Waters UPLC-TOF/MS(LCT Premier XE)
试剂：甲酸铵，甲醇(分析纯)，纯水
样品：米伐木肽，自制(深圳万乐药业有限公司)
1.2 色谱条件
色谱柱：Ultimate LP-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测器：ELSD(漂移管温度为40℃，载气压力为3.5psi，Gain为6)
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水(5mM甲酸铵缓冲盐，pH＝7.0)
采用等度洗脱，流动相A∶流动相B＝80∶20
流速：1ml/min
进样量：5μl
柱温：30℃
稀释液：二氯甲烷
2.溶液的制备
供试品溶液：精密称取米伐木肽样品约25mg，置25ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度。
对照品溶液：精密称取米伐木肽对照品(纯度97.0％)约25mg，置25ml容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度。
3.方法验证
3.1 方法的专属性考察
3.1.1 检测限
取对照品溶液，按上述色谱条件，进样分析，结果见附图1。
将上述对照品溶液逐级稀释，直到米伐木肽的信噪比S/N≥3，此时，米伐木肽的最低检出浓度为10μg/ml。
3.1.2 破坏试验
3.1.2.1 酸破坏试验
取本品25mg，置25ml量瓶中，加入1mol/L甲酸溶液1ml，于室温条件下放置5h，加1mol/L氨水溶液1ml进行中和，加稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，测定，结果：色谱图中未见明显的杂质色谱峰。
3.1.2.2 碱破坏试验
取本品25mg，置25ml量瓶中，加入1mol/L氨水溶液1ml，于室温条件下放置5h，加1mol/L甲酸溶液1ml进行中和，加稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，测定，结果：色谱图中有明显的杂质色谱峰，保留时间为7min左右，面积归一化法，比例达到16％，且与主成分有效分离，分离度为2.8(见附图2)。
3.1.2.3 光照破坏试验
取本品25mg，置25ml量瓶中，于强光照射下放置12h，加稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，测定，结果：色谱图中未见明显的杂质色谱峰。
3.1.2.4 高温破坏试验
取本品25mg，置25ml量瓶中，于105℃高温下放置5h，加稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，测定，结果：色谱图中未见明显的杂质色谱峰。
3.1.2.5 氧化破坏
取本品25mg，置25ml量瓶中，加入双氧水溶液1ml，于室温条件下放置5h，加稀释溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取10μl进样，测定，结果：色谱图中未见明显的杂质色谱峰。
以上试验表明在酸、高温、光照和氧化破坏条件下，米伐木肽原料较稳定均未检测到明显的杂质色谱峰，而在碱破坏条件下，米伐木肽的稳定性较差，有比较大的降解产物产生。
3.2 UPLC-TOF/MS结构确证试验
色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm2.1×50mm)
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为水(5mM甲酸铵缓冲盐，pH＝7.0)
采用等度洗脱，流动相A∶流动相B＝80∶20
流速0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：0.5μl。
质谱条件：离子源为ESI源；毛细管电压2000V；锥孔电压60V；毛细管温度：350℃；离子源温度120℃：干燥气流速：700L/hr；辅助气流速：50L/hr；负离子W模式检测；扫描范围：m/z100～2000。米伐木肽及其成盐产品在ESI负离子化方式下，主要生成[M-H]-和[M-Na]-分子离子峰，分别均为m/z1235.80。结果：所显示的分子离子峰与米伐木肽的分子组成相匹配(见附图3)，进一步确证HPLC-ELSD所检测到的峰为米伐木肽的主成分峰。
Claims (10)
1.一种米伐木肽的高效液相色谱分析方法，其特征在于，该方法为以蒸发光散射检测器为检测器的等度洗脱的反相高效液相色谱方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱方法的色谱条件为：固定相为辛烷键合硅胶或十八烷基键合硅胶；流动相为甲醇∶水溶液系统，甲醇∶水体积比为60～100∶40～0；流动相用甲酸铵调PH至6.0～9.0；流速为0.5～1.5ml/min；色谱柱温20～40℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，固定相为十八烷基键合硅胶。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，甲醇∶水体积比为80∶20。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流动相用甲酸铵调PH至7.0。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流速为1.0ml/min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，色谱柱温30℃。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进样体积为5μl。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蒸发光散射检测器检测漂移管温度为30～45℃，载气压力为2.0～5.0psi。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，米伐木肽的溶解溶剂为二氯甲烷。
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