CN102851347B - 硫化氢提高桑黄白桦酯醇和筋骨草蜕皮激素含量的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，是硫化氢（H2S）促进次生代谢物合成的一种新用途。其特征在于：（1）H2S有效促进了桑黄菌丝的生长和菌丝中白桦酯醇的合成；（2）H2S有效促进了筋骨草悬浮细胞生长和细胞中蜕皮激素的合成。本发明为促进次生代谢物合成提供了一种新的诱导子。
Description
技术领域：
本发明涉及硫化氢（H2S）促进次生代谢物的合成，它属于生物工程技术领域。
背景技术：
近年来，利用植物离体培养技术生产有用次生代谢物质的研究取得了很大的进展，如紫草细胞生产紫草素、人参细胞培养生产皂甙、洋地黄细胞培养生产生物碱等都达到工业化的生产规模，用长春花细胞培养生产抗癌生物碱已经达到了中试水平（刘春朝等，1997；胡立勇，2004）。然而次生代谢产物的低产现象是制约细胞培养植物天然产物技术产业化应用的核心问题之一，理解和掌握植物细胞次生代谢调控规律是解决这一问题的基础。虽然，国内外研究者针对植物培养细胞中次生代谢物低产问题进行了研究，包括优质细胞系的选育、培养条件的优化、培养技术改进以及活性物质合成关键酶基因的克隆等（郭肖红等，2005；徐茂军，2009；钱丹丹等，2011）。但到目前为止，植物细胞中次生代谢物的低产问题仍未得到很好的解决。
诱导子是可以迅速、专一和选择性地诱导植物多种特定基因表达的物质，尤其是活化特定的次生代谢产物。如茉莉酸诱导子使金银花细胞中的齐墩果酸增加了9.4倍（Wiktorowska等，2010），真菌诱导子使亚麻细胞中的足叶草毒素含量增加了7倍（Bahabadi等，2012）。为此，诱导子被认为是提高药用植物次生代谢产物最有效的方法之一。但是在诱导子促进次生代谢物合成中发现，虽然大部分诱导子促进了目的代谢物的合成，却不同程度地抑制了细胞的生长，从最终次生代谢物产量上分析，其提高程度仍不能满足生产需求。如能找到同时促进细胞生长和次生代谢物积累的诱导子，将为解决植物细胞培养生产次生代谢物中低产的问题提供解决的思路。
硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是一种带有臭鸡蛋味的气体，在植物中H2S的主要合成酶为半胱氨酸脱巯基酶，在L-或D-半胱氨酸脱巯基酶(磷酸吡哆盐依赖性酶)的作用下催化半胱氨酸降解成H2S、丙酮酸盐和NH4（Jin等，2011）。近年来的研究发现，H2S具有促进种子萌发和提高植物抗逆反应等生理作用（侯智慧等，2011；Wei等，2011），而H2S与次生代谢物的关系还未见报道。
因此，我们期望明确H2S与次生代谢物的关系，找到同时促进细胞生长和次生代谢物积累的新诱导子，为解决植物细胞培养生产次生代谢物中低产的问题提供可靠的诱导子。
本发明的内容：
本发明提供一种H2S促进有用次生代谢物合成的用途。其特征在于（1）H2S有效促进了桑黄菌丝中白桦酯醇和筋骨草悬浮细胞中蜕皮激素的合成;（2）H2S促进了桑黄菌丝和筋骨草悬浮细胞的生长。
本发明的目的是提供了一种促进次生代谢物合成的新诱导子。
为了更好的理解本发明，下面结合本发明的实施方案进一步说明本发明的实质性内容：
具体实施方式：
下面实验分别从植物和微生物两种生物上研究H2S对次生代谢物合成的影响。（1）H2S对桑黄菌丝生长和白桦酯醇含量的影响；（2）研究H2S对筋骨草悬浮细胞生长和蜕皮激素含量的影响。药品为H2S的供体硫氢化钠。
例1
一、实验材料与方法
（1）桑黄菌丝的培养条件
取本研究室筛选出的产白桦酯醇的桑黄菌丝接入100ml马铃薯（PDA）液体培养基中，添加葡萄糖20g/L，接种量为60g/L，每隔15d继代一次，摇床转速为100-200rpm。
（2）硫氢化钠的添加
在菌丝生长的第8d加入H2S的供体硫氢化钠，添加硫氢化钠的浓度为0.1nmol/L、0.5nmol/L、1nmol/L和2nmol/L，每个浓度处理重复3次，诱导4d后收获菌丝，测定菌丝的干重和菌丝中白桦酯醇的含量。
（3）白桦酯醇的提取和测定
白桦酯醇的提取和测定采用范桂枝等2007，张泽等2004的方法。提取试剂：95%乙醇；提取方法：超声波提取法；测定方法：高效液相色谱法，检测波长210nm，流动相为乙腈和水（V:V=8:2），流速1.0mL/min。
二、研究结果
桑黄菌丝的生长量和白桦酯醇的产量对H2S的响应存在浓度效应（表1），菌丝生长量在1nmol/L处理下达最大值，比对照增加了20.07%，而白桦酯醇含量和产量随处理浓度的增加而增加，在2nmol/L时达最大值，分别比对照增加了13.9倍和14.62倍。
表1H2S对桑黄菌丝干重和白桦酯醇产量的影响
例2
一、实验材料与方法
（1）筋骨草悬浮细胞的培养条件
将本研究室保存的产蜕皮激素的筋骨草细胞系接入100ml MS液体培养基中，添加0.4mg/mL的2,4-D，蔗糖20g/L，pH值为5.5-6.0，接种量为40g/L（鲜重），每隔15d继代一次。培养温度为25～27℃，光照强度为2000lx，每天光照16h，摇床转速为120r/min。
（2）硫氢化钠的添加
在细胞生长的第8d加入H2S的供体硫氢化钠，添加硫氢化钠的浓度为0.25nmol/L、0.5nmol/L、1nmol/L和2nmol/L，每个浓度处理重复3次，诱导0.5d～8d后收获细胞，测定细胞的干重和细胞中蜕皮激素的含量。
（3）蜕皮激素的提取和测定方法
蜕皮激素的提取和含量测定采用赵晓杰等（2011）的方法。提取试剂：95%乙醇；提取方法：微波消解法；测定方法：高效液相色谱法，检测波长242nm，流动相为甲醇和水（V:V=5:5），流速1.0mL/min。
二、研究结果
筋骨草悬浮细胞的干重和蜕皮激素含量对H2S的响应存在浓度和时间效应（表2和表3），悬浮细胞干重在1nmol/L和2nmol/L硫氢化钠处理4～8d时达最大值，比对照增加了16.03～25.47%，而蜕皮激素含量在2nmol/L硫氢化钠处理0.5d时达最大值，是对照的2.5倍。
表2H2S对筋骨草悬浮细胞干重的影响 干重单位：g/L
表3H2S对筋骨草悬浮细胞中蜕皮激素含量的影响 蜕皮激素含量：mg/g
本发明的效果：
利用上述实施方案，本发明H2S对次生代谢物合成的促进效果如下：
（1）2nmol/L硫氢化钠处理桑黄菌丝4d时，白桦酯醇含量和产量分别比对照增加了13.9倍和14.62倍。
（2）2nmol/L硫氢化钠处理筋骨草悬浮细胞0.5d时，蜕皮激素含量是对照组的2.5倍。
附图1.桑黄菌丝的固体培养；
附图2.桑黄菌丝的液体培养；
附图3.白桦酯醇的标品图；
附图4.白桦酯醇的样品图；
附图5.筋骨草愈伤组织的固体培养；
附图6.筋骨草愈伤组织的悬浮培养；
附图7.蜕皮激素的标品图；
附图8.蜕皮激素的样品图。
Claims (1)
1.一种硫化氢的用途，所述用途为硫化氢提高桑黄菌丝中白桦酯醇和筋骨草悬浮细胞中蜕皮激素的含量。
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