CN102844436A - 针对ngf的适配体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有结合NGF的活性的更高质量的适配体。本发明提供一种结合NGF的适配体，所述适配体满足下述(1)和(2)：(1)包含由UGAAARAAACC(SEQ ID NO：64)或CGAAMRAAACU(SEQ ID NO：65)所示的序列，和(2)具有不超过73的碱基长度。

Description

针对NGF的适配体及其用途

技术领域

本发明涉及针对NGF的适配体，利用其的方法等。

背景技术

神经生长因子(NGF)是于1951年鉴定的第一个神经营养蛋白，并且是参与外周和中枢神经元的发育和存活的重要的分泌性蛋白。其由118个氨基酸组成，分子量为13kD，并且在分子中的3个位置处具有S-S键。在该家族蛋白中有BDNF、NT-3和NT-4/5，它们在结构上是非常保守的，并且通过非共价键形成同型二聚体。其具有面向3个不同方向的β折叠结构，并且被认为在此部分中二聚化。其还具有在家族内的同源性很低的4个环结构(loop structure)，并且这些部分被认为限定对受体的特异性。

作为NGF受体，已知有具有高亲和性的酪氨酸激酶-型受体TrkA和具有低亲和性的p75，后者属于肿瘤坏死因子受体超家族。这些受体作为同型二聚体或异二聚体起作用，并且深入地参与在神经系统的发育和维持中。TrkA是单次(single-pass)跨膜受体并且在细胞内结构域中具有酪氨酸激酶结构。当结合NGF时，发生酪氨酸磷酸化，信号传递至下游，并促进细胞的分化和维持细胞的存活。

作为TrkA的家族受体，已知有TrkB和TrkC。TrkB与BDNF和NT-4/5结合，TrkC与NT-3结合。p75与TrkA相比显示较低的配体特异性，并且除了NGF以外还与BDNF、NT-3和NT-4/5结合。尽管p75是单次跨膜受体，但其在细胞质侧没有酪氨酸激酶结构域。类似于TrkA，其不仅在神经细胞中表达，而且在非神经细胞中也表达。已知此受体参与促进细胞的分化和维持细胞的存活，以及涉及诱导凋亡和细胞迁移。晶体结构分析的结果表明NGF同型二聚体以2∶2结合TrkA且以2∶1结合p75。NGF同型二聚体有时与TrkA和p75的异二聚体结合。

NGF由施旺细胞(Schwann cell)、角化细胞(keratinized cell)、支气管上皮细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、B淋巴细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、肾小球细胞、骨骼肌细胞等产生。另一方面，已知TrkA在神经细胞中，以及除神经细胞以外在单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和肥大细胞中表达。类似地，p75在神经细胞以及非神经细胞中表达。

众所周知，NGF在神经系统中具有关键性的作用。已经阐明NGF具有维持胆碱能神经元存活的作用并且被认为与阿尔茨海默病(Alzheimer′sdisease)具有某种联系。另外，由于NGF的脑内给药改善老年大鼠的记忆障碍，因而其也预期作为老年性痴呆(senile dementia)的治疗药物。

已经发现NGF也作用于除神经系统以外的组织和细胞，并且参与机体的防御和组织修复过程。例如，已知将NGF施用于动物增加血管通透性，增强T细胞和B细胞的免疫应答，诱导淋巴细胞分化，诱导肥大细胞生长，诱导肥大细胞释放多种细胞因子等。

NGF与炎症有关，并且在患有炎性疾病的患者和炎性动物模型中已经观察到NGF的表达增加。其实例有系统性红斑狼疮(Systemic lupuserythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis)、银屑病(psoriasis)、关节炎(arthritis)、间质性膀胱炎(interstitial cystitis)、哮喘(asthma)等。已经报道类风湿性关节炎患者的滑液显示较高的NGF浓度。另外，已经报道类风湿关节炎模型大鼠中NGF表达增加，和在关节炎模型小鼠中肥大细胞增多和NGF表达增加。

NGF与疼痛密切相关。当NGF经皮下施用于人时，深部疼痛诸如肌肉疼痛持续数天，并且发生注射部位的痛觉过敏。NGF敲除小鼠和TrkA敲除小鼠缺少无髓鞘神经并且不会感觉到疼痛。当NGF以1mg/kg经腹膜内施用于成熟大鼠，发生针对有害热刺激和机械性刺激的痛觉过敏。NGF转基因小鼠显示不伴有炎性病症的痛觉过敏。另外，已知患有先天性无痛无汗症(congenital insensitivity to pain with anhidrosis)(CIPA)的患者的TrkA基因具有异常，并且当NGF基因异常时痛觉减退。

从上述来看，NGF抑制剂可以用作用于疼痛诸如伤害性疼痛(nociceptive pain)、炎性疼痛(inflammatory pain)、神经性疼痛(neuropathicpain)、癌性疼痛(carcinomatous pain)、纤维肌痛(fibromyalgia pain)等的治疗药物。已经报道了NGF抗体和NSAID的联合疗法(专利文件1)、NGF抗体和阿片样物质止痛剂的联合疗法(专利文件2)、使用NGF抗体治疗术后疼痛的方法(专利文件3，专利文件4)、使用NGF抗体治疗骨癌疼痛的方法(专利文件5)和使用NGF抗体治疗骨关节炎疼痛的方法(专利文件6)。

Tanezumab(PF-4383119或RN624)是针对NGF的抗体，其显示在使用骨关节炎动物模型的疼痛模型试验中有效，并且目前处于临床试验阶段。尽管NGF和NGF受体是否存在抑制活性还未知，但有涉及结合NGF的天然RNA的报道(非专利文件1)。

近年来，RNA适配体在药剂、诊断剂和检测药物方面的应用已经得到了关注；一些RNA适配体已经处于临床研究阶段或实际应用中。在2004年12月，世界上首个RNA适配体药物，Macugen在美国被批准为用于老年性黄斑变性(age-related macular degeneration)的治疗药物。RNA适配体是指与靶分子诸如蛋白特异性结合的RNA，并且其可以使用SELEX(指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment))方法(专利文件7-9)制备。在SELEX中，特异性结合靶分子的RNA选自具有约10¹⁴种不同的核苷酸序列的RNA集合体(pool)。使用的RNA结构具有约40个残基的随机序列，其侧翼是引物序列。此RNA集合体允许与靶物质装配，并且使用滤器等仅收集与靶物质结合的RNA。收集的RNA通过RT-PCR扩增，并且将其用作用于下一轮的模板。通过重复此操作约10次，可以获得与靶物质特异性结合的RNA适配体。

适配体药物，如同抗体药物，可以靶向细胞外因子。参考公共领域中的许多科学论文和其他参考材料，适配体药物被认为在一些方面有可能超越抗体药物。例如，适配体经常显示比抗体更高的结合力和更高的特异性。适配体不可能经历免疫排除，并且使用适配体不可能发生抗体特有的不良反应，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。从递送的角度看，由于适配体的大小为抗体的约1/10，药物至目标部位的递送较为容易。由于适配体通过化学合成制备，因此可以容易地作出各种改动，通过大规模制备降低成本成为可能。同时，适配体的血液半衰期通常比抗体的血液半衰期更短；然而，就毒性而言，此性质有时是有利的。这些事实得出如下结论：甚至在靶向同一种分子时，适配体药物有可能优于抗体药物。

本发明人已经在PCT/JP09/066457中制备了结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合的适配体，并且发现该适配体抑制NGF的神经突伸长活性。专利文件10描述了针对NGF的适配体，其通过自动化SELEX得到，并且专利文件11描述了专利文件10中得到的适配体的改变的产物和修饰的产物。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1：WO04/073653

专利文件2：WO04/096122

专利文件3：WO04/032870

专利文件4：WO05/000194

专利文件5：WO05/111077

专利文件6：WO06/110883

专利文件7：WO91/19813

专利文件8：WO94/08050

专利文件9：WO95/07364

专利文件10：WO02/077262

专利文件11：WO03/070984

[非专利文件]

非专利文件1：Binkley J等，(1995)Nucleic Acids Res(核酸研究)，23，3198-3205

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种针对NGF的适配体、使用其的方法等。具体地，本发明的目的在于提供一种链长度短的适配体，所述适配体适合用作药物产品。

解决问题的方式

本发明人进行了大量的研究以解决上述问题，并且成功地制备了质量更好的针对NGF的适配体，从而完成了本发明。

因此，本发明提供下述：

[1]一种结合NGF的适配体，所述适配体满足下述(1)和(2)：

(1)包含由UGAAARAAACC(SEQ ID NO：64)或CGAAMRAAACU(SEQ ID NO：65)所示的序列，和

(2)具有不超过73的碱基长度。

[2]根据[1]所述的适配体，所述适配体抑制NGF与NGF受体的结合。

[3]根据[1]或[2]所述的适配体，所述适配体抑制NGF的神经突伸长活性或细胞增殖活性。

[4]根据[3]所述的适配体，所述适配体具有不大于10nM的50％抑制浓度。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的适配体，所述适配体不结合NT-3。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的适配体，所述适配体不抑制BDNF、NT-3或NT-4/5的细胞增殖活性。

[7]根据[1]或[2]所述的适配体，所述适配体包含下述核苷酸序列(a)、(b)和(c)中的任一种：

(a)选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)；

(b)选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)，其中置换、缺失、插入或添加1至数个核苷酸；和

(c)与选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70％以上的同一性的核苷酸序列。

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的适配体，其中至少一个核苷酸被修饰。

[9]根据[8]所述的适配体，所述适配体用反向dT(inverted dT)或聚乙二醇修饰。

[10]根据[9]所述的适配体，其中所述反向dT或聚乙二醇结合在所述适配体的5’端或3’端。

[11]根据[8]至[10]中任一项所述的适配体，其中在各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

[12]根据[8]至[10]中任一项所述的适配体，其中在各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

[13]一种核酸，所述核酸包含选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列并且具有不超过73的碱基长度。

[14]根据[13]所述的核酸，其中至少一个核苷酸被修饰。

[15]根据[14]所述的核酸，所述核酸用反向dT或聚乙二醇修饰。

[16]根据[15]所述的核酸，其中所述反向dT或聚乙二醇结合在适配体的5’端或3’端。

[17]根据[14]至[16]中任一项所述的核酸，其中在各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

[18]根据[14]至[16]中任一项所述的核酸，其中在各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

[19]一种添加疏水物质的适配体，所述适配体结合NGF。

[20]根据[19]所述的适配体，所述适配体抑制NGF与NGF受体的结合。

[21]根据[20]所述的适配体，所述适配体抑制NGF的神经突伸长活性或细胞增殖活性。

[22]根据[21]所述的适配体，所述适配体具有不大于10nM的50％抑制浓度。

[23]根据[19]或[20]的适配体，所述适配体包含下述核苷酸序列(a’)、(b’)和(c’)中的任一种：

(a’)选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)；

(b’)选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)，其中置换、缺失、插入或添加1至数个核苷酸；和

(c’)与选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70％以上的同一性的核苷酸序列。

[24]根据[19]至[23]中任一项所述的适配体，其中所述疏水物质结合在所述适配体的5’端。

[25]根据[19]至[24]中任一项所述的适配体，其中所述疏水物质是胆固醇。

[26]根据[19]至[25]中任一项所述的适配体，其中至少一个核苷酸被修饰。

[27]根据[26]所述的适配体，所述适配体用反向dT修饰。

[28]根据[27]所述的适配体，其中所述反向dT结合在所述适配体的3’端。

[29]根据[26]至[28]中任一项所述的适配体，其中在各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

[30]根据[26]至[28]中任一项所述的适配体，其中在各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

[31]一种复合物，所述复合物包含根据[1]至[12]、[19]至[30]中任一项所述的适配体或根据[13]至[18]中任一项所述的核酸，和功能物质。

[32]根据[31]所述的复合物，其中所述功能性物质是亲和性物质、标记物质、酶、药物递送载体(drug delivery vehicle)或药物。

[33]一种药物组合物，所述药物组合物包含根据[1]至[12]和[19]至[30]中任一项所述的适配体、根据[13]至[18]中任一项所述的核酸或[31]或[32]的复合物。

[34]一种抗疼痛剂，所述抗疼痛剂包含根据[1]至[12]和[19]至[30]中任一项所述的适配体、根据[13]至[18]中任一项所述的核酸或[31]或[32]的复合物。

[35]一种抗炎剂，所述抗炎剂包含根据[1]至[12]和[19]至[30]中任一项所述的适配体、根据[13]至[18]中任一项所述的核酸或[31]或[32]的复合物。

[36]一种治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的方法，所述方法包括向需要所述方法的受试者施用根据[1]至[12]和[19]至[30]中任一项所述的适配体、根据[13]至[18]中任一项所述的核酸或[31]或[32]的复合物。

[37]根据[1]至[12]和[19]至[30]中任一项所述的适配体、根据[13]至[18]中任一项所述的核酸或[31]或[32]的复合物，其用于预防或治疗伴有疼痛或炎症的疾病。

本发明的效果

本发明的适配体、添加疏水物质的适配体及其复合物可以用作用于疾病诸如疼痛、炎性疾病等的药剂、诊断剂或试剂。本发明的适配体和复合物也可以用于NGF的纯化和浓缩，以及NGF的检测和定量。

附图简述

图1是显示由适配体ID NOs：26，48和57所示的适配体(Apt)与人NGF的结合的传感图。适配体ID：26(-)意指通过向适配体ID：26所示的适配体中引入一个突变(g19→g(M))并且消除结合活性而得到的适配体。

实施方案的说明

本发明提供一种结合NGF的适配体，所述适配体包含由UGAAARAAACC(SEQ ID NO：64)或CGAAMRAAACU(SEQ ID NO：65)所示的序列，并且具有不超过73的碱基长度(以下描述为“本发明的适配体”)。

这些序列可以具有下文提及的修饰。

本发明提供一种具有与NGF结合的活性的适配体。按照一个优选的实施方案，本发明的适配体结合NGF，并且可以通过抑制NGF与NGF受体的结合来抑制NGF的活性。

适配体是指针对特定的靶分子具有结合活性的核酸分子。适配体可以通过与特定的靶分子结合而抑制该特定靶分子的活性。本发明的适配体可以是核酸，如RNA、DNA，修饰的核酸或它们的混合物。本发明的适配体还可以是线性或环形形式的核酸。

换言之，在下文中，本发明的适配体可以表示为“本发明的核酸”。

在本说明书中，由“SEQ ID NO”所示的序列意指每种适配体或核酸的核苷酸序列，例如，“包含由SEQ ID NO：1所示的序列的核酸”意指包含由SEQ ID NO：1所示的序列的天然核酸或修饰的核酸或由两者构成的核酸。每种适配体的SEQ ID NO的碱基序列记述在序列表中。

NGF是已知的神经营养蛋白(neurotrophin)，并且是参与外周和中枢神经元的发育和存活的一种重要的分泌性蛋白。在本发明中，NGF特别地指β型NGF。人β-NGF的氨基酸序列是登记号NP002497、P01138、AAI26151、AAI26149和CAB75625所示的那些，它们也可以是带有突变的氨基酸序列、其结构域或肽。其不仅可以是单体，而且可以是二聚体或多聚体。

本发明的适配体在生理缓冲液(例如，溶液A：参见实施例2)中结合NGF。本发明的适配体例如以通过下列测试可检测到的强度结合NGF。

对于测量，使用由BIAcore制造的BIAcore2000。适配体固定在传感器芯片(sensorchip)上。待固定的量设定为1000RU。含0.3M NaCl的生理缓冲液(溶液A：参见实施例2)用来制备NGF溶液(0.5μM)。注入此NGF溶液(20μL)并检测NGF与该适配体的结合。使用含有由40个核苷酸组成的随机核苷酸的RNA作为阴性对照，当与对照RNA相比NGF显著强地结合该适配体时，该适配体被评价为具有针对NGF的结合性(bindability)。

本发明的适配体通过结合NGF和抑制NGF与NGF受体的结合来抑制NGF的活性。在本说明书中，“针对NGF的抑制活性”是指对NGF具有的任何活性的抑制能力。例如，其是指抑制NGF与NGF受体结合的活性。

另外，其他“针对NGF的抑制活性”的实例包括抑制NGF受体下游中的信号转导(Ras-MAP激酶途径，PI3激酶途径)，抑制TRPV1、SP、BDNF等的表达增加，对从肥大细胞等释放的HA、BK、PG、NGF和其他细胞因子的表达的抑制活性，等等，它们由NGF与NGF受体的结合所导致。

此外，可以提及对NGF诱导的神经细胞的分化、存活、神经突伸长，血管通透性，T细胞和B细胞的免疫应答的增强，淋巴细胞的分化，多种细胞诸如肥大细胞、红白血病细胞、癌细胞等的生长等的抑制，疼痛、痛觉过敏的减轻等。

本发明的适配体所具有的优选“针对NGF的抑制活性”为抑制NGF与NGF受体结合的活性、抑制由NGF诱导的神经突伸长活性的活性、抑制由NGF诱导的细胞增殖活性的活性等。

在本说明书中，“NGF受体”是指NGF所结合的细胞表面蛋白。作为NGF受体，已知有TrkA和p75。本发明中提到的NGF受体可以是含有天然氨基酸序列的蛋白或其变体。在此，“其变体”是指其中“NGF受体”的氨基酸序列的数个氨基酸已经被置换的蛋白或肽或其部分氨基酸序列，其具有针对NGF的结合活性并且抑制NGF与NGF受体的结合。

本发明的适配体结合NGF并抑制NGF与NGF受体的结合。例如，可以通过下列测试来评价适配体是否抑制NGF与NGF受体的结合。

对于测量，使用由BIAcore制造的BIAcore2000。在CM5传感器芯片上固定有NGF受体和Fc的融合蛋白(例如，Trk A-Fc(175-TK，R&D系统(R&D systems)))或p75-Fc(R&D系统))。待固定的量为500-700RU。NGF(0.1μM)和适配体(0.2μM)混合在生理缓冲液(溶液A：参见下文提及的实施例2)中，并且用30min来制备将用作样品的混合物制备。将该混合物注入BIAcore2000中，并且检测NGF与NGF受体的结合。

当抑制活性(％)不小于90％时，适配体被评价为抑制NGF与NGF受体的结合。抑制活性(％)以NGF与NGF受体的结合量计算，不含适配体为0，注入无NGF的溶液的结合量为100。在此，结合量是指在BIAcore的传感图的峰顶处的RU值(NGF注入结束后的即时RU值)。

在一个实施方案中，本发明的适配体可以抑制NGF与TrkA以及NGF和p75两者的结合。

本发明的适配体可以显示针对来源于任何哺乳动物的NGF的抑制活性。这样的哺乳动物包括灵长类动物(例如，人、猴子)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠和豚鼠)、以及伴侣动物(companion animals)、家畜和劳作动物(working animals)(例如，犬、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。

本发明的适配体没有特别的限制，只要其结合NGF的任意部分并且可以抑制NGF与NGF受体的结合。

本发明的适配体包含由UGAAARAAACC(SEQ ID NO：64)或CGAAMRAAACU(SEQ ID NO：65)所示的序列。SEQ ID NO：65中的M意指腺苷或胞苷，SEQ ID NOs：64和65中的R意指鸟苷或腺苷。作为由SEQ ID NO：64所示的序列，可以UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：66)或UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：67)为例。作为由SEQ ID NO：65所示的序列，可以CGAACAAAACU(SEQ ID NO：68)或CGAAAGAAACU(SEQID NO：69)为例。

这些序列可以具有下文提及的修饰。

此外，本发明的适配体特征在于具有不超过73的碱基长度。

由于74个核苷酸以上的适配体具有长的链长度，其经常难以作为药物产品应用。换言之，当核苷酸的总数小于73时，适配体的化学合成和大量制备将更容易，并且在成本方面有很大的优势。还认为化学修饰更容易，在机体内的稳定性更高，并且毒性更低。

从药物产品用途的应用的观点来看，本发明的适配体更理想地具有短于73个核苷酸的碱基长度，优选不超过70个核苷酸，更优选不超过50个核苷酸，最优选不超过45个核苷酸。另一方面，当“核酸”区的核苷酸的总数太少时，所述适配体可能不能结合NGF，从而不能抑制NGF与NGF受体的结合。适当的最少的核苷酸数目可以由本领域普通技术人员根据目标适当地确定。

另外，本发明的适配体可以是这样的适配体，即，所述适配体与NGF结合、和/或抑制NGF与NGF受体的结合，由此抑制NGF的神经突伸长活性或细胞增殖活性。可以通过实施例3所述的测试评价本发明的适配体是否能够抑制NGF的神经突伸长活性。另外，可以通过实施例4所述的测试评价本发明的适配体是否能够抑制NGF的细胞增殖活性。

NGF的神经突伸长活性或NGF的细胞增殖活性为50％时的本发明的适配体的浓度(IC50；50％抑制浓度)优选不超过10nM，更优选不超过1nM。

本发明的适配体中包含的各个核苷酸是相同的或不同的，并且可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖、嘌呤核苷酸的核糖)的2’-位处包含羟基的核苷酸(即，未取代的核苷酸)或其中在核糖的2’-位处的羟基被任何原子或基团替换的核苷酸。作为任何这样的原子或基团的实例，可以提及用氢原子、氟原子或-O-烷基基团(例如，-O-Me基团)、-O-酰基基团(例如，-O-CHO基团)、或氨基基团(例如，-NH₂基团)取代的核苷酸。在下述情形中，在核糖的2’-位处，羟基分别被氢原子、氟原子或-O-Me基团取代。

本发明的适配体也可以是这样的核苷酸，其中至少一种类型的(例如，1、2、3或4种类型)核苷酸在核糖的2’-位处包含羟基、或上述任意原子或基团，例如，选自由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基团组成的组的至少两种(例如2、3或4种)基团。

此外，在本发明的适配体中，所有的嘧啶核苷酸是相同的或不同的，并且每种均可以是在核糖的2’-位处被氟原子取代的核苷酸，或在核糖的2’-位处被上文提及的任意原子或基团取代、优选被选自由氢原子、羟基和甲氧基组成的组的原子或基团取代的核苷酸。

此外，在本发明的适配体中，所有的嘌呤核苷酸是相同的或不同的，并且每种均可以是在核糖的2’-位处被羟基取代的核苷酸，或被上文提及的任意原子或基团取代、优选被选自由氢原子、甲氧基和氟原子组成的组的原子或基团取代的核苷酸。

此外，在本发明的适配体中，所有的核苷酸在核糖的2’-位处包含羟基，或上文提及的任意原子或基团，例如，通过由氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基团组成的组选择的相同基团。

在本说明书中，在描述如何修饰核苷酸中的糖基时，假设构成适配体的核苷酸是RNAs(即，假设糖基是核糖)。然而，这不意味着DNA被排除在构成适配体的核苷酸之外，并且RNA的修饰应该被理解为在适当时对DNA的修饰。例如，当构成适配体的核苷酸是DNA时，在核糖的2’-位处羟基被X取代应该被理解为在脱氧核糖的2’-位处的一个氢原子被X取代。

当在本发明的适配体中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代时，可以提高所述适配体的NGF-结合活性、NGF-NGF受体结合抑制活性、NGF神经突伸长抑制活性、NGF细胞增殖抑制活性、稳定性、药物递送性和在血液中的稳定性等。

备选地，本发明的适配体特征在于不具有针对神经营养蛋白3(以下表示为NT-3)的结合活性。此处，不具有针对NT-3的结合活性意指在各种结合测定中每种蛋白与本发明的适配体的结合在检测界限以下。具体地，其意指，例如，在可以通过实施例7所述的方法测量的表面等离子共振传感图中不能得到响应。

备选地，本发明的适配体特征在于不抑制除NGF之外的神经营养蛋白的细胞增殖活性，所述除NGF之外的神经营养蛋白具体为脑源性神经营养因子(以下表示为BDNF)，NT-3和神经营养蛋白4/5(以下表示为NT-4/5)。此处，适配体是否抑制其他神经营养蛋白(BDNF，NT-3，NT-4/5)的细胞增殖活性可以通过实施例7所述的测试进行评价。不抑制BDNF、NT-3或NT-4/5的细胞增殖活性意指，例如，对于BDNF和NT-3，抑制每种神经营养蛋白的50％细胞增殖所需要的本发明的适配体的浓度(IC50；50％抑制浓度)不小于100nM，优选不小于300nM，更优选不小于1000nM，并且对于NT-4/5不小于100nM，优选不小于300nM。

本发明的适配体的一个更优选的实施方案是不抑制BDNF、NT-3和NT-4/5的细胞增殖活性的适配体。

在本说明书中，术语BDNF、NT-3和NT-4/5分别意指包括人的所有哺乳动物物种的BDNF、NT-3和NT-4/5。

本发明的适配体还可以是：

(a)包含选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体；

(b)包含选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的适配体，其中置换、缺失、插入或添加1至数个核苷酸；

(c)包含与选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70％以上(优选80％以上，更有选90％以上，最优选95％以上)的同一性的核苷酸序列的适配体；或

(d)缀合物，其选自由多个上述适配体(a)的缀合物、多个上述适配体(b)的缀合物、多个上述适配体(c)的缀合物，和多个上述适配体(a)、(b)和(c)的缀合物组成的组。

上面提及的(b)-(d)的适配体能够结合NGF和/或抑制NGF的活性(NGF受体结合活性等)。

另外，优选地，上面提及的(b)-(d)的适配体结合NGF并抑制NGF与NGF受体的结合，和/或结合NGF，并抑制NGF的神经突伸长活性或细胞增殖活性。

更优选，上面提及的(b)-(d)的适配体显示不大于10nM、更优选不大于1nM的NGF神经突伸长或细胞增殖活性抑制浓度。

在上述(b)中，置换、缺失、插入或添加的核苷酸数目没有特别限制，只要所述适配体结合NGF，并且可以抑制NGF的活性(NGF受体结合活性等)，并且只要适配体本身的核苷酸数目不超过73。其可以是，例如，不多于约30个，优选不多于约20个，更优选不多于约10个，更优选不多于5个，最优选为4、3、2或1个。

关于上述(c)中，“同一性”是指在使用本技术领域中公知的数学算法(优选该算法考虑在一个或两个序列上引入空位以获得最佳比对)对两个核苷酸序列进行比对的最优比对中，相同核苷酸残基对所有叠合的核苷酸残基的比率(％)。

核苷酸序列同一性可以通过，例如，使用同源性计算算法NCBIBLAST-2(国立生物技术信息中心基础局部比对搜索工具中心(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))在下列的条件下(空位开放(gap open)＝5个罚分；空位延伸(gap extension)＝2个罚分；x_dropoff＝50；预期值(expectation value)＝10；过滤(filtering)＝ON)比对两个核苷酸序列来计算。

在上述(d)中，缀合可以通过串联结合获得。在缀合过程中，可以使用接头。作为接头，可以提及核苷酸链(例如，1至约20个核苷酸)和非-核苷酸链(例如，-(CH₂)_n-接头，-(CH₂CH₂O)_n-接头，六甘醇(hexaethyleneglycol)接头，TEG接头，包含肽的接头，包含-S-S-键的接头，包含-CONH-键的接头，包含-OPO₃-键的接头)。对在上述多个其的缀合物中提及的多个(plurality)没有特别限制，只要它是两个或更多个，并且所述多个可以是，例如，2、3、或4个。在上述(a)-(d)中的每个核苷酸，不管是相同的还是不同的，可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)的2’-位处包括羟基的核苷酸，或是在核糖的2’-位处羟基被任意基团(例如，氢原子、氟原子或-O-Me基团)取代的核苷酸。

本发明的适配体可以是其中每个核苷酸的糖残基(例如，核糖)已经被修饰以增加NGF结合活性、NGF-NGF受体结合抑制活性、NGF神经突伸长抑制活性、NGF细胞增殖抑制活性、稳定性、药物递送性和适配体在血液中的稳定性等的适配体。糖残基中的修饰的实例包括糖残基的2’-位、3’-位和/或4’-位处的氧原子被另一个原子取代，等。关于修饰作用的种类，可以提及氟化作用、O-烷基化(例如，O-甲基化，O-乙基化)，O-芳基化，S-烷基化(例如，S-甲基化，S-乙基化)，S-芳基化和胺化(例如，-NH₂)。此外，其实例包括4’-SRNA，其中4’-位的氧被硫取代，包括LNA，其中2’-位和4’-位通过亚甲基交联(锁定核酸)。3’-N-氨基磷酸酯核酸，其中3’-位羟基被氨基取代等。在糖残基中的这种改变可以通过本身已知的方法进行(参见，例如，Sproat等，(1991)Nucl.Acid.Res.(核酸研究)19，733-738；Cotton等，(1991)Nucl.Acid.Res.(核酸研究)19，2629-2635；Hobbs等，(1973)Biochemistry(生物化学)12，5138-5145)。

本发明的适配体还可以具有改变(例如，化学取代)的核酸碱基(例如，嘌呤或嘧啶)，以增加NGF结合活性、NGF-NGF受体结合抑制活性、NGF神经突伸长抑制活性、NGF细胞增殖抑制活性、稳定性、药物递送性和适配体在血液中的稳定性等。作为这样的改变的实例，可以提及5-位处的嘧啶改变，6-和/或8-位处的嘌呤改变(O-甲基修饰等)，用环外胺(extracyclic amine)改变、用4-硫尿苷取代、和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。可以改变包含在本发明的适配体中的磷酸基团，从而赋予针对核酸酶和水解的抗性。例如，适配体的磷酸区可以用下述各项取代：P(O)S(硫代(thioate))，P(S)S(二硫代(dithioate))，P(O)NR₂(酰胺化)，P(O)R，R(O)OR’，CO或CH₂(formacetal)，P(O)BH₃(boranophosphate)或3’-胺(-NH-CH₂-CH₂-)[其中R或R’的每个单元独立地是H，或是取代的或未取代的烷基(例如，甲基，乙基)]。

连接基团是，例如，-O-，-N-或-S-，并且核苷酸可以通过这些连接基团与相邻的核苷酸结合。

所述改变还可以包括如在3’和5’加帽的改变。

改变还可以通过在末端添加下列各项而进行：聚乙二醇(以下有时表述为“PEG”)、氨基酸、肽、反向dT、肉豆蔻酰基、石胆酸(Lithocolic)-油基、二十二烷基、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰(linoleoyl)、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光性物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质、生物素等。对于这样的改变，参见，例如，美国专利5,660,985和5,756,703。

特别地，当改变通过末端添加PEG进行时，PEG的分子量没有特别限制，并且优选是1000-100000，更优选30000-90000。PEG可以是线性的或分支成两个以上的链(多臂PEG)。

所述PEG没有特别限制，并且本领域普通技术人员可以适当地选择并且使用商购的或已知的PEG(例如，http://www.peg-drug.com/peg_product/branched.html)。特别优选的应用到本发明的适配体上的PEG的实例包括分子量为40000的2-分支的GS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS2，由NOF CORPORATION制造)、分子量为40000的2-分支的TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400TS，由NOFCORPORATION制造)、分子量为40000的4-分支的TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS，由NOF CORPORATION制造)、分子量为80000的2-分支的TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS，由NOFCORPORATION制造)、分子量为80000的4-分支的TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS，由NOF CORPORATION制造)等。

在这种情形中，在本发明的适配体中，PEG可以直接添加到末端。更优选地是，将具有可与PEG结合的基团等的接头添加到其末端，并且将PEG通过该接头添加到本发明的适配体上。

用于PEG和本发明的适配体的接头没有特别限制，并且碳链数、官能团等可以根据结合位点、PEG类型等进行适当选择。这样的接头的实例包括具有氨基的接头。具体地，当添加到5’端时，可以提及ssH接头(SAFC)或DMS(O)MT-AMINO-MODIFIER(GLENRESERCH)，并且当添加到3’端时，可以提及TFA氨基C-6lcaa CPG(ChemGenes)等。当选择这种接头时，例如，在PEG上添加N-羟基琥珀酰亚胺的活性基团，并且与接头一侧的氨基反应，由此本发明的适配体可以通过该接头与PEG结合。

作为PEG和接头，可以优选地使用商购产品。与PEG、接头和本发明的适配体结合相关的反应条件等可以由本领域普通技术人员适当确定。

可以通过本文公开和本领域本身已知的方法化学合成本发明的适配体。适配体以宽泛种类的结合方式与靶分子结合，诸如基于磷酸基团负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键、基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用(stacking interaction)。特别地，基于磷酸基团负电荷的离子键很强，并且与在蛋白表面上存在的赖氨酸和精氨酸的正电荷结合，所述磷酸基团以与组成核苷酸的数目相同的数目存在。由于这种原因，不参与与靶物质直接结合的核酸碱基可以被取代。特别地，因为茎(stem)结构区已经形成碱基对，并且朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱基不太可能直接与靶物质结合。因此，即使当用另一碱基对取代碱基对时，适配体的活性通常不降低。在其中不形成碱基对的结构中，诸如环结构中，如果所述核酸碱基不参与与靶分子直接结合，则碱基取代是可能的。关于核糖2’-位的修饰，在核糖2’-位的官能团偶尔与靶分子直接相互作用，但是在许多情形中，它是不相关的，并且可以被另一种修饰的分子取代。因此，除非参与与靶分子直接结合的官能团被取代或删除，适配体通常保留其活性。整体三维结构基本上没有改变也是重要的。

适配体可以利用SELEX方法或其改进形式(例如，Ellington等，(1990)Nature(自然)，346，818-822；Tuerk等，(1990)Science(科学)，249，505-510)制备。在SELEX方法中，通过增加轮数或使用竞争物质，浓缩并且选择表现出针对靶分子更强的结合潜力的适配体。因此，通过调整SELEX的轮数，和/或改变竞争性条件，在一些情形中可以获得具有不同结合力的适配体、具有不同结合模式的适配体、和具有相同结合力或结合模式但具有不同碱基序列的适配体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过程；通过在该过程中使用锰离子等引起突变，以更高多样性进行SELEX是可能的。

通过SELEX获得的适配体是表现出针对靶物质的高亲和性的核酸，但这并不意味着与所述靶物质的活性位点的结合。因此，通过SELEX获得的适配体不一定对靶物质的功能起作用。NGF是碱性蛋白，并且被认为可能允许核酸与其非特异性地结合。不结合活性位点的适配体不会影响靶物质的活性。事实上，用于对照的RNA不抑制NGF和NGF受体的结合。

基于由此选择的有活性的适配体，能够在所得到的适配体的序列的基础上进行SELEX从而获得具有更高活性的适配体。具体地，在制备模板后，再次进行SELEX，所述模板中具有确定的序列的适配体被部分随机化或所述模板被掺杂约10-30％随机序列。

通过SELEX获得的适配体具有约80个核苷酸的长度，并且这难以将其原样作为药物制备。因此，有必要重复进行试错(try-and-error efforts)以将适配体缩短为长度约为73个核苷酸或更少从而能够使化学合成变容易，优选70个核苷酸或更少，更优选60个核苷酸或更少，近一步优选50个核苷酸或更少，最优选45个核苷酸或更少。取决于针对通过SELEX获得的适配体的引物设计，随后的最小限度操作的容易性改变。除非成功设计引物，否则即使是通过SELEX选择了具有活性的适配体，随后的发展也将是不可能的。在本发明中，获得了甚至具有43个核苷酸的保留了活性的适配体。

适配体容易被改变，原因在于它们允许化学合成。对于适配体，通过使用MFOLD程序预测二级结构，或通过X-射线分析或NMR分析预测空间结构，可能在某种程度上预测哪个核苷酸可以被置换或删除，和在何处插入新的核苷酸。预测的具有新序列的适配体可以容易地进行化学合成，并且使用现有的测定系统可以确定所述适配体是否保留活性。

如果通过上述重复进行的试错鉴定了对所获得的适配体与靶物质结合重要的区域，则在许多情形中，甚至在向所述序列的两端添加新序列时，活性将保持不变。对新序列的这样的长度没有特别限制。

特别地，前述由UGAAARAAACC(SEQ ID NO：64)和CGAAMRAAACU(SEQ ID NO：65)所示的序列是本发明的适配体与NGF结合并且抑制NGF与NGF受体结合的重要部分。甚至当在这些序列的两端添加新序列时，在许多情形中，活性保持不变。这些序列可以具有前述修饰。

修饰，如序列一样，提供宽范围的设计或变化。

如上文阐述，适配体允许宽范围的设计或变化。本发明还提供适配体的制备方法，其允许对包括指定序列(例如，与选自茎区、内环区、发夹环区和单链区的部分相对应的序列；以下，在需要时简称为固定序列)的适配体进行宽范围的设计或变化。

例如，所述适配体的制备方法包括通过使用单种类型的核酸分子或多种类型的核酸分子(例如，具有不同数目a、b等的核酸分子文库)和分别对应于引物序列(i)和(ii)的引物对制备包含固定序列的适配体，所述种类型的核酸分子由下式所示的核苷酸序列组成：

[其中(N)a表示由“a”单位个N组成的核苷酸链；(N)b表示由“b”单位个N组成的核苷酸链；每单位的N，不管是相同的还是不同的，是选自由A，G，C，U和T(优选地，A，G，C和U)组成的组的核苷酸。“a”和“b”的每个，不管是相同的还是不同的，可以是任意的数目，并且可以是，例如，1-约100，优选为1-约50，更优选为1-约30，还更优选为1-约20或1-约10]。

本发明的适配体优选是与NGF结合的适配体，特征在于包含SEQ IDNO：26所示的序列，并且具有不超过73的碱基长度。

SEQ ID NO：26所示的序列是对于本发明的适配体作为本发明的适配体行使功能如结合NGF、抑制NGF与NGF受体的结合等重要的区域。甚至当在该序列的两端添加新的序列时，本发明的适配体的功能也不被消弱。该序列可以进行前述糖残基的修饰、核酸碱基和磷酸基团的改变等。

因此，本发明的适配体的优选具体实例包括这样的适配体，所述适配体包含由SEQ ID NO：26所示的序列，具有不超过73的碱基长度，并且与NGF结合，所述适配体是：

(i)包含至少一种类型的核苷酸的适配体，其中在核糖2’-位处的羟基被氢原子、氟原子、O-烷基、O-酰基或氨基取代；

(ii)其中在末端添加了PEG、氨基酸、肽、反向dT、肉豆蔻酰基、石胆酸-油基、二十二烷基、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、染料、荧光性物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质或生物素的适配体；

(iii)满足(i)和(ii)的要求的适配体；

等等。

本发明还提供添加疏水物质的与NGF结合的适配体(以下表示为“本发明的添加疏水物质的适配体”)。

在本说明书中，所述添加疏水物质的适配体是结合了疏水物质的适配体。即，本发明的添加了疏水物质的适配体是这样的物质，其中“适配体”区和“疏水物质”区结合。“适配体”区和“疏水物质”区可以通过“接头”区结合。

本发明的添加疏水物质的适配体的“适配体”区如之前关于“本发明的适配体”所解释那样。因此，组成适配体区的核苷酸的种类没有特别的限制，只要所述添加疏水物质的适配体与NGF结合即可。即，只要满足之前的条件，其可以是本身已知的任何核苷酸，如DNA、RNA等、修饰的核酸及其混合物、和双链或单链的核苷酸。另外，核苷酸序列本身没有特别限制。除非特别指明，前文提及的“修饰的核酸”是指下文所示的“在可取代的位置取代(修饰)的核苷酸”。

备选地，本发明的添加疏水物质的适配体可以是与NGF结合从而抑制NGF与NGF受体结合的添加疏水物质的适配体。本发明的添加疏水物质的适配体是否抑制NGF与NGF受体结合可以通过上文在“本发明的适配体”中的测试或实施例2所述的测试来评价。

本发明的添加疏水物质的适配体可以是与NGF结合从而抑制NGF的神经突伸长活性或NGF的细胞增殖活性的添加疏水物质的适配体。本发明的添加疏水物质的适配体是否抑制NGF的神经突伸长活性可以通过上文在“本发明的适配体”中的测试或实施例3所述的测试来评价。本发明的添加疏水物质的适体是否抑制NGF的细胞增殖活性可以通过上文在“本发明的适体”中的测试或实施例4所述的测试来评价。

本发明的添加疏水物质的适配体在NGF的神经突伸长活性或NGF的细胞增殖活性为50％时的浓度(IC50；50％抑制浓度)优选不超过10nM，更优选不超过3nM。

如同本发明的适配体，本发明的添加疏水物质的适配体中包含的核苷酸可以是在核糖的2’-位包含羟基的核苷酸(即，未取代的核苷酸)或其中在核糖2’-位的羟基被任何原子或基团取代的核苷酸。任何所述原子或基团的实例包括与关于本发明的适配体所引用的那些类似的原子和基团。

尽管本发明的添加疏水物质的适配体的“适配体”区的碱基长度没有特别限制，只要所述添加疏水物质的适配体结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合即可，其理想地不超过73个核苷酸(当5’端或3’端用反向dT修饰时，这不计算为碱基长度)。

由于74个核苷酸以上的添加疏水物质的适配体具有长的链长度，其通常难以作为药用产品应用。换言之，当核苷酸的总数小于73时，适配体的化学合成和大量制备将更容易，并且在成本方面有很大的优势。还认为化学修饰更容易，在机体内的稳定性更高，并且毒性更低。

从药物产品用途的应用的观点来看，本发明的添加疏水物质的适配体更理想地具有短于73个核苷酸的碱基长度，优选不超过70个核苷酸，更优选不超过50个核苷酸，最优选不超过45个核苷酸。另一方面，当“核酸”区的核苷酸的总数太少时，所述适配体可能不能结合NGF，从而不能抑制NGF与NGF受体的结合。适当的最少的核苷酸数目可以由本领域普通技术人员根据目标适当地确定。

组成“适配体”区的核苷酸可以在任意可取代的位置以任意方式取代(修饰)，只要所述添加疏水物质的适配体结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合。其可以完全没有取代(修饰)的核苷酸。当被取代(修饰)时，“可取代的位置”对于本领域普通技术人员是清楚的，并且他们可以选择本身已知的取代基。

在组成“适配体”区的核苷酸中，在可取代的位置取代(修饰)的核苷酸(在本说明书中有时表示为修饰的核酸)优选是这样的核苷酸：其中核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)2’-位是羟基的核苷酸(即，未取代的核苷酸)，或其中在核糖2’-位的羟基被相同的或不同的任意原子或取代基取代的核苷酸。

上文提及的原子或取代基的实例包括氢原子、卤素原子(例如，氟原子)、O-烷基基团(例如，-O-Me基团)、O-酰基基团(例如，-O-CHO基团)、氨基基团(例如，-NH₂基团)等。

在本说明书中，组成添加疏水物质的适配体的核苷酸假定是RNAs(即，假定糖基是核糖)，以描述怎样修饰核苷酸中的糖基。然而，这不意味着从组成添加疏水物质的适配体的核苷酸中排除DNA，并且RNA的修饰在适当时应该理解为DNA的修饰。例如，当组成适配体的核苷酸是DNA时，在核糖2’-位的羟基被取代为X应该理解为在脱氧核糖2’-位的一个氢原子被取代为X。

当在本发明的添加疏水物质的适配体中尿嘧啶被胸腺嘧啶取代时，可以提高所述适配体的NGF-结合活性、NGF-NGF受体结合抑制活性、NGF神经突伸长抑制活性、NGF细胞增殖抑制活性、稳定性、药物递送性和在血液中的稳定性等。

本发明的添加疏水物质的适配体可以是：

(a)包含选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的添加疏水物质的适配体；

(b)包含选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)的添加疏水物质的适配体，其中置换、缺失、插入或添加1至数个核苷酸；

(c)包含与选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70％以上(优选80％以上，更有选90％以上，最优选95％以上)的同一性的核苷酸序列的添加疏水物质的适配体；或

(d)缀合物，其选自由多个上述适配体(a’)的缀合物、多个上述适配体(b’)的缀合物、多个上述适配体(c’)的缀合物，和多个上述适配体(a’)、(b’)和(c’)的缀合物组成的组。

上面提及的(b’)-(d’)的适配体或缀合物可以结合NGF和/或抑制NGF的活性(NGF受体结合活性等)。

另外，优选地，上面提及的(b’)-(d’)的适配体或缀合物结合NGF并抑制NGF与NGF受体的结合，和/或结合NGF，并抑制NGF的神经突伸长活性。

更优选，上面提及的(b’)-(d’)的适配体或缀合物显示不大于10nM、更优选不大于3nM的NGF神经突伸长或细胞增殖活性抑制浓度。

在上述(b’)中，置换、缺失、插入或添加的核苷酸数目没有特别限制，只要所述适配体结合NGF，并且可以抑制NGF的活性(NGF受体结合活性等)，并且只要适配体本身的核苷酸数目不超过73。其可以是，例如，不多于约30个，优选不多于约20个，更优选不多于约10个，更优选不多于5个，最优选为4、3、2或1个。

在上述(d’)中，缀合可以通过串联结合获得。在缀合过程中，可以使用接头。作为接头，可以提及核苷酸链(例如，1至约20个核苷酸)和非-核苷酸链(例如，-(CH₂)_n-接头，-(CH₂CH₂O)_n-接头，六甘醇接头，TEG接头，包含肽的接头，包含-S-S-键的接头，包含-CONH-键的接头，包含-OPO₃-键的接头)。对在上述多个其的缀合物中提及的多个没有特别限制，只要它是两个或更多个，并且所述多个可以是，例如，2、3或4个。在上述(a’)-(d’)中的每个核苷酸，不管是相同的还是不同的，可以是在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)的2’-位处包括羟基的核苷酸，或是在核糖的2’-位处的羟基被任意基团(例如，氢原子、氟原子或-O-Me基团)取代的核苷酸。

在本发明的添加疏水物质的适配体中，“糖残基”区、“核酸碱基”区和“磷酸基团”区、以及其取代(修饰)、改变等与关于本发明的适配体所解释的那些相似。

在本发明的添加疏水物质的适配体中，改变可以进一步通过在末端添加PEG、氨基酸、肽、反向dT、肉豆蔻酰基、石胆酸-油基、二十二烷基、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光性物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质、生物素等进行。上文提及的改变可以以关于本发明的适配体相同的方式处理。

组成本发明的添加疏水物质的适配体的“疏水物质”区的物质可以在任意可取代的位置以任意方式被取代(修饰)，只要所述添加疏水物质的适配体结合NGF并且抑制NGF与NGF受体的结合。“可取代的位置”对于本领域普通技术人员是清楚的，并且他们可以选择本身已知的取代基。

当这样的“疏水物质”结合到适配体上，可以提高所述适配体的NGF-结合活性、NGF-NGF受体结合抑制活性、NGF神经突伸长抑制活性、NGF细胞增殖抑制活性、稳定性、药物递送性和在血液中的稳定性等。

在本说明书中，作为所述“疏水物质”，特别可以提及下文提及的类固醇和维生素，可以优选地提及类固醇，并且可以更优选地提及胆固醇。

在本说明书中，“类固醇”意指具有环戊烷并菲(cyclopentaphenanthrene)骨架或具有由其作为基本骨架的环结合的分裂、环扩展和环缩小的一种或多种导致的骨架的化合物，其中其全部或部分被氢化。作为类固醇，特别可以提及毒毛旋花子苷原(strophanthidin)、胆固醇、类固醇激素(睾酮、雌二醇、孕酮、皮质醇、可的松、醛固酮、皮质酮、去氧皮质酮等)等。它们可以是已知的维生素、具体为维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等。

在本说明书中，“类固醇”意指其中在类固醇的环戊烷并菲骨架中的环A的C-3位被羟基化或羰基化(carbonylated)的化合物。作为类固醇，特别可以提及类固醇激素、菜油甾醇(campesterol)、谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、麦角固醇(ergosterol)等。

在本说明书中，“胆固醇”意指动物来源的固醇，其不仅包括胆固醇还包括氢化胆固醇以及通过酯反应衍生的固醇。作为这样的胆固醇衍生物，可以提及氢化二氢胆固醇、以及与低级或高级脂肪酸的酯。羟基硬脂酸胆甾醇酯(Cholesteryl hydroxystearate)、油酸胆甾醇酯、异硬脂酸胆甾醇酯、羊毛脂酸胆甾醇酯(cholesteryl lanolate)、澳洲坚果油酸胆甾醇酯(cholesteryl macadamiate)、壬酸胆甾醇酯、硬脂酸胆甾醇酯、丁酸胆甾醇酯等是可商购的。

本发明的添加疏水物质的适配体可以具有直接与“疏水物质”区结合的“适配体”区，或通过“接头”区与“疏水物质”区结合的“适配体”区。本领域普通技术人员可以通过已知的方法将“适配体”区与“疏水物质”区结合。

在本发明的添加疏水物质的适配体中，能够使“适配体”区与“疏水物质”区结合的“接头”区没有特别限制，只要添加疏水物质的适配体可以结合NGF并且抑制NGF与NGF受体结合即可，并且本领域普通技术人员可以适当地确定这样的接头。

这样的接头的实例包括饱和的烃链(例如，具有12个碳原子数的饱和烃链)、核苷酸链(例如，1至约20个核苷酸)、非-核苷酸链(例如，-(CH₂)_n-接头)，包含肽的接头(例如，-Gly-Cys-)，包含-S-S-键的接头(例如，-(CH₂)_m-S-S-(CH₂)_n-)，包含-CONH-键的接头(例如，-(CH₂)_m-CONH-(CH₂)_n-，-O-CO-NH-(CH₂)_n-)，包含-OPO₃-键的接头(例如，-(CH₂)_m-O-PO₂-O-(CH₂)_n-)，聚乙二醇接头(例如，六甘醇接头))等(每个接头中的m和n意指整数)。

上文提及的接头区可以是分支的和添加有官能分子如二甲氧基三苯甲基基团(DMT)、荧光物质等(在一些情形中，最后去除这些官能分子)。此外，所述分子可以是被酶如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)、和因子X识别且切割的肽，并且可以是被核酸酶或限制型内切核酸酶切割的多核苷酸。

上文提及的“饱和烃链”的实例包括具有3，6，12，18或24个碳原子的那些。其也可以是分支的。

作为上文提及的“核苷酸链”，可以提及在核糖(例如，嘧啶核苷酸的核糖)2’-位包含羟基的核苷酸，或其中在核糖2’-位的羟基被任意基团(例如，氢原子、氟原子或-O-Me基团)取代(修饰)的核苷酸。

“接头”区与“疏水物质”区的结合没有特别限制，并且这两个区域可以通过本领域普通技术人员已知的方法结合。

另外，“接头”区和“适配体”区的结合也没有特别限制，并且这两个区域可以通过本领域普通技术人员已知的方法结合。

本发明的添加疏水物质的适配体的“接头”区和“疏水物质”区可以结合在“适配体”区的5’端或3’端。其还可以结合在“适配体”区的5’端和3’端两端。其还可以结合在“适配体”区序列中的核酸碱基或核糖或磷酸区上。

本发明的添加疏水物质的适配体的“适配体”区可以通过以与前述制备本发明的适配体的方法相似的方法制备。本发明的添加疏水物质的适配体可以通过本领域本身已知的方法化学合成。例如，可以通过使用商购的胆固醇TEG亚磷酰胺(由Glen Research制造)将胆固醇添加到合成的适配体的5’端。在这些情形中，还可以通过同时使用商购的amidite Spacerl8(由Glen Research制造)等在适配体和胆固醇之间添加任意接头。

另外，使用商购的3’-胆固醇TEG-CPG(由Glen Research制造)，可以将胆固醇添加到适配体的3’端。以与上述相同的方式，还可以通过同时使用商购的amidite Spacer18(由Glen Research制造)等在适配体和胆固醇之间添加任意接头。

使用类似的方法，还可以将胆固醇添加到序列中的核酸碱基或核糖或磷酸区。

此外，当氨基基团添加在末端或适配体中时，可以在使用合成仪合成核酸后通过偶联反应添加胆固醇。

为了在适配体的5’端添加氨基基团，可以使用商购的5’-氨基改性剂C6-TFA(由Glen Research制造)等。

为了在适配体的3’端添加氨基基团，可以使用商购的3’-氨基改性剂C7-CPG(由Glen Research制造)等。

可以通过利用在核酸碱基中的氨基基团，或者通过向嘧啶的5-位、嘌呤的6-位等引入氨基基团将胆固醇添加到适配体中。此外，氨基基团可以引入到核糖的2’-位或磷酸区。

胆固醇与氨基基团的偶联反应可以通过给胆固醇添加活性基团而容易地进行。结果，可以制备本发明的添加疏水物质的适配体。

本发明还提供包括本发明的适配体(以下包括添加疏水物质的适配体)和与其结合的功能物质的复合物。本发明的复合物中适配体和功能物质之间的键可以是共价键或非共价键。本发明的复合物可以是这样一种复合物，即，其中本发明的适配体和一种或多种(例如，2或3种)相同类型或不同类型的功能物质结合在一起。对所述功能物质没有特别限制，只要它新赋予本发明的适配体某种功能，或能够改变(例如，提高)本发明的适配体可以具有的某种特征。作为功能物质的实例，可以提及蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。作为功能物质的实例，可以提及下列各项：亲和物质(例如，生物素、链霉抗生物素、具有针对靶互补序列的亲和性的多核苷酸、抗体、谷胱甘肽琼脂糖、组氨酸)，标记物质(例如，荧光物质，发光物质，放射性同位素)，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，药物递送载体(例如，脂质体，微球体，肽，聚乙二醇)，药物(例如，在定向破坏治疗(missile therapy)中使用的那些，如刺孢霉素(calicheamycin)和多卡米星(duocarmycin)；氮芥类似物如环磷酰胺(cyclophosphamide)，美法仑(melphalan)，异环磷酰胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)；氮丙啶(ethylenimines)如塞替派(thiotepa)；亚硝基脲(nitrosoureas)如卡莫司汀(carmustine)；烷化剂如替莫唑胺(temozolomide)或达卡巴嗪(dacarbazine)；叶酸样代谢拮抗剂如甲氨蝶呤(methotrexate)或雷替曲塞(raltitrexed)；嘌呤类似物如硫鸟嘌呤(thioguanine)，克拉屈滨(cladribine)或氟达拉滨(fludarabine)；嘧啶类似物如氟尿嘧啶(fluorouracil)，替加氟(tegafur)或吉西他滨(gemcitabine)；长春花生物碱(vinca alkaloids)如长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)以及它们的类似物；鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物如依托泊苷(etoposide)，紫衫烷(taxans)，多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)；蒽环霉素(anthracyclines)如多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)以及它们的类似物；其它细胞毒性抗生素如博来霉素(bleomycin)和丝裂霉素(mitomycin)；铂化合物如顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；喷司他丁(pentostatin)，米替福新(miltefosine)，雌莫司汀(estramustine)，托泊替康(topotecan)，伊立替康(irinotecan)和比卡鲁胺(bicalutamide))，和毒素(例如，蓖麻毒素(ricin toxin)，liatoxin和Vero毒素(Vero toxin))。在一些情形中，最终去除这些功能分子。此外，所述分子可以是能够被酶，如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)，和因子X识别和切割的肽，并且可以是可被核酸酶或限制性核酸内切酶切割的多核苷酸。

本发明的适配体或复合物可以用作，例如，药剂或诊断剂、检测药物、试剂、用于饮用水和食物的添加剂、增强剂和缓和剂。

本发明的适配体和复合物可以通过结合NGF和抑制NGF与NGF受体的结合而具有抑制NGF的功能的活性。如上所述，NGF深入地参与到疼痛和炎症中。因此，本发明的适配体(添加疏水物质的适配体)和复合物能够用作用于预防和治疗伴有疼痛或炎症的疾病的药剂(抗疼痛剂，抗炎剂等)。

在此，疼痛的实例包括伤害性疼痛(nociceptive pain)(肌痛(muscularpain)，背痛(back pain)，上肢痛(upper limb pain)，鞭伤(whiplash injury)，关节痛(arthralgia)，骨关节炎(osteoarthritis)，痛风(gout)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，头痛(headache)，偏头痛(migraineheadache)，紧张性头痛(catatonic headache)，丛集性头痛(clusterheadache)，继发性头痛(secondary headache)，口面疼痛(orofacial pain)，牙痛(toothache)，拔牙后灼性神经痛(causalgia after tooth extraction)，幻觉牙痛(phantom tooth pain)，器官疼痛(organ pain)，心脏疼痛(cardiacpain)，腹痛(abdominal pain)，经间痛(mittelschmerz)，痛经(dysmenorrhea)，产痛(labor pain)，肾痛(nephralgia)，输尿管痛(ureteralgia)，骨痛(ostalgia)等)，炎性痛(inflammatory pain)，神经性疼痛(neuropathic pain)(糖尿病神经病变(diabetic neuropathy)，中毒性神经病(toxic neuropathy)，术后疼痛(pain after operation)，幻肢痛(phantom limb pain)，断片部痛(fragment pain)，反射性交感神经营养障碍(reflex sympathetic dystrophy)，灼性神经痛(causalgia)，疱疹后疼痛(postherpetic pain)，三叉神经痛(trigeminal neuralgia)，中枢性疼痛(central pain))，癌性疼痛(由于癌症浸润进入内脏器官导致的疼痛，由于癌组织浸润血管导致的血管阻塞引起的疼痛，骨转移的疼痛，与脑内转移相关的疼痛，由癌组织浸润外周神经导致的疼痛)，纤维肌痛(fibromyalgia pain)等。

尽管在此与炎症相关的疾病不特别限制，但可以提及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)，多发性硬化(multiple sclerosis)，银屑病(psoriasis)，骨关节炎(osteoarthritis)，类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)，间质性膀胱炎(interstitial cystitis)，哮喘(asthma)等。

尽管上面提及的癌症不特别地限制，但可以提及食道癌(esophaguscancer)，甲状腺癌(thyroid cancer)，膀胱癌(urinary bladder cancer)，结肠直肠癌(colorectal cancer)，胃癌(gastric cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，胸部癌症(thoracic cancer)，肝癌(liver cancer)，肺癌(lungcancer)，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)，乳癌(breast cancer)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，成胶质细胞瘤(glioblastoma)，子宫癌(uterine cancer)，宫颈癌(cervical cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，肾母细胞瘤(Wilms’tumor)，前列腺癌(prostatecancer)等。

当NGF结合其受体TrkA时，其激活TrkA的酪氨酸磷酸化和TrkA下游处的Ras-MAPK，PLC-γ，PI3K等，并且显示生理学作用诸如神经细胞的存活和分化。另一方面，其经p75受体诱导信号途径中的细胞死亡。因此，本发明的适配体和复合物可以用作用于涉及这些信号转导途径的激活的疾病的药剂，诊断剂，检测药物，或试剂。涉及这些信号转导途径的激活的疾病的实例包括上面提及的疼痛、炎性病和癌症。

当本发明的适配体和复合物用作药剂、诊断剂、检测药物、试剂等时，施用所述适配体的受试者不特别限制，并且，例如，可以提及灵长类动物(例如，人、猴子)、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、以及伴侣动物、家畜和劳作动物(例如，犬、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)。

本发明的适配体和复合物能够特异性地结合NGF。因此，本发明的适配体和复合物有效用作用于NGF检测的探针。所述探针有效用于NGF的体内成像、血液浓度的测量、组织染色、ELISA等。所述探针也有效用作用于涉及NGF的疾病(伴有疼痛或炎症的疾病等)的诊断剂、检测药物、试剂等。

基于它们与NGF的特异性结合，本发明的适配体和复合物可以用作用于分离和纯化NGF的配体。

另外，本发明的适配体和复合物可以用作用于检验幻想癖(romance)等的精神病症的检测药物，或用于控制所述精神病症的药剂、调节剂、增强剂或缓和剂。

本发明的适配体和复合物可以用作药物递送载体。

本发明的药物可以是与药用载体配制在一起的药物。作为药用载体的实例，可以提及下列各项：赋形剂如蔗糖，淀粉，甘露醇(mannit)，山梨醇，乳糖，葡萄糖，纤维素，滑石，磷酸钙，和碳酸钙；粘合剂如纤维素，甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚丙基吡咯烷酮，明胶，阿拉伯树胶，聚乙二醇，蔗糖，和淀粉；崩解剂如淀粉，羧甲基纤维素，羟基丙基淀粉，乙二醇钠-淀粉(sodium-glycol-starch)，碳酸氢钠，磷酸钙，和柠檬酸钙；润滑剂如硬脂酸镁，二氧化硅气凝胶(Aerosil)，滑石，和十二烷基硫酸钠；调味剂如柠檬酸，薄荷醇，甘草皂苷-铵盐，甘氨酸，和橙味粉剂；防腐剂如苯甲酸钠，亚硫酸氢钠，对羟基苯甲酸甲酯，和对羟基苯甲酸丙酯；稳定剂如柠檬酸，柠檬酸钠，和乙酸；悬浮剂如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，和硬脂酸铝；分散剂如表面活性剂；稀释剂如水，生理盐水，和橙汁；基质蜡(base waxs)诸如可可脂，聚乙二醇，和煤油；等等，但是这些不是限制性的。

适合口服施用的制剂是通过将有效量的配体溶解在稀释剂如水、生理盐水、或橙汁中而制备的溶液；包括采用固体或颗粒形式的有效量的配体的胶囊、囊剂或片剂；通过将有效量的活性成分悬浮在适当的分散剂中而制备的混悬液；通过在适当的分散剂中分散并且乳化有效量活性成分的溶液而制备的乳状液，等等。

需要时出于掩饰味道、肠内溶解、持续释放等目的，本发明的药物可以通过本身已知的方法进行包被。作为用于包被的包衣剂的实例，使用下列各项：羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚氧乙烯二醇，吐温80，Pluronic F68，醋酸邻苯二甲酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟甲基纤维素乙酸琥珀酸酯，Eudragit(由德国Rohm制造，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)，色素(例如，红色氧化铁，二氧化钛等)等。所述药物可以是快速释放的制剂或持续释放的制剂。持续释放的基质的实例包括脂质体、去端肽胶原(atelocollagen)、明胶、羟磷灰石、PLGA等。

作为适于肠胃外施用(例如，静脉内施用、皮下施用、肌内施用、局部施用、腹膜内施用、鼻内施用、肺部施用等)的制剂，可用水性和非水性等渗无菌注射液，其可以包括抗氧化剂、缓冲溶液、制菌剂、等渗剂等。也可以提及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。制剂可以以单位剂量体积或以数个分开的剂量包含在容器中，如安瓿或小瓶中。活性成分和药用载体也可以是冻干的，并且以这样的状态保存，即，其可以在即将使用前，溶解或悬浮在适当的无菌载体中。持续释放制剂也是合适的制剂。持续释放制剂包括从埋植在体内的载体或容器持续释放，所述载体或容器诸如人工骨，可生物降解的或不可降解的海绵，袋子，药泵，渗透压泵等。用于从体外持续地或间歇地，全身地或局部地递送的装置也包括在持续释放制剂的范围内。可生物降解的基质包括脂质体，阳离子脂质体，聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)，去端肽胶原，明胶，羟磷灰石，多糖西佐喃(polysaccharide sizofiran)。除了注射液和持续释放制剂之外，吸入剂和油膏也是可以接受的。在吸入剂的情形中，将处于冻干状态的活性成分微粉化，并且使用适当的吸入装置通过吸入而施用。当需要时，吸入剂可以适当地用常规使用的表面活性剂、油、调料、环糊精或其衍生物等配制。

在此，作为表面活性剂的实例，可以提及下列各项：油酸，磷脂酰胆碱，二油酸二甘醇酯，油酸四氢糠酯(tetrahydroflufuryl oleate)，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，三油酸甘油酯，单月桂酸甘油酯，单油酸甘油酯，单硬脂酸甘油酯，甘油基monolysinoate，鲸蜡醇，硬脂醇，聚乙二醇400，氯化十六烷基吡啶，三油酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘85)，单油酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘80)，单月桂酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘20)，聚氧乙烯硬化蓖麻油(商标名，HCO-60)，聚氧乙烯(20)单月桂酸失水山梨糖醇酯(商标名，吐温20)，聚氧乙烯(20)单油酸失水山梨糖醇酯(商标名，吐温80)，天然来源的磷脂酰胆碱(商标名，EPICLON)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(oleylpolyoxyethylene(2)ether)(商标名，Brij 92)，硬脂酰聚氧乙烯(2)醚(商标名，Brij 72)，十二烷基聚氧乙烯(4)醚(商标名，Brij 30)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商标名，Genapol 0-020)，氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商标名，Synperonic)等等。作为油的实例，可以提及玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花油等。在油膏的情形中，将适当的药用基质(黄色矿脂，白色矿脂，石蜡，plastibase，硅氧烷，白色油膏，蜂蜡，猪油，植物油，亲水性油膏，亲水性矿脂，纯化的羊毛脂，水解羊毛脂，吸水性油膏，亲水性plastibase，聚二乙醇油膏等)与活性成分掺合，并且用作制剂。

吸入剂可以按照常规方法生产。具体地，吸入剂可以这样生产：通过将上述本发明的适配体和复合体粉末化或液化，将其掺加到吸入推进剂和/或载体中，并且将其填充在适当的吸入容器中。当上述本发明适配体和复合体是粉末时，可以使用普通的机械粉末吸入器；在液体的情形中，可以使用诸如喷雾器的吸入器。此处，作为推进剂，可以广泛使用常规已知的一种推进剂；可以提及下列各项：含氯氟烃-系列化合物，如含氯氟烃-11，含氯氟烃-12，含氯氟烃-21，含氯氟烃-22，含氯氟烃-113，含氯氟烃-114，含氯氟烃-123，含氯氟烃-142c，含氯氟烃-134a，含氯氟烃-227，含氯氟烃-C318，和1，1，1，2-四氟乙烷，烃类如丙烷，异丁烷，和正丁烷，醚如二乙醚，压缩气体如氮气和二氧化碳气体，等等。

本发明药物的剂量取决于活性成分的类型和活性、疾病的严重性、作为施用受试者的动物物种、施用的受试者对药物耐受性、体重、年龄等而变化，并且，基于每天用于成年人的活性成分量，通常的剂量可以是约0.0001-约100mg/kg，例如，约0.0001-约10mg/kg，优选约0.005-约1mg/kg。

本发明还提供将本发明适配体和复合体固定在其上的固相载体。作为所述固相载体的实例，可以提及基底、树脂、平板(例如，多孔平板)、滤器、药筒、柱、和多孔材料。所述基底可以是用在DNA芯片、蛋白质芯片等中的基底；例如，可以提及镍-PTFE(聚四氟乙烯)基底，玻璃基底，磷灰石基底，硅基底，氧化铝基底等，和通过用聚合物等包被这些基底而制备的基底。作为树脂的实例，可以提及下列各项：琼脂糖颗粒，二氧化硅颗粒，丙烯酰胺和N，N’-亚甲基二丙烯酰胺的共聚物，聚苯乙烯-交联的二乙烯基苯颗粒，与表氯醇交联的葡聚糖颗粒，纤维素纤维，芳基葡聚糖和N，N’-亚甲基二丙烯酰胺的交联聚合物，单分散性合成聚合物，单分散性亲水性聚合物，琼脂糖，Toyopearl等，并且还包括通过将各种官能团结合在这些树脂上而制备的树脂。本发明的固相载体可以有效用于，例如，纯化、检测和定量NGF。

本发明的适配体和复合物可以通过本身已知的方法固定在固相载体上。例如，可以提及这样的方法，即，所述方法向本发明的适配体(添加疏水物质的适配体)或复合物中引入亲和物质(例如，上述那些)或预先确定的官能团，并且然后将所述适配体和复合物通过所述亲和物质或预先确定的官能团固定在固相载体上。本发明也提供这样的方法。所述预先确定的官能团可以是可以进行偶联反应的官能团；例如，可以提及氨基基团、硫醇基团、羟基基团、和羧基基团。本发明还提供在其中引入这样的官能团的适配体。

本发明还提供了纯化和浓缩NGF的方法。特别地，本发明使将NGF从其他家族蛋白的蛋白中分离成为可能。本发明的纯化和浓缩方法可以包括将NGF吸附到本发明的固相载体上，并且用洗脱剂洗脱所吸附的NGF。将NGF吸附到本发明的固相载体上可以通过本身已知的方法实现。例如，将含有NGF的样品(例如，细菌或细胞培养物或培养物上清，血液)引入到本发明的固相载体中或引入到包含本发明的固相载体的组合物中。NGF可以使用诸如中性溶液的洗脱剂来洗脱。对所述中性洗脱剂没有限制，其可以具有例如约6-约9、优选约6.5-约8.5、且更优选约7-约8的pH。所述中性溶液还可以包括，例如，尿素、螯合剂(例如，EDTA)、钾盐(例如，KCl)、镁盐(例如，MgCl₂)、表面活性剂(例如，吐温20，Triton，NP40)、和甘油。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括在NGF吸附后用洗涤溶液洗涤所述固相载体。洗涤溶液的实例，包括含有尿素，螯合剂(例如，EDTA)，Tris，酸，碱，转移RNA，DNA，表面活性剂诸如吐温20，盐诸如NaCl等的那些。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括加热所述固相载体。该步骤能使所述固相载体再生和灭菌。

本发明还提供检测和定量NGF的方法。特别地，本发明使与其他家族蛋白的蛋白分开地检测和定量NG F成为可能。本发明的检测和定量方法可以包括通过使用本发明的适配体(例如，使用本发明的复合体和固相载体)测量NGF。检测和定量NGF的方法可以以与免疫学方法相同的方式进行，不同的是用本发明的适配体替代抗体。因此，检测和定量可以通过使用本发明的适配体替代抗体作为探针，以与诸如下列各项的那些方法相同的方式进行：酶免疫测定(EIA)(例如，直接竞争性ELISA，间接竞争性ELISA，夹心ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，荧光免疫测定(FIA)，蛋白质印迹技术，免疫组织化学染色方法，和细胞分选方法。本发明的适配体还可以用作PET等的分子探针。这些方法可以有效用于，例如，测量在活生物体或生物样品中的NGF含量，并且诊断与NGF相关的疾病。

在本文中提及的所有出版物的公开内容，包括专利和专利申请说明书，通过引用以所有这些出版物被明确地给出的程度结合在本发明中。

以下，通过下述实施例更详细地描述本发明，然而，所述实施例并不限制本发明的范围。

实施例1：RNA适配体

(1)RNA适配体的制备

基于在PCT/JP09/066457中记述的由SEQ ID NOs：40，60，62，67和68所述的适配体确定RNA适配体的序列。通过使用转录酶的方法或通过亚磷酰胺法化学合成制备这些RNA适配体。由于长链RNA的化学合成难以进行，因此使用转录酶进行制备。具体而言，通过转录得到适配体IDs：1-25和适配体IDs：27-54所示的适配体，和通过化学合成得到适配体IDs：26，26(1)-(72)，29(1)和适配体IDs：55-63所示的适配体。

通过化学合成产生目标适配体的DNA并且使用DuraScribe(注册商标)T7转录试剂盒(由Epicentre制造)进行转录。通过该方法得到的RNA在嘧啶核苷酸的核糖的2’-位氟化。将转录产物用DNA酶处理，通过苯酚-氯仿处理去除蛋白质，并且通过乙醇沉淀收集RNA。通过聚丙烯酰胺电泳验证回收的适配体的纯度，并且通过吸光度测量法验证量。

化学合成通过亚磷酰胺法进行。通过亚磷酰胺法进行化学合成是通常所用的方法，该方法记述在Nucleic Acid(第2卷)[1]Synthesis and Analysisof Nucleic Acid(核酸的合成和分析)(编辑：Yukio Sugiura，HirokawaPublishing Company(Hirokawa出版公司))等中。实际上，使用由AppliedBiosystems(应用生物系统)等制造的核酸合成仪(ABI394)进行合成，并且通过高效液相色谱法(HPLC)纯化合成的产物。最终合成的物质的纯度通过HPLC确定，并且不少于85％通过。分子量通过MALDI-TOFMS验证与理论分子量相同。

其中在5’端或3’端添加聚乙二醇链(PEG)的适配体按下述合成。首先，使用核酸合成仪合成在5’端或3’端具有带有氨基基团的接头的适配体。对于5’端，使用ssH接头(SAFC)或DMS(O)MT-AMINO-MODIFIFIER C6(GLENRESERCH)，对于3’端，使用TFA氨基C-6lcaa CPG(ChemGenes)。通过HPLC纯化添加了这些氨基基团的适配体，并且通过HPLC和MALDI-TOFMS分析纯度。然后，将这些适配体与分子量为40000的2-分支的GS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400GS2，由NOF CORPORATION制造)、分子量为40000的2-分支的TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-400TS，由NOF CORPORATION制造)、分子量为40000的4-分支的TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-400TS，由NOF CORPORATION制造)、分子量为80000的2-分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL2-800TS，由NOFCORPORATION制造)、或分子量为80000的4-分支TS型PEG(SUNBRIGHT GL4-800TS，由NOF CORPORATION制造)混合，上述每一种PEG都添加有N羟基琥珀酰亚胺活性基团，并且在室温下反应以通过酰胺键连接PEG和适配体。在反应结束后，通过HPLC进行纯化和纯度分析。

以下显示这样得到的本发明的适配体的部分结构的实例，其中末端用PEG修饰。

(1)其中适配体通过ssH接头(Ta)与2分支GS型PEG结合的结构：

(2)其中适配体通过TFA氨基C-6(Tc)与2-分支GS型PEG结合的结构：

(3)其中适配体通过ssH接头(Ta)与2-分支TS型PEG结合的结构：

(4)其中适配体通过ssH接头(Ta)与4-分支TS型PEG结合的结构：

(5)其中适配体通过DMS(O)MT-氨基-改性剂C6(Tb)与4-分支TS型PEG结合的结构：

下表1显示由适配体IDs：1-54所示的实际得到的适配体的核苷酸。

除非特别指明，核苷酸之间的键是磷酸二酯键。小写字母表示RNA，大写字母表示DNA，并且s表示硫代磷酸酯键。核苷酸中的括号表示在核糖2’-位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基基团，L表示锁定核酸(LNA)。例如，下文中所示的g(M)意指其中2’-位用O-甲基基团修饰的g。Ta表示使用ssH接头连接PEG和适配体时的接头区，Tb表示使用DMS(O)MT-AMINO-MODIFIFIER C6连接PEG和适配体时的接头区，Tc表示使用TFA氨基C-6连接PEG和适配体时的接头区。idT表示反向dT。PEG40GS2是具有分子量为40000的2-分支GS型的(SUNBRIGHTGL2-400GS2，由NOF CORPORATION制造)，PEG40TS2是具有分子量为40000的2-分支TS型的(SUNBRIGHT GL2-400TS，由NOFCORPORATION制造)，PEG40TS4是具有分子量为40000的4-分支TS型的(SUNBRIGHT GL4-400TS，由NOF CORPORATION制造)，PEG80TS2是具有分子量为80000的2-分支TS型的(SUNBRIGHTGL2-800TS，由NOF CORPORATION制造)，并且PEG80TS4是具有分子量为80000的4-分支TS型的(SUNBRIGHT GL4-800TS，由NOFCORPORATION制造)。

适配体IDs：1-30所示的适配体包含共有序列UGAAAGAAACC(SEQ ID NO：67)。适配体IDs：31-51所示的适配体包含共有序列CGAACAAAACU(SEQ ID NO：68)。适配体IDs：52，53，54所示的适配体分别包含共有序列UGAAAAAAACC(SEQ ID NO：66)，CGAAAGAAACU(SEQ ID NO：69)。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【表1-16】

(2)添加胆固醇的适配体的制备

基于PCT/JP09/066457中所述的由SEQ ID NO：30(6)所示的适配体，制备在5’端添加胆固醇的适配体。通过亚磷酰胺法的化学合成制备所述添加胆固醇的适配体。作为胆固醇，使用由ChemGenes制造的胆固醇amidite(cholesterol amidite)(TEG胆固醇，无-DMT，CLP-2704)。

所得到的添加胆固醇的适配体的结构的一个实例显示如下：

下表2显示实际得到的由适配体IDs：55-63所示的适配体。除非特别表示，核苷酸之间的键是磷酸二酯键。小写字母表示RNA，大写字母表示DNA。核苷酸中的括号表示在核糖2’-位的修饰，F表示氟原子，M表示O-甲基基团。s表示硫代磷酸酯键。例如，下文中所示的g(M)sT意指T与其中2’-位用O-甲基基团修饰的g通过硫代磷酸酯键连接。Chol表示胆固醇，idT表示反向dT。由适配体IDs：55-63所示的适配体特征在于在5’端具有胆固醇。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-4】

实施例2：与NGF结合的RNA适配体

通过表面等离子共振法评价实施例1制备的适配体IDs：1-63所示的适配体(排除适配体适配体IDs：26(16)，(17)，(64)-(72)，这些适配体是PEG化的适配体)与NGF的结合活性。

作为测量的设备，使用由BIAcore制造的BIAcore2000，作为传感器芯片，使用与氨基基团反应的CM5。将人NGF以25-40μg/ml溶解在固定溶液(10mM乙酸钠，pH 6)中。对于在蛋白一侧上的氨基基团与在芯片一侧上的羧基基团的反应，使用乙基-3-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。反应后，进行通过乙醇胺-HCl的封闭。固定的NGF的量设为3,000-4,000RU。用于分析物的适配体制备为0.15μM-0.5μM。作为运行缓冲液，使用溶液A。此处，溶液A是145mM氯化钠，5.4mM氯化钾，1.8mM氯化钙，0.8mM氯化镁，20mM Tris(pH 7.6)，0.05％吐温20的混合溶液。作为再生溶液，使用1M NaCl和50mM NaOH的混合溶液。将NGF固定在FC2上，减去FC1的结果以产生最终的传感图。

作为测量的结果，发现由适配体IDs：1-63所示的所有适配体(排除适配体IDs：26(16)，26(17)，26(64)-26(72)，这些适配体是PEG化的适配体)显著地与NGF结合。作为其的一个实例，图1显示由适配体IDs：26，48，57所示的适配体与NGF的结合。由适配体ID：26(-)所示的适配体是适配体ID：26所示的适配体其中第19个g是被O-甲基修饰的适配体。所述g是在下文所示的共有序列中的g，并且已知所述g的修饰显著减少生理活性。上述已经表明由适配体IDs：1-63所示的适配体特异性结合NGF。

使用表面等离子共振法确定实施例1中得到的由适配体ID NOs：1-8，26(2)，31-38，52-56，61和63所示的适配体是否抑制NGF与NGF受体(TrkA)的结合。

如BIAcore公司的试验方案所指导，蛋白A(21181，PIERCE)固定在CM5传感器芯片上。其上固定有约500-700RU的与IgG的Fc部分融合的人Trk A(175-TK，R&D systems)。作为分析物，将NGF(0.1μM)和各种适配体(0.2μM)的混合物在静置30分钟后进行注射。如果该适配体抑制NGF和TrkA的结合，则预期传感图上不出现信号；如果该适配体不抑制结合，则将形成三重复合物，并且预期出现信号。当NGF与受体的结合比与适配体的结合更强时，可以去除该适配体并且NGF可以结合该受体。在开始抑制试验前，确认TrkA和NGF的结合。使用不存在适配体时NGF和NGF受体的结合量为100，将添加适配体时NGF和NGF受体的结合量确定为校正值。此处，结合量是BIAcore的传感图的峰顶处的RU值(NGF注射结束后即刻的RU值)。100减去校正值得到抑制活性％，在不小于90％时显示存在抑制活性。

试验结果为，发现由适配体ID NOs：1-8，26(2)，31-38，52-56，61和63所示的所有适配体均抑制NGF和TrkA的结合。对另一受体P75(p75-Fc；R&D systems)进行类似试验。结果，发现在实施例1中得到的由适配体ID NOs：26(2)，56，61和63所示的所有适配体均抑制NGF和P75的结合不小于90％。

实施例3：适配体的神经突伸长抑制活性

使用作为PC-12细胞的亚克隆的Neuroscreen-1细胞评价在实施例1中得到的适配体的神经突伸长抑制活性。

在用IV型胶原包被的96孔平底平板中，将细胞(每孔2500个细胞)在包含2.5％马血清和1.25％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养一天。加入人NGF(终浓度1.1nM或0.38nM)和适配体(终浓度500-0.01nM)的混合溶液，所述混合溶液在室温下或在37℃在无血清RPMI-1640培养基中预先反应30分钟至1小时。两天后，细胞质和细胞核用Cellomics神经突伸长试剂盒(由Thermo Scientific制造)染色，并且通过CellomicsArrayScan VTI(由Thermo Scientific制造)测量每个细胞的神经突长度。仅加入NGF得到的每细胞神经突长度作为0％抑制活性，并且通过不含NGF的培养基培养2天得到的细胞的神经突长度作为100％抑制活性，由通过在混合物中加入NGF和适配体培养得到的每个细胞的神经突长度计算适配体的抑制活性。当抑制活性为0％以下时，表示为‘0％’。由将50％抑制活性夹在中间的上下两点的浓度确定50％抑制浓度(IC50)。实验的结果显示在表3-1至3-3中。

在表3-1至3-4中，表示为“＜X”的IC50值意指当所示浓度X为最小测量的浓度时，抑制活性不小于50％。表示为“＞X”的IC50值意指当所示浓度X为最大测量浓度时，抑制活性不大于50％。*表示的值意指0.38nM的NGF浓度，其他的是当NGF浓度为1.1nM时的值。括号中的数值是PCT/JP09/066457中记述的IC50值。

结果，发现多种得到的适配体具有IC50为10nM以下的高活性，包括表现出1nM以下的IC50的适配体和表现出0.3nM以下的IC50的适配体。特别地，适配体ID：26(18)ff.所示的适配体表现出不大于0.3nM0.3nM的IC50值。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

实施例4：适配体的细胞增殖抑制活性(TF-1测定)

通过使用TF-1细胞进行生长抑制测定来评价实施例1中得到的适配体的抑制活性。

通过使用反转录病毒载体将两种NGF受体(人TrkA和人p75)基因引入到TF-1细胞(ATCC Number：CRL-2003)中，以产生同时稳定高度表达两种受体的细胞，所述TF-1细胞是一种人红白血病细胞系。将细胞悬浮在包含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并且以1000个细胞(50μL)/孔接种在白色96孔平底平板中。向其中加入50μL人NGF(终浓度0.076nM)和适配体(终浓度30-0.01nM)的混合溶液，所述混合溶液在不含血清的RPMI-1640培养基中在室温预先反应30分钟，3天后，向每个孔中加入用于CellTiter-Glo发光细胞存活力测定(CellTiter-Glo LuminescentCell Viability Assay)的100μL CellTiter-Glo试剂(由Promega制造)，通过微量平板读数仪测量化学发光，并且评价通过NGF刺激的TF-1细胞生长。将仅添加NGF并且将细胞培养3天得到的每孔的发光量作为0％抑制活性，并且将不含NGF的培养物培养3天得到的每孔的细胞的发光量作为100％抑制活性，由通过在混合物中加入NGF和适配体进行培养得到的每孔的发光量计算所述适配体的抑制活性。当抑制活性为0％以下时，表示为‘0％’。由将50％抑制活性夹在中间的上下两点的浓度确定50％抑制浓度(IC50)。实验的结果显示在表4-1至4-3中。

表示为“＜X”的IC50值意指当所示浓度X为最小测量的浓度时，抑制活性不小于50％。表示为“＞X”的IC50值意指当所示浓度X为最大测量浓度时，抑制活性不大于50％。结果，发现多种得到的适配体具有IC50为10nM以下的高活性，包括表现出1nM以下的IC50的适配体和表现出0.3nM以下的IC50的适配体。特别地，适配体ID：26(18)ff.所示的适配体，即，除了适配体IDs：26(36)，26(37)，26(40)的适配体之外的那些适配体，在细胞增殖抑制实验中表现出不大于0.3nM的IC50值，这表明这些适配体具有高的针对NGF的抑制活性。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

实施例5：与现有技术参考文献中所述的NGF适配体比较

比较现有技术参考文献(Binkley J等，(1995)Nucleic Acids Res.(核酸研究)23，3198)中所述的NGF适配体的结合活性和神经突伸长抑制活性。

现有技术参考文献中所述的适配体均为未修饰的RNAs，并且其序列不与本说明书所述的序列相匹配。选择表现出高结合活性的H1、L2和L6，并且通过用T7聚合酶转录而制备现有技术参考文献中所述的适配体。通过与实施例2中的方法相似的方法评价结合活性。用当由SEQ ID NO：57所示的适配体与NGF结合时的最大RU值除以分子量得到的值作为100％，当其不小于80％时，“++”表示显著的，当其不小于50％时，“+”表示显著的，当其不大于50％时，“-”表示显著的。考虑到适配体的分子量不同，将得到的RU值通过除以分子量进行修正。通过与实施例3相似的方法评价神经突伸长抑制活性。结果显示在表5中。

作为实验的结果，L2和L6没有显示显著的结合。当固定L2或L6时，观察到与NGF的结合。因此，认为NGF的固定具有降低的L2和L6针对NGF的亲和性。关于神经突伸长抑制活性，本发明的适配体表现出高的神经突伸长抑制活性，而发现H1、L2、L6甚至在500nM也不抑制神经突伸长。

【表5】

实施例6：与WO02/077262中所述的NGF适配体进行比较

测量WO02/077262中所述的NGF适配体的结合活性、神经突伸长抑制活性、和细胞增殖抑制活性，并且与本发明指定的的适配体ID：26(19)所示的适配体的活性进行比较。作为WO02/077262中所述的NGF适配体，选择Seq ID Nos.38和42。这些适配体的序列如下，并且通过实施例1中所示的亚磷酰胺方法进行制备。此处，使用溴化的dU作为T(T＝5-BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷))。

Seq ID No.38

A T A T A T A T G G G A G G A C G A T G C G G G C A C A C T T A A A

T C C A C T T C A C C T T A C A A T T C C T T T A T C T G C A G A C

G A C G A G C G G G A A A A A A A A

Seq ID No.42

A T A T A T A T G G G A G G A C G A T G C G G G C C C C A A A C A C

T T G T T C C T A T C T T T C A A C C C C C C T T G A T C C A G A C

G A C G A G C G G G A A A A A A A A

通过与实施例2的方法相似的方法并且使用表面等离子共振法评价结合活性。用当由适配体ID：26(19)所示的适配体与NGF结合时的最大RU值除以分子量得到的值作为100％，当其不小于80％时，“++”表示显著的，当其为79-51％时，“+”表示显著的，当其不大于50％时，“-”表示显著的。考虑到适配体的分子量不同，将得到的RU值通过除以分子量进行修正。通过与实施例3和4相似的方法评价神经突伸长抑制活性和细胞增殖抑制活性。结果显示在表6中。

作为实验的结果，发现WO02/077262中所述的NGF适配体的结合活性与本发明的适配体相比极低。关于神经突伸长抑制活性和细胞增殖抑制活性，本发明的适配体表现出高的抑制活性，而WO02/077262中所述的适配体完全不表现出抑制活性。

【表6】

实施例7：与其他神经营养蛋白的交叉反应性

神经营养蛋白是NGF-相关基因家族的通称，并且已知其他的BDNF(脑源性神经营养因子)，NT-3(神经营养蛋白-3)和NT-4/5(神经营养蛋白-4/5)。作为神经营养蛋白受体，已经鉴定了低亲和性受体p75和高亲和性受体Trk。Trk还形成包括TrkA、TrkB和TrkC 3种的家族，TrkA是NGF受体，TrkB是BDNF和NT-4/5的受体，TrkC是NT-3受体。本发明所指定的适配体具有针对NGF的高结合活性和抑制活性。检验了关于其他神经营养蛋白的活性。

以与实施例2相同的方式通过表面等离子共振法评价由适配体ID：26(2)所示的适配体与人BDNF(由R&D systems制造)、人NT-3(由R&Dsystems制造)、人NT-4/5(由R&D systems制造)的结合。

结果，没有观察到与NT-3的结合。清楚的是对于BDNF和NT-4/5的解离速率非常快，结合活性明显地低于与NGF的结合活性。

通过使用TF-1细胞的生长抑制测定评价由适配体IDs：26(2)，52，63-65所示的适配体针对BDNF，NT-3，NT-4/5的生理抑制活性。

通过使用反转录病毒载体将关于各种神经营养因子的人受体基因(TrkB，TrkC，p75)引入到TF-1细胞(ATCC Number：CRL-2003)中，以产生稳定高表达这些受体的细胞，所述TF-1细胞是人红白血病细胞系。使用引入TrkB和p75的TF-1细胞来评价针对BDNF的抑制活性，使用引入TrkC和p75的TF-1细胞来评价针对NT-3的抑制活性，使用仅引入TrkB的TF-1来评价针对NT-4/5的抑制活性。将这些细胞悬浮在包含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并且以1000个细胞(50μL)/孔接种在白色96孔平底平板中。向其中加入50μL人BDNF(终浓度0.074nM)或NT-3(终浓度0.074nM)或NT-4/5(终浓度0.071nM)和适配体(终浓度30-0.01nM)的混合溶液，所述混合溶液在不含血清的RPMI-1640培养基中在室温预先反应30分钟，3天后，向每个孔中加入用于CellTiter-Glo发光细胞存活力测定(CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay)的100μL CellTiter-Glo试剂(由Promega制造)，通过微量平板读数仪测量化学发光。用通过仅加入BDNF或NT-3或NT-4/5并且将细胞培养3天得到的每孔发光量作为0％抑制活性，并且用不加入BDNF或NT-3或NT-4/5培养3天得到的细胞的发光量作为100％抑制活性，由通过在混合物中添加BDNF或NT3或NT-4/5进行培养得到的每孔发光量计算适配体的抑制活性。当抑制活性为0％以下时，表示为‘0％’。由将50％抑制活性夹在中间的上下两点的浓度确定50％抑制浓度(IC50)。结果显示在表7中。

表示为“＞X”的IC50值意指当所示浓度X为最大测量的浓度时，抑制活性不超过50％。所有测量的适配体均表现出不小于1000nM的关于BDNF和NT-3的IC50。另外，关于NT-4/5的IC50不小于300nM。从上述结果，发现这些适配体特异性抑制NGF。

【表7】

实施例8：NGF适配体的止痛作用

为了研究NGF适配体对NGF-诱发的疼痛的止痛作用，使用对大鼠后爪皮下施用NGF诱发的热痛觉过敏模型。对于实验，使用Jcl：SD大鼠(6周龄)。作为热痛觉过敏指数，使用对来自对足底的足底热刺激测量设备(由Ugo Basile制造)的红外线照射的逃避行为反应潜伏期。在测试前一天，进行对评估系统的适应。测试当天在施用前，测量逃避反应潜伏期，并且使用表现出不小于10秒且小于20秒的动物。将重组人β-NGF(R&D Systems，终浓度50μg/ml)和测试物质与载体(vehicle)(20mMTris-HCl(pH 7.6)，145mM NaCl，5.4mM KCl，0.8mM MgCl₂，1.8mMCaCl₂，0.1％BSA)混合，在室温温育30分钟，并且以10μl皮下施用到左后脚底。在3小时后和在5小时后测量逃避反应潜伏期。以0.5，5，10mg/ml的终浓度(相对于NGF的摩尔比例约为：10，100，200-倍)施用由适配体ID：26(2)所示的抗-NGF适配体。作为对照，以相同的方式施用载体或载体和NGF的混合物。结果显示在表8中(平均值±SEM，载体组和NGF组：n＝12，SEQ ID NO：26(2)施用组：n＝9)。

在施用后3小时和5小时，与载体组相比较，NGF组表现出显著低的逃避反应潜伏期。施用后3小时，与仅施用NGF的组相比较，以5，10mg/ml施用适配体ID：26(2)的组的逃避反应潜伏期显著高(p＜0.05)，并且在施用后5小时，与仅施用NGF的组相比较，以0.5，5，10mg/ml施用适配体ID：26(2)的组的逃避反应潜伏期高(p＜0.01)。这揭示抗-NGF适配体对NGF-诱发的疼痛具有止痛作用。

【表8】

实施例9：NGF适配体对术后疼痛模型的止痛作用

为了研究NGF适配体治疗的功效，使用将要具有诱发的热痛觉过敏的术后疼痛模型。对于实验，使用Crl：CD(SD)大鼠(5-周龄)。将导管的尖头内置在股静脉中，另一尖头从大鼠背部暴露出来。一周后，在大鼠上设定快速连接输注系统(Quick connect infusion system)(由Strategicapplications股份公司制造)，在一周后评价热痛觉过敏。作为热痛觉过敏指数，使用对来自对足底的足底热刺激测量设备(由Ugo Basile制造)的红外线照射的逃避行为反应潜伏期。在开始测试前3天进行对评估系统的适应。在测试当天，测量逃避反应潜伏期，并且使用表现出不小于10秒且小于20秒的动物。将由适配体ID：26(66)所示的抗-NGF适配体溶解在盐水中，并且用注射泵(由TERUMO CORPORATION制造)以持续方式以13.61mg/240ml/kg/96小时进行静脉内施用(适配体的质量对应于不含PEG的区域)。作为对照，以相同方式施用载体。在自开始施用起1小时，切开右后脚底的皮肤和筋膜，垂直剖开屈肌，并且缝合皮肤。在切开手术后、以及此后的第1，2，3，4天测量逃避反应潜伏期。结果显示在表9中(平均值±SEM，n＝9)。

与施用-切开手术之前相比较，载体组在施用-切开手术后第1，2，3，4天表现出显著小(p＜0.01)的逃避反应潜伏期。在施用-切开手术后第1，2，3，4天，与载体组相比较，适配体(适配体ID：26(66))施用组的逃避反应潜伏期显著高(1，2，4天后：p＜0.01，3天后：p＜0.05)。这揭示抗-NGF适配体对术后疼痛模型具有止痛作用。

【表9】

工业适用性

本发明的适配体和复合物可以有效作为用于诸如疼痛、炎性疾病等的疾病的药剂、诊断剂或试剂。本发明的适配体和复合物也可以有效用于纯化和浓缩NGF，以及检测和定量NGF。

本申请基于在日本提交的专利申请号2010-068546(申请日：2010年3月24日)，其全部内容结合入本文中。

Claims (37)

1.结合NGF的适配体，所述适配体满足下述(1)和(2)：

(1)包含由UGAAARAAACC(SEQ ID NO：64)或CGAAMRAAACU(SEQ ID NO：65)所示的序列，和

(2)具有不超过73的碱基长度。

2.根据权利要求1所述的适配体，所述适配体抑制NGF与NGF受体的结合。

3.根据权利要求1或2所述的适配体，所述适配体抑制NGF的神经突伸长活性或细胞增殖活性。

4.根据权利要求3所述的适配体，所述适配体具有不大于10nM的50％抑制浓度。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的适配体，所述适配体不结合NT-3。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的适配体，所述适配体不抑制BDNF、NT-3或NT-4/5的细胞增殖活性。

7.根据权利要求1或2所述的适配体，所述适配体包含下述核苷酸序列(a)、(b)和(c)中的任一种：

(a)选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)；

(b)选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)，其中置换、缺失、插入或添加1至数个核苷酸；和

(c)与选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70％以上的同一性的核苷酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的适配体，其中至少一个核苷酸被修饰。

9.根据权利要求8所述的适配体，所述适配体用反向dT或聚乙二醇修饰。

10.根据权利要求9所述的适配体，其中所述反向dT或聚乙二醇结合在所述适配体的5’端或3’端。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的适配体，其中在各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的适配体，其中在各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

13.核酸，所述核酸包含选自SEQ ID NOs：1-54的核苷酸序列并且具有不超过73的碱基长度。

14.根据权利要求13的核酸，其中至少一个核苷酸被修饰。

15.根据权利要求14的核酸，所述核酸用反向dT或聚乙二醇修饰。

16.根据权利要求15的核酸，其中所述反向dT或聚乙二醇结合在适配体的5’端或3’端。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的核酸，其中在各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

18.根据权利要求14至16中任一项所述的核酸，其中在各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

19.一种添加疏水物质的适配体，所述适配体结合NGF。

20.根据权利要求19所述的适配体，所述适配体抑制NGF与NGF受体的结合。

21.根据权利要求20所述的适配体，所述适配体抑制NGF的神经突伸长活性或细胞增殖活性。

22.根据权利要求21所述的适配体，所述适配体具有不大于10nM的50％抑制浓度。

23.根据权利要求19或20所述的适配体，所述适配体包含下述核苷酸序列(a’)、(b’)和(c’)中的任一种：

(a’)选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)；

(b’)选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)，其中置换、缺失、插入或添加1至数个核苷酸；和

(c’)与选自SEQ ID NOs：55-63的核苷酸序列(其中尿嘧啶可以是胸腺嘧啶)具有70％以上的同一性的核苷酸序列。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的适配体，其中所述疏水物质结合在所述适配体的5’端。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的适配体，其中所述疏水物质是胆固醇。

26.根据权利要求19至25中任一项所述的适配体，其中至少一个核苷酸被修饰。

27.根据权利要求26所述的适配体，所述适配体用反向dT修饰。

28.根据权利要求27所述的适配体，其中所述反向dT结合在所述适配体的3’端。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的适配体，其中在各个嘧啶核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

30.根据权利要求26至28中任一项所述的适配体，其中在各个嘌呤核苷酸的核糖的2’-位处的羟基是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氢原子、氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。

31.一种复合物，所述复合物包含根据权利要求1至12和19至30中任一项所述的适配体或根据权利要求13至18中任一项所述的核酸，和功能物质。

32.根据权利要求31所述的复合物，其中所述功能物质是亲和性物质、标记物质、酶、药物递送载体或药物。

33.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至12和19至30中任一项所述的适配体、根据权利要求13至18中任一项所述的核酸或权利要求31或32的复合物。

34.一种抗疼痛剂，所述抗疼痛剂包含根据权利要求1至12和19至30中任一项所述的适配体、根据权利要求13至18中任一项所述的核酸或权利要求31或32的复合物。

35.一种抗炎剂，所述抗炎剂包含根据权利要求1至12和19至30中任一项所述的适配体、根据权利要求13至18中任一项所述的核酸或权利要求31或32的复合物。

36.一种治疗或预防伴有疼痛或炎症的疾病的方法，所述方法包括向需要所述方法的受试者施用根据权利要求1至12和18至30中任一项所述的适配体、根据权利要求13至18中任一项所述的核酸或权利要求31或32的复合物。

37.根据权利要求1至12和18至30中任一项所述的适配体、根据权利要求13至18中任一项所述的核酸或权利要求31或32的复合物，其用于预防或治疗伴有疼痛或炎症的疾病。

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