CN102839124A - 一种极端环境原油降解功能菌的分离筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种极端环境原油降解菌的分离筛选方法，解决了现有原油降解菌分离筛选方法存在的操作过程复杂、分离效率低、分离所得微生物效果差的缺点。其技术特点是一、采用无机盐培养基从极端环境污染土壤中富集原油降解菌；二、将所得富集菌液梯度稀释后，进行间歇试验考察原油降解情况；三、采用DGGE技术分析各稀释度菌液的群落组成，从而得到原油去除效果与富集菌液相类似、组成最为简单的菌液，即为高效原油降解功能菌。该方法具有简单、高效、快速的特点，分离所得原油降解菌通常具有较高的去除效果。
Description
所属领域
本发明涉及到一种极端环境原油降解菌的分离筛选方法。该方法是用含原油无机盐培养基从极端环境污染土壤中富集原油降解菌；再将所得富集菌液梯度稀释后，进行间歇试验考察原油降解情况；然后采用DGGE技术分析各稀释度菌液的群落组成，从而得原油去除效果与富集菌液相类似、组成最为简单的菌液，即为高效原油降解功能菌
背景技术
上世纪五十年代以来，石油在世界能源构成中的比重超过煤炭，成为世界第一能源。但它的大规模应用却给环境造成了极大的危害。据估计全世界每年约有109t石油及其产品通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中。石油土壤污染不仅改变土壤理化特性，破坏土壤结构，还会恶化土壤微生物的生境，削减土壤微生物种类与数量，降低微生物活性。水体的石油污染将干扰污染水域生物群落的正常生理、生化活动，破坏化学信息联系，使生物的生长和繁殖受到严重损害，给生态系统带来严重危害。
与物理化学方法相比，生物法的石油污染(土壤或水污染)处理具有运行操作成本低、处理效率高、且无二次污染的优点而倍受青睐。作为生物法处理的“主体”高效原油降解微生物的获得则是生物法成功的关键。由于石油成分比较复杂，单一菌株往往很难达到理想的原油降解效果。目前的研究中所采用的分离方法、尤其是极端环境条件下的分离方法是针对不同的原油组分分别筛选特定单一菌株，然后将所有菌株复配构成复配体系。此种方法不仅操作过程复杂繁琐、工作量大，所得的微生物对原油的去除效果往往很不理想。
针对目前极端环境原油降解菌分离筛选过程存在的以上不足，本发明提出了一种
发明内容
本发明的目的就在于避免上述现有技术的不足之处而提供了一种极端环境原油降解菌的分离筛选方法，该方法是一种简单、高效的原油降解功能菌分离筛选方法，它避免了冗杂的操作程序，具有工作量小，筛选所得微生物原油去除效率高等特点。他的技术原理是：由于微生物具有广泛的适应性，较强的微生物诱导酶机制和旺盛的代谢能力，极端环境下长期受原油污染的土壤往往是高效原油降解菌的聚集地。常规微生物分离培养技术，采用富集培养基对土壤中原油降解菌进行富集，使得富集得到的微生物组成较为复杂，对于进一步研究和应用带来诸多不便。因此，本研究中采用梯度稀释的方式，对所得的富集菌液进行稀释，然后进行间歇实验进一步验证各稀释度的原油降解特性，同时结合分子生物学技术分析各稀释度的微生物群落组成。在间歇实验和微生物群落结构分析的基础上，得到组成最为简单、原油去除效果与富集菌液相似的最低稀释度菌液，即为高效原油降解功能菌群。
具体发明内容如下：
(一)采用含油无机盐培养基从极端环境污染土壤中富集原油降解菌；
(二)将所得富集菌液进行梯度稀释，间歇试验考察原油降解情况；
(三)采用DGGE技术分析各稀释度菌液的群落组成，从而得到稀释度最低、原油去除效果与富集菌液相类似、组成最为简单的菌液，即为高效原油降解功能菌。
本发明采用分子生物学技术与常规微生物分离筛选相结合的方式，针对目前极端环境下原油降解菌分离筛选操作复杂、工作量大、所筛选的微生物降解效果不理想的问题，创造性提出了一种简单、高效的原油降解功能菌的分离筛选方法。该方法避免了常规分离培养方法中针对不同的原油组分分别筛选特定单一菌株后将所有菌株复配构成复配体系的不足，同时也可以避免一些不可单一培养(可以菌群形式培养)微生物的丢失，具有简单、高效、快速、分离所得原油降解菌具有较高的去除效果等优点。
附图说明
附图1是各稀释度菌液原油降解情况
附图2是各稀释度菌液DGGE谱图
附图3是所筛选原油降解菌在油浓度10g/L条件下不同温度时原油降解效果
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
本实施方式中高效原油降解功能菌的分离筛选方法是按下述步骤进行的：
一、将5g克拉玛依地区(高温干旱环境)石油污染土壤放入100ml含10g/L原油的无机盐培养基培养，于45℃，140-170rpm的摇床中培养5天后，取富集液5mL接种相同新鲜培养基，相同条件下培养5天，如此连续富集培养3次，将菌液保种于20％甘油中，-80℃低温冰箱保存。其中无机盐培养基配制方法NaHPO40.6g，KH2PO40.2g，NaNO34.0g，CaCl20.01g，FeSO40.01，MgSO40.3g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.2。
二、将富集后的混合菌用无菌水梯度稀释，取稀释度为10-1、10-3、10-5、10-7、10-9五个个稀释样于250ml三角瓶中，在45℃、165rpm的旋转摇床上培养，培养5d后，测定培养液中的原油残留量，每一稀释度样品重复3次，计算平均降解率(间歇实验内容)，结果如图1所示，其中富集菌液、10-1、10-3、10-5、10-7四个稀释度原油降解效果较好在40％-60％之间，而10-9稀释度菌液几乎没有降解效果。
三、同时将释度为10-1、10-3、10-5、10-7、10-9菌液进行DGGE分析(如图2)，DGGE图谱中各条带分析见表1，可以看出DGGE图谱中泳道1(富集菌液)到泳道4(稀释度为10-5)微生物组成较丰富，而泳道6(稀释度为10-9)微生物条带最少，泳道5(稀释度为10-7)介于二者之间，结合间歇实验结果，10-9稀释度(泳道6)菌液几乎没有降解效果，而10-7稀释度(泳道5)原油降解效果与富集菌液相类似，因此确定组成最为简单的10-7稀释度菌液为原油降解功能菌(命名为KL8-2)，且其主要由7种Rhizobiales sp.，Pseudomonas sp.，Brucella sp.，Bacillus sp.，Rhodococcus sp.，Microbacterium sp.和Roseomonassp.菌构成。
四、在油浓度为10g/L的无机盐培养基中，按5％接种量接种功能菌KL8-2，分在30-70℃、160rpm条件下培养5天后，测得残余原油量，考察所得功能菌对温度的耐受性。如图3所示，原油降解菌KL8-2对温度具有良好的耐受性，温度在40-60℃，原油降解率在45％以上。
表1DGGE谱图中各条带通过BLAST和Sequence Match进行相似性检索结果
| 条带 | 相似菌株、相似度 | 登录号 | 相似菌属 |
| 1、14 | Rhizobiales bacterium CSQ-10，96％ | EF512133.1 | Rhizobiales |
| 2、8、13 | Microbacterium sp.HY14，99％ | HM579805.1 | Microbacterium |
| 3 | Ochrobactrum intermedium strain BAB-229，99％ | HM480366.1 | Ochrobactrum |
| 4 | Mesorhizobium sp.GWS-SE-H103，99％ | AY332151.1 | Mesorhizobium |
| 5 | Actinomycete P032.UGM060121-02，98％ | EU718324.1 | Actinomycete |
| 6、7 | Hyphomonas polymorpha strain DSM 2665，99％ | NR_025325.1 | Hyphomonas |
| 9 | Pseudomonas sp.sampath10，99％ | HM749063.1 | Pseudomonas |
| 10 | Brucella sp.BS26，99％ | HM132106.1 | Brucella |
| 11 | Bacillus subtilis strain E1，99％ | HM560955.1 | Bacillus |
| 12 | Uncultured Rhodococcus sp.clone PtR-II-c18 | HM462379.1 | Rhodococcus |
| 15 | Roseomonas sp.P，99％ | FJ535467.1 | Roseomonas |
Claims (3)
1.一种极端环境原油降解菌的分离筛选方法，包括如下步骤(一)采用含原油无机盐培养基从极端环境污染土壤中富集原油降解菌；(二)将所得富集菌液梯度稀释后，进行间歇试验考察原油降解情况；(三)采用DGGE技术分析各稀释度菌液的群落组成，从而得原油去除效果与富集菌液相类似、组成最为简单的菌液，即为高效原油降解功能菌，其特征在于具体富集的步骤是将5g克拉玛依地区(高温干旱环境)石油污染土壤放入100m1含10g/L原油的无机盐培养基培养，于45℃，140-170rpm的摇床中进行原油降解菌培养5天后，取富集液5mL接种相同新鲜培养基，相同条件下培养5天，如此连续富集培养3次，将菌液保种于20％甘油中，-80℃低温冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的极端环境原油降解菌的分离筛选方法，其特征在于无机盐培养基为：NaHPO40.6g，KH2PO40.2g，NaNO34.0g，CaCl20.01g，FeSO40.01，MgSO40.3g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.2。
3.根据权利要求1所述的极端环境原油降解菌的分离筛选方法，其特征在于梯度稀释是将富集菌液稀释成为10-1、10-3、10-5、10-7、10-9等。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520906A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-03-22 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种利用微生物胞内酶快速构建石油降解菌系的方法 |
| CN112662727A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-16 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种基于绝迹稀释培养组的功能微生物高通量分析和选育方法 |
| CN115109711A (zh) * | 2021-03-22 | 2022-09-27 | 中国石油天然气股份有限公司 | 复合菌剂及其制备方法、污水处理工艺 |
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| CN115109711B (zh) * | 2021-03-22 | 2024-03-01 | 中国石油天然气股份有限公司 | 复合菌剂及其制备方法、污水处理工艺 |
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