CN102816218A

CN102816218A - 一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102816218A
Application number: CN 201210314881
Authority: CN
Inventors: 张颖; 辛奇; 祝秉东; 景涛; 唐克峰; 叶华
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白，是具有如序列2所示的蛋白序列，并公开了其制备方法和应用。本发明的有益效果为：本发明构建了编码结核分枝杆菌phoY2休眠基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其表达，并进行蛋白纯化，通过小鼠实验和人体实验对其免疫原性进行了研究，证明此种抗原确实有效,为结核疫苗提供了有效的候选潜伏抗原。

Description

一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病，目前全球约有三分之一人口感染MTB，每年新发患者1000万，死亡人数高达300万。卡介苗(BCG)作为预防结核病的疫苗自1921年发现以来一直受到人们的关注，曾经视为战胜结核病的希望，但是经过半个多世纪的研究和应用，BCG虽然能在新生儿中阻止结核的播散，但却不能对抗最普遍的成人肺结核病,而在天然感染结核的人中也不能抵御再次感染。因此，亟需有效的疫苗来控制TB的传播与蔓延。亚单位疫苗是一种新型结核疫苗，其使免疫应答集中于在免疫保护中发挥关键作用的抗原蛋白。对结核分枝杆菌蛋白质抗原的研究可用于发展更好的疫苗。以往结核亚单位疫苗研究主要选择生长早期和对数生长期表达的抗原，而忽略了休眠期细菌特有的抗原。当卡介苗(BCG)免疫机体后，由于休眠期抗原表达量低，不能针对休眠期细菌产生免疫反应，导致对休眠状态结核杆菌没有免疫保护作用，而休眠状态的结核杆菌潜伏感染是成人肺结核复发的主要来源。随着人们对潜伏感染的认识，休眠期结核杆菌表达的抗原物质开始受到重视。其中，HspX是最早发现的与结核杆菌休眠状态有关的基因，HspX 抗原与可以被致敏的T细胞识别，刺激T细胞分泌IFN-γ，具有细胞免疫和体液免疫原性。在健康的与肺结核患者密切接触的家人（80％）和医务工作者（90％）中，HspX具有明显的T细胞刺激活性，比例明显高于普通人群（50％），提示HspX抗原具有免疫保护作用。近来有研究表明结核分枝杆菌phoY2 基因与结核菌的休眠状态形成有关，phoY2 基因缺失可增加菌株对利福平，吡嗪酰胺等抗结核药物的敏感性，并且影响小鼠感染结核模型中结核持留菌的形成。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2及其制备方法，为结核疫苗提供了有效的候选潜伏抗原。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白，具有如序列2所示的蛋白序列。

上述的一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因。

进一步的，上述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因，是如下1）或2）的基因：

a）其核苷酸序列是序列表中的序列1；

b）在严格条件下与a）限定的DNA序列杂交且编码所述结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的DNA分子。

进一步的，保护了含有上述结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。

含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明的第二个目的是提供上述结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的制备方法，包括有以下步骤：

1）获得上述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因；

2）将步骤1）得到的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因导入重组表达载体；

3）将步骤2）载体导入宿主细胞；

4）培养步骤3）得到的宿主细胞；

5）将步骤4）得到的宿主细胞进行处理得到上述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白并纯化和表达。

上述制备方法，所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明的第三个目的是提供上述结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白在制备结核亚单位疫苗中的应用。

进一步的，上述应用中，所述结核亚单位疫苗是将上述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀释液与DDA水溶液和TDM水溶液混合加热后制得的。

进一步的，上述应用中，所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白为用PBS稀释至0.2ug/ul；所述DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml；所述TDM用注射用水配制成2.5 mg/ml；所述加热为80℃水浴加热10分钟；所述结核亚单位疫苗中各组分的体积比为结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀释液：DDA水溶液：TDM水溶液为2：1：1。

本发明的有益效果为：本发明构建了编码结核分枝杆菌phoY2休眠基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其表达，并进行蛋白纯化，通过小鼠实验和人体实验对其免疫原性进行了研究，证明此种抗原确实有效, 为结核疫苗提供了有效的候选潜伏抗原。

附图说明

图1为结核分枝杆菌phoY2基因的体外扩增图谱，其中，

M：Marker；

泳道1：PCR产物。

图2为phoY2抗原的电泳结果，其中，

M：Marker；

泳道1：BL21 DE3 诱导后上清；

泳道2：phoY2原样；

泳道3：上样后流穿液；

泳道4：20mM/L咪唑漂洗缓冲液；

泳道5：500mM/L咪唑洗脱缓冲液洗脱收集液。

图3为phoY2抗原特异性免疫小鼠IFN-γ分泌水平。

图4为phoY2抗原特异性免疫小鼠IL-17分泌水平。

图5为phoY2抗原特异性免疫小鼠体液IgG1检测结果。

图6为phoY2抗原特异性免疫小鼠体液IgG2b检测结果。

图7为phoY2抗原特异性免疫小鼠体液IgG2c检测结果。

图8为临床标本特征表。

图9为人体外周血单个核细胞（PBMC）对phoY2 及HspX 抗原的IFN-γ免疫反应结果。

其中，

HD：健康志愿者，n=9；

TB：结核患者，n=26；

LTB：密切接触者，n=9。

3×10⁶ PBMC/孔分别与phoY2 抗原（5ug/ml）和HspX 抗原（5ug/ml）在37℃、5% CO2条件下共孵育20小时后，运用ELISPOT方法检测计数分泌IFN-γ 的细胞数。

具体实施方式

实施例1：

pET-30a phoY2质粒的克隆构建：

1、目的基因phoY2的扩增

以结核分枝杆菌（MTB）毒株 H37 Rv 的DNA为模板，根据 GenBank中公布的结核分枝杆菌phoY2基因序列设计两对引物，上游引物含EcoR I酶切位点，下游引物含HindⅢ酶切位点，扩增全长为642bp的phoY2，扩增结果如图1所示。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，69℃复性30s，72℃延伸50s，25个循环；72℃延伸10min。PCR产物经纯化后，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，克隆构建在质粒pET-30a（+）中。

2、构建phoY2表达质粒

PCR产物经纯化后，phoY2片段被EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后并纯化后，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-phoY2，经测序鉴定，测序结果为序列2。

实施例2：

phoY2蛋白表达纯化：

将质粒pET30a-phoY2转化入E.Coli BL21(DE3)中，活化表达phoY2蛋白的E．coli BL21菌体，移入200 mL培养基中振荡培养2～3 h至A600达到0.5；加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG（0.5mmol／L）25℃诱导振荡培养12h；4℃10000rpm离心10min收集细菌；超声破碎提取与上清，随后应用Ni-NTA His-Bind柱（Novagen）纯化系统纯化目的蛋白，并进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图2所示。

实施例3：

制备phoY2抗原免疫小鼠，并检测小鼠细胞免疫和体液免疫水平：

1、将phoY2蛋白用PBS稀释至10ug/50ul；DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml，80℃、10min水浴加热；TDM用注射用水配制成2.5mg/ml，80℃、10min水浴加热；取DDA和TDM溶液各50ul与100ul的phoY2蛋白充分混匀，最后疫苗呈均一的乳油状。

2、将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为三组：phoY2蛋白免疫组（n=10），卡介苗BCG免疫组（n=10），和PBS对照组（n=10）。分别在第1、4、7周用制备好的蛋白疫苗腹股沟皮下免疫动物（200ul/只），5×10⁶CFU BCG在第1周腹股沟皮下免疫动物1次。蛋白疫苗最后一次免疫后6周，各组各取4只小鼠采血检测体液免疫指标，动物处死无菌分离脾脏淋巴细胞检测细胞免疫指标。

3、细胞因子IFN-γ及IL-17的水平与结核病的保护性免疫反应相关。应用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针对特异性抗原phoY2分泌IFN-γ及IL-17的水平，结果如图3和图4所示。小鼠最后一次免疫6周后无菌分离脾脏，检测脾细胞受到phoY2蛋白（5ug/m1）刺激后IFN-γ及IL-17的分泌水平。

4、用phoY2蛋白（5ug/m1）包被96孔板（100ul/well）4℃过夜。PBST溶液300ul/well洗板5次×5 min/次。洗涤后加入10% BSA 200ul/孔，37℃封闭1h。弃去孔内液体后，加入稀释的血清样品100ul/孔，从1：100开始至1：12800，37℃放置1h。洗板后，加入200ul/well的1:15000稀释的兔抗鼠IgG1，1:10000稀释的IgG2b和1:5000稀释的IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100ul/well TMB显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入50ul/well终止液（2M的H₂SO4）终止反应；在450nm检测OD值，结果如图5-图7所示。

实施例4：

1、本研究纳入人群分为3组，如图8所示：活动性肺结核病人（TB，26例），肺结核患者密切接触者（LTB，9例，视为结核潜伏感染者），BCG接种的健康志愿者（HD，9例）。于兰州市肺科医院采集临床标本，抽取人体静脉血10ml于肝素抗凝管中，分离PBMC，进行细胞计数，将细胞悬液浓度调度至5×10⁶ cells/ml。将分离的PBMC加入到ELISPOT板中（3×10⁶cells/孔，同时分别加入刺激蛋白HspX，phoY2，使蛋白终浓度均为5ug/ml）。

2、37℃、5% CO2条件下共同孵育20小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，分别进行斑点计数，并进行统计学分析，结果如图9所示。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白，其特征在于，具有如序列2所示的蛋白序列。

2.一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因，其特征在于：是如下1）或2）的基因：

a）其核苷酸序列是序列表中的序列1；

4.含有权利要求2或3所述结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。

5.含有权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

6.一种结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的制备方法，其特征在于：包括有以下步骤：

1）获得如权利要求2所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的编码基因；

3）将步骤2）载体导入宿主细胞；

4）培养步骤3）得到的宿主细胞；

5）将步骤4）得到的宿主细胞进行处理得到如权利要求1所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白并纯化和表达。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

8.一种如权利要求1所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白在制备结核亚单位疫苗中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述结核亚单位疫苗是将如权利要求1所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀释液与DDA水溶液和TDM水溶液混合加热后制得的。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：如权利要求1所述的结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白为用PBS稀释至0.2ug/ul；所述DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml；所述TDM用注射用水配制成2.5 mg/ml；所述加热为80℃水浴加热10分钟；所述结核亚单位疫苗中各组分的体积比为结核分枝杆菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀释液：DDA水溶液：TDM水溶液为2：1：1。