CN102802737A - 利用厌氧消化破坏生物有害物质和增加生物气产生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于使用厌氧消化(AD)过程、尤其是嗜热性厌氧消化(TAD)来破坏生物有害物质的系统和方法，所述生物有害物质包括含朊病毒的特定风险材料(SRM)、病毒和/或细菌病原体等。本发明的额外优点还包括利用可含有这种生物有害物质的原料从而以改善生物气质量和数量的形式来实现提高的生物气产生。
Description
背景技术
许多蛋白质基生物有害物质构成了世界范围内的主要健康问题。这种物质的一种主要种类包括病毒。
例如，流感病毒是引起人呼吸道中广泛传播感染的正粘液病毒的成员，但现有疫苗和药物疗法的价值有限。通常在一年中，20％人口受该病毒困扰，导致40000人死亡。在历史上最具破坏性的人类大灾难之一中，1918年的A型流感病毒大流行期间，全世界至少2000万人死亡。新的流感大流行的威胁正在持续，因为现有疫苗或疗法的价值有限。在老年人中，接种疫苗的功效仅为约40％。由于病毒抗原、血细胞凝集素HA和神经氨糖酸苷酶N的遗传变异，现有疫苗不得不每年重新设计。四种抗病毒药物已在美国被批准用于治疗和/或预防流感。然而，由于严重的副作用和可能的抗性病毒的出现，它们的用途是有限的。
在美国，腹泻的主要原因是病毒感染，例如诺如病毒(norovirus)、轮状病毒及其他肠道病毒。
HIV(正式地称为HTLV-III和淋巴结病相关病毒)是引起称为ATDS(获得性免疫缺陷综合征)的疾病(其中免疫系统开始破坏的综合症)从而导致许多威胁生命的机会感染的逆转录病毒。HIV已经涉及作为AIDS的主要原因，且可经由与体液接触而传播。除经皮的损伤之外，粘膜或不完整皮肤与血液、含血的液体、组织或其他潜在感染性的体液的接触造成感染风险。
这些感染性病毒剂中的许多，在与某些生物材料接触后，这种材料变成生物有害的。这些生物有害物质中的大多数(如果不是所有)需要适当处理。
其他的蛋白质基生物有害物质包括朊病毒，其可以存在于所谓的“特定风险材料(SRM)”中。SRM，例如来自牛的SRM(作为潜在的BSE朊病毒来源)的管理仍然是全球问题。破坏朊病毒和利用排除污染的SRM的经济和环境可靠的方式对牛养殖业而言是非常需要的。
BSE已经是全世界牛肉工业的最大的经济和社会问题之一。仅在加拿大，从2003年五月起，BSE造成超过60亿美元的损失。可传染的海绵状脑病(TSE)形成一组致命的神经变性紊乱，以人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)(CJD)、吉斯曼-史特斯勒-史茵克(Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征(GSS)和致死的家族性失眠症(FFI)为代表；和以动物的羊瘙痒症、慢性消瘦病(CWD)和牛海绵状脑(BSE)为代表(Collinge，2001)。英国的主要BSE家畜流行过程中积累的证据确认BSE和CJD之间的关联。预防人类感染的一个关键步骤是从食物链和环境中消除病原体，因为传播路线和机制并未完全被了解。
朊病毒被认为是引起TSE的病原体。朊病毒，PrPsc，主要由细胞朊病毒蛋白PrPc的蛋白酶-K抗性的错误折叠同型体组成(Prusiner，1998)。朊病毒对通常有效抵抗许多微生物的灭活方法具有抗性(Millson等，1976；Chatigny和Prusiner，1979；及Taylor 1991，2000)。许多研究报道，化学消毒(Brown等，1982)、在121℃下热压灭菌1hr(Brown等，1986，Taylor等1997)、暴露于6M尿素和1M NaOH(Brown等，1984，1986)、用1M NaSCN(Prusiner等1981)和0.5％次氯酸盐(Brown等1986)处理、暴露于最高14000ppm的次氯酸钠(Taylor，1993)、用蛋白酶K(Kocisko等，1994；Caughey等，1997)及其他新鉴别的蛋白酶(McLeod等，2004；Langeveld等，2003)消化不能完全破坏PrPsc。英国和欧洲已经对提取物(renderings)中PrPsc的灭活进行了评估(Taylor和Woodgate，2003)。
PrPsc的酶促降解也作为一种实现污染设备的净化和再使用的手段进行研究。例如，使用Sup35Nm-His6重组朊病毒蛋白来代表BSE朊病毒，Wang证明BSE替代物被枯草杆菌蛋白酶和角蛋白酶选择性消化，而不被胶原酶和弹性蛋白酶消化(Wang等，2005)。报道了来自190个分泌蛋白酶的分离株的六种菌株产生显示抗PrPsc的消化活性的蛋白酶(Myller-Hellwig等，2006)。一些由细菌生成的热稳定蛋白酶在高温下和pH 10下降解PrPsc(Hui等2004，McLeod等：2004，Tsiroulnikov等2004，Yoshioka等)。
然而，迄今为止，焚烧是完全破坏朊病毒的唯一有效方法。但是焚烧有某些不希望的生态学缺点，特别是能量消耗和温室气体排放。例如，尽管CFIA(加拿大食品检验局(Canadian Food and Inspection Agency))仅批准焚烧、碱水解和热水解法用于SRM的安全处置，焚烧对于处理特别是大规模处理SRM而言似乎是不切实际的，这部分因为该产业缺乏这种能力以及高的相关成本。现有焚烧炉和碱或热水解设备的有限能力，以及完成破坏SRM的这些方法的成本负担对畜牧业形成巨大问题。预计加拿大每年产生50000到65000吨的SRM(Facklam，2007)。SRM的焚烧不仅耗费能量而且排放大量的温室气体。此外，由这些过程产生的终产物对生产增值副产品毫无用处。
发明简述
本发明的一个方面提供用于降低可能存在于载体材料中的生物有害物质的滴度的方法，包括将载体材料提供给厌氧消化(AD)反应器并在AD过程期间维持生物气产率基本上稳定。
在某些实施方式中，所述生物有害物质包括激素、抗体、体液(例如，血液)、病毒性病原体、细菌性病原体和/或杂草种子。在其他实施方式中，所述生物有害物质包括朊病毒。例如，所述朊病毒可以是羊瘙痒症朊病毒、CWD朊病毒或BSE朊病毒。所述朊病毒可以对蛋白酶K(PK)消化具有抗性。
在某些实施方式中，所述载体材料可以是富含蛋白质的材料。例如，所述载体材料可以是特定风险材料(SRM)。所述SRM可以包括CNS组织(例如脑、脊髓或其片段/组织匀浆/部分)。
如本发明所使用，“富含蛋白质的材料”包括蛋白质含量高(例如，5-100％(w/w)蛋白质、10-50％蛋白质、20-25％蛋白质)的材料，所述蛋白质含量可通过本领域已知的各种蛋白质分析或氮含量分析来测定，例如凯氏定氮法或其衍生/改进、增强的杜马斯法、使用UV-可见光谱的方法及其他测定整体物理性质(bulk physical property)、辐射吸附和/或辐射散射等的仪器技术。
在某些实施方式中，添加的富含蛋白质的材料的氮含量为约5-15％，或约10％。
在某些实施方式中，添加的载体材料(如通过挥发性固体含量测量的)与槽中已有的消化物的比例不超过1∶1(w/w)。挥发性固体含量例如可以通过将样品加热到约550℃并测定挥发性(损失)部分来测定。
在某些实施方式中，AD反应器可以分批方式运行。分批方式可以持续少于约0.5hr、1hr、2hr、5hr、10hr、24hr、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、20天、30天、40天、50天或60天。对于病毒性和细菌性物质，取决于所使用的温度，分批方式通常持续少于约数小时到数天(例如1-7天)。对于特别稳定的物质，例如朊病毒，分批方式通常持续少于约30、40、50或60天。
在其他实施方式中，它可以以半连续方式或连续方式运行。
在某些实施方式中，将富含碳的材料半连续地提供到AD反应器中以维持基本上稳定的生物气产量。所述富含碳的材料可以包括新鲜的植物残体或其他容易消化的纤维素，尽管也可以存在本身不富含碳的其他材料。在某些实施方式中，将富含碳的基质周期性地添加(约1-3％(w/v))至AD反应器。
在某些实施方式中，所述AD反应器在分批方式运行开始时包含微生物的活性接种体。
在某些实施方式中，AD过程通过厌氧微生物的聚生体进行，例如嗜低温性微生物(例如最佳生长条件为约20℃上下的微生物)、嗜中温性微生物(例如最佳生长条件为约37℃上下的微生物)或嗜热性微生物(例如最佳生长条件为超过45-48℃上下，例如55℃、60℃、65℃的微生物)。
在某些实施方式中，所述嗜热性微生物用包含具有丰富β-折叠(β-sheet)的蛋白质的基质驯化。这可有助于去除生物有害物质。
在某些实施方式中，所述嗜热性微生物通过在高温和极端碱性pH下用包含淀粉样物质的基质培养而驯化。所述时间例如可以持续3个月。
在某些实施方式中，该方法还包括添加一种或多种选自Ca、Fe、Ni或Co的补充营养物。
在某些实施方式中，所述AD在约20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或更高温度下进行。
在某些实施方式中，约60天、30天或甚至18天的厌氧消化后实现生物有害物质(例如，朊病毒)的滴度降低2个对数级或更多。
在某些实施方式中，约20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天的厌氧消化后实现生物有害物质(例如，朊病毒)滴度3个对数级或更多的降低。
在某些实施方式中，约30、40、50、60、70、80、90或更多天的厌氧消化后实现生物有害物质(例如，朊病毒)滴度4个对数级或更多的降低。
在某些实施方式中，约10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或更多天的厌氧消化后实现生物有害物质(例如，朊病毒)滴度5、6、7、8或9个对数级的降低。
本发明的另一方面提供用于产生(高质量)生物气的方法，包括将富含蛋白质的原料提供给厌氧消化(AD)反应器，其中在AD过程期间生物气产率基本上保持稳定。
在某些实施方式中，AD反应器可以分批方式运行。
在某些实施方式中，所述AD反应器在分批方式运行开始时包含微生物的活性接种体。
在某些实施方式中，分批方式持续少于约0.5hr、1hr、2hr、5hr、10hr、24hr、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、20天、30天、40天、50天或60天。对于许多病毒性物质，分批方式通常持续少于约数小时。对于某些病毒性物质和许多细菌性物质，分批方式通常持续少于约数小时到数天(例如1-7天)。对于特别稳定的物质，例如朊病毒，分批方式通常持续少于约30、40、50或60天。
在某些实施方式中，在分批方式运行开始后，部分取决于待破坏的蛋白质基病原体的特定种类，生物气产率对于许多病毒性物质而言在大约数小时(例如，0.5-5小时)达到峰值，或对于许多细菌性物质而言在数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)达到峰值，或对于许多朊病毒而言在5-10天达到峰值。
在某些实施方式中，部分取决于待破坏的蛋白质基病原体的特定种类，半连续地将富含碳的材料提供给AD反应器，以维持基本上稳定的生物气产量。例如，在达到峰值生物气产量后，对于许多病毒性物质而言可以每隔大约数小时(例如，0.5-5小时)提供一次富含碳的材料，对于许多细菌性物质而言可以每隔数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)提供一次富含碳的材料，或对于许多朊病毒而言可以每隔5-10天提供一次富含碳的材料。
在某些实施方式中，所述富含碳的材料包含新鲜的植物残体或其他容易消化的纤维素。
在某些实施方式中，所述富含碳的原料包含激素、抗体、体液(例如，血液)、病毒性病原体或细菌性病原体。
在某些实施方式中，富含蛋白质的原料是特定风险材料(SRM)。
在某些实施方式中，所述SRM包含一种或多种朊病毒或病原体。
在某些实施方式中，所述朊病毒包括羊瘙痒症、CWD和/或BSE朊病毒。
在某些实施方式中，所述朊病毒对蛋白酶K(PK)消化具有抗性。
在某些实施方式中，所述SRM包含CNS组织(例如，脑、脊髓或其片段/组织匀浆/部分)。
在某些实施方式中，约60天、30天或甚至18天的厌氧消化后实现朊病毒滴度2个对数级或更多的降低。在某些实施方式中，约20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天的厌氧消化后实现朊病毒滴度3个对数级或更多的降低。在某些实施方式中，约30、40、50、60、70、80、90或更多天的厌氧消化后实现生物有害物质的滴度4个对数级或更多的降低。
在某些实施方式中，所述AD在约20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或更高温度下进行。
在某些实施方式中，进行AD的细菌包括厌氧微生物，例如嗜低温性微生物(例如最佳生长条件为约20℃上下的微生物)、嗜中温性微生物(例如最佳生长条件为约37℃上下的微生物)或嗜热性微生物(例如最佳生长条件为超过45-48℃上下，例如55℃、60℃、65℃的微生物)，的聚生体。
在某些实施方式中，进行AD的细菌用包含具有丰富β-折叠的蛋白的基质驯化。
在某些实施方式中，进行AD的细菌通过在高温和极端碱性pH下用包含淀粉样物质的基质培养3个月而驯化。
在某些实施方式中，该方法还包括添加一种或多种选自Ca、Fe、Ni或Co的补充营养物。
本发明的另一方面提供用于降低可能存在于载体材料中的病毒性生物有害物质的滴度的方法，包括使载体材料与厌氧消化(AD)消化物，优选嗜热性厌氧消化(TAD)消化物，的液体部分接触。
在某些实施方式中，所述接触步骤在约20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下进行。
可以预期本发明描述的所有实施方式，包括单独描述于本发明不同方面的实施方式，只要适用时可以与其他实施方式的特征组合。
附图说明
图1显示将含羊瘙痒症病毒的绵羊和正常绵羊的脑组织匀浆掺入TAD(嗜热性厌氧消化)消化器中并孵育设定的一段时间的结果。数字1到4指示消化后不同的取样时间。将在不同时间点取自TAD-组织混合物的蛋白质通过12.5％SDS-PAGE凝胶分离、纯化和解析，并用ECL基质进行蛋白质印迹检测。消化之前(时间0)从TAD浆料中回收大量朊病毒蛋白质。相反，在不含该组织的TAD对照中什么也没有发现。细胞朊病毒在取样时间1(TAD-正常绵羊脑混合物)消失，但羊瘙痒症病毒在取样时间2(TAD-羊瘙痒症病毒混合物)中完全消除。27kDa的蛋白标志物显示绵羊细胞朊病毒和羊瘙痒症朊病毒的迁移率。
图2说明羊瘙痒症病毒在TAD过程中灭活的先导研究中蛋白质-载荷依赖性的甲烷化。使用包含不同量的羊瘙痒症病毒感染的绵羊脑组织和正常绵羊脑组织(分别为低剂量和高剂量)的相同量的消化物设置TAD。单独的TAD用作对照。与对照组相比，在高剂量的蛋白载荷组(羊瘙痒症和正常绵羊脑)中实现最高的甲烷产生体积，且然后是在低剂量蛋白载荷组(羊瘙痒症和正常绵羊脑)中。这明确显示TAD中给定水平的蛋白载荷增加提高生物气产量和CH4/CO2比例，因此增加生物气的燃料值。
图3显示厌氧消化中消化后的羊瘙痒症朊病毒样品的评估策略。
图4是基于对培养细胞的病毒感染(细胞病变效应，CPE％)评估的时间和剂量依赖性病毒灭活的总结。
图5显示在TAD消化处理中存在或不存在其他纤维质基质的情况下，羊瘙痒症朊病毒(S.prion)在第11、18和26天时不同程度的减少。使用αInnotech图像分析仪对图像进行定量。
发明详述
本发明部分地基于厌氧消化(AD)系统中的某些生物有害物质的峰值破坏与峰值生物气产生一致的发现。这种生物有害物质可以存在于载体材料中，且可以包括杂草种子、某些富含蛋白质的病原体或不合需要的顽固性材料(例如，激素、抗体、病毒病原体、体液(例如，血液)、细菌性病原体等)或特定风险材料(SRM)内的朊病毒。不希望束缚于任何特别的理论，预期在高的生物气产率下，微生物活性较高或者微生物生长率较高，因此增加了破坏这种生物有害物质的机会和/或速率。
本发明也部分基于厌氧消化(AD)系统，特别是TAD系统内的某些小分子可以灭活至少某些病毒性感染物质的发现。因此这些分子(由液体厌氧性消化物纯化或未纯化)可用于灭活病毒物质。
本发明还基于将碳水化合物基的基质(例如纤维素或纤维素型物质)周期性地添加到消化器中可以加速或增强病原体滴度的降低的发现。碳水化合物基的基质可以约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、8％、10％、15％的w/v百分比，或两个所提及值之间的任何百分比(由碳水化合物基的基质的重量(克)相对于消化物体积(mL)测定)添加。一次或多次碳水化合物基的基质的添加可在消化期间进行。添加碳水化合物基的基质的间隔可以是基本上相同(例如，添加之间间隔约7-8天)或不同。添加时机优选基本上和生物气产率一致，例如，恰在峰值生物气产生预期下降的时间之前或该时间左右添加。
因此，一方面，本发明提供用于降低可能存在于载体材料中的生物有害物质的滴度、量或有效浓度的方法，包括将所述载体材料提供给厌氧消化(AD)反应器并在生物气产量到达峰值速率后维持生物气产率在AD过程中基本上稳定。所述AD反应器可以以分批方式、半连续方式或连续方式运行。
气体产率可以按照任何工业标准方法测定，只要一致的方法用于监控气体产率。适当的方法包括测量气体压力、气体流速等。甲烷与二氧化碳的比率也可用于该目的。
几乎任何生物有害物质/试剂可以成为所述方法的目标，包括细菌性病原体(例如大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌)、病毒性病原体(例如，HIV/AIDS、小核糖核酸病毒，例如口蹄疫病毒(FMDV)、马传染性贫血病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，又名蓝耳猪病、猪环病毒2型、牛疱疹病毒1、牛病毒性腹泻(BVD)、边界病病毒(绵羊中)和猪瘟病毒)、寄生病原体、朊病毒、不需要的激素、血液及其他体液。
一种特别类型的生物有害物质，朊病毒(羊瘙痒症朊病毒、CWD朊病毒或BSE朊病毒等)是特别令人感兴趣的。这种朊病毒可以对蛋白酶K(PK)消化具有抗性，且可以存在于富含蛋白质的载体材料中，例如特定风险材料(SRM)中。
如本发明所使用的，“特定风险材料”是指源自潜在携带和/或传播TSE朊病毒(例如BSE、羊瘙痒症、CWD、CJD等)的任何年龄的任何动物的组织的通用术语。这些可以包括颅骨、三叉神经节(与脑连接并接近于颅骨外部的神经)、脑、眼、脊髓、CNS组织、回肠末端(小肠的一部分)、脊根神经节(与脊髓连接并接近于脊柱的神经)、扁桃腺、肠、脊柱及其他器官。
如本发明所使用的，“分批方式”是指在AD过程中不将液体或固体材料从反应器中去除的情况。优选地，AD过程所需的原料及其他材料在分批方式运行开始时提供给反应器。然而，在某些实施方式中，其他材料可以添加到反应器中。
相反，以连续方式或半连续方式，固体和液体连续地或周期性地(分别)从AD反应器中去除。
例如，AD反应器可以例如在分批方式运行开始时包含微生物的活性接种体。微生物的活性接种体可从先前批次的运行中获得，任选地利用稀释以调节AD反应器中的接种体和原料的适当体积。一个相关的优点是在运行开始时接种体内的微生物早已激发以按最佳速率生成生物气，这样峰值生物气产率可以在相对短的时间内，例如约5-10天的时间实现。
由于生物气产率的天然波动，“基本上稳定”是指生物气产率一般偏离平均值不超过50％，优选不超过40％、30％、20％、10％或更少。基本上稳定的气体产生速率可以通过周期性地将适量其他基质(优选不包含大量待破坏的病原体(以分批方式运行)的那些)在峰值或平台气体产率即将下降的时间点附近添加到厌氧消化反应中来维持。
在某些实施方式中，达到峰值生物气产量后，富含碳的材料也可以半连续的方式每隔约5-10天一次提供给AD反应器，以维持基本上稳定的生物气产量。有许多合适的可用于本发明的富含碳的材料。在某些实施方式中，所述富含碳的材料可以包括新鲜的植物残体或其他容易消化的纤维素。
AD过程优选在嗜热性条件下进行，且这种嗜热性厌氧消化(或“TAD”)显示有效地去除多种生物有害物质，例如SRM(特定风险材料)，包括含有各种朊病毒的材料。TAD为SRM破坏提供若干优点，包括其热效应、高pH下的液压批均质系统、酶促催化反应的协同效应、挥发性脂肪酸和/或厌氧细菌菌落的生物降解。TAD过程也具有允许SRM安全地用作产生生物气及其他副产物的生物质/原料来源的增加优点。
因此在某些实施方式中，AD反应器的温度控制在大约20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或以上，以促进嗜热性厌氧消化(TAD)过程。在某些优选实施方式中，所述AD过程通过嗜热性微生物，例如嗜热性细菌或古细菌的聚生体进行。
优选地，TAD过程的起始pH为约8.0，或pH为约7.5-8.5。如有必要，pH调节剂或缓冲剂可以定期地加入反应器中，以在整个AD过程中将pH控制在所需水平。
在某些情况下，常规TAD可能完全或不完全破坏朊病毒或其他的生物有害物质/病原体，可能是因为缺乏特定催化作用所需的必要厌氧细菌菌落和酶。因此在某些情况下，可以使厌氧微生物驯化，以便它们更适于破坏预定目标。例如，在朊病毒的情况下，可用含有具丰富β-折叠的蛋白质的基质进行驯化。例如，选定的厌氧消化物可在高温和极端碱性pH下用包含淀粉样物质的特定基质培养约3个月。使用这种驯化的微生物的培养物还可通过监控并调节生物气产生特征、组成和总氨氮(TAN)来优化，以确保不发生厌氧消化的抑制。在某些实施方式中，可以添加补充营养物(例如Ca、Fe、Ni或Co)以增加作为挥发性脂肪酸(VFA)的丙酸的去除。
任选地，厌氧微生物菌落在驯化期间的遗传进化可通过基于实时PCR的基因分型使用专门设计的引物和探针来分析。此外，可测定这些驯化厌氧微生物批次的净化能力，并就朊病毒的去除率与常规TAD进行比较。
任何种类的病毒性病原体的破坏可通过所述方法实现。可使用所述方法破坏的示例性(非限制性)的病毒性病原体(或包含这类病毒性病原体的生物有害物质)包括：流感病毒(正粘病毒)、冠状病毒、天花病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、西罗尼(West Nile)病毒、牛痘苗病毒(vaccinia virus)、呼吸道合胞体病毒、鼻病毒、动脉炎病毒、线状病毒、细小核糖核酸病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、乳多泡病毒(pap ova virus)、疱疹病毒、痘病毒、荷德门病毒(headman virus)、星状病毒(atrocious)、柯萨奇氏(Coxsackie)病毒、副粘病毒科、正粘病毒科、艾柯病毒、肠道病毒、心病毒属、外衣病毒、棒状病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、博尔纳病毒、腺病毒、细小病毒、黄热病病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒及其他肠道病毒。其他的病毒性病原体包括对动物健康有害的那些，特别是在家畜动物中发现并造成各种病毒性疾病的那些。这些病毒可以存在于家畜动物的疾病组织中。
任何类型的细菌性病原体的破坏可使用所述方法实现。可使用所述方法破坏的示例性(非限制性)的细菌性病原体(或包含这类细菌性病原体的生物有害物质)包括：引起肠感染的细菌，例如大肠杆菌(特别是产肠毒素的大肠杆菌和大肠杆菌菌株O157:H7)，该细菌对城市废水处理造成压力；引起食品相关的李斯特菌病爆发的细菌，例如单增李斯特菌(Listeria M.)，引起细菌性小肠结肠炎的细菌，例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、沙门氏菌EPEC(Salmonella EPEC)和艰难梭菌(Clostridium difficile)。
任何类型的寄生性病原体的破坏可使用所述方法实现。可使用所述方法破坏的示例性(非限制性)的寄生性病原体(或包含这类寄生性病原体的生物有害物质)包括：贾兰第鞭毛虫(Giardia lamblia)和隐孢子虫(Crytosporidium)。
真菌或酵母病原体也可使用所述方法消除。
任何包含病原体的材料可以用于本申请的方法。例如，在某些医院(包括兽医院)或保健机构，患者(人类或非人类动物)粪便和/或体液(例如，血)可能是病毒、细菌和/或寄生性病原体的丰富来源，其应该在释放到公共水体或废物处理之前排除污染。这种生物废弃材料可以用作本发明方法的载体材料。
许多类型的朊病毒的破坏可使用所述方法实现。如本发明所使用，“朊病毒”包括在各种哺乳动物中引起各种形式的传染性海绵状脑病(TSE)的所有传染剂，包括绵羊和山羊的羊瘙痒症朊病毒、白尾鹿、麋鹿和长耳鹿的慢性消耗性疾病(CWD)朊病毒、牛的BSE朊病毒、水貂的传染性水貂脑病(TME)朊病毒、猫的猫样海绵状脑病(FSE)朊病毒、林羚、羚羊和旋角大羚羊(greaterkudu)的怪异偶蹄蹄类脑病(EUE)朊病毒、鸵鸟的海绵状脑病朊病毒、人类的克雅氏病(CJD)及其多种朊病毒(例如医源性克雅氏病(iCJD)、变异型克雅氏病(vCJD)、家族性克雅氏病(fCJD)和偶发性克雅氏病(sCJD))、人类的吉斯曼-史特斯勒-先克(GSS)综合征朊病毒、人类的致死性家族性失眠症(FFI)朊病毒和人类的苦鲁病朊病毒。
如有必要，某些真菌性朊病毒样蛋白也可使用所述方法破坏。这些包括：酵母朊病毒(例如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的那些)和柄孢霉(Podospora anserina)朊病毒。
也可以调节用于所述方法中的朊病毒或其他的生物有害物质/蛋白质性病原体的量。在某些实施方式中，约每60到75ml的TAD-组织混合物中存在约1-10g或约2.5-5g当量的含朊病毒的组织匀浆。对于蛋白载荷接近该范围上限的TAD-组织混合物，可以根据本发明描述的方案将约1g的富含碳的材料(例如纤维素)添加到每约60-75ml的TAD-组织混合物中。
在某些实施方式中，AD反应器包含至少约5、6、7、8或9％的最终总固体组分。
在某些实施方式中，所述朊病毒对蛋白酶K(PK)消化具有抗性。
在某些实施方式中，所述SRM包括CNS组织，例如来自脑、脊髓或其片段/组织匀浆/部分的组织。
在某些实施方式中，所述分批方式运行持续少于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120天。在分批方式运行结束时，生物有害物质/朊病毒的滴度降低至少约2、3或4个对数级。例如，在某些实施方式中，在约60、30或甚至18天的厌氧消化后，实现生物有害物质/朊病毒滴度2个对数级或以上的降低。在其他的某些实施方式中，在约20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天的嗜热性厌氧消化后，实现生物有害物质/朊病毒滴度3个对数级或以上的降低。在某些实施方式中，在约30、40、50、60、70、80、90或更多天的嗜热性厌氧消化后，实现生物有害物质/朊病毒滴度4个对数级或以上的降低。
本发明也部分基于可使用富含蛋白质的原料实现增强的厌氧消化生物气(例如，甲烷或CH4)产生的发现。此外，生物气产生还可通过将富含碳的材料(任选和其他富含蛋白质的材料一起)半连续地提供给AD反应器来增强，从而维持AD过程期间生物气产率基本上稳定，优选还具有高质量(即，CH4高于50、55、60、65或70％)。虽然不希望束缚于任何特定理论，观察到的增强的生物气产生提示AD过程允许存在于AD生物反应器中的各种微生物分解富含蛋白质的原料，从而为微生物生长以及最终的甲烷产生补充氮和/或碳(即甲烷生成是高效的)。
因此一方面，本发明提供用于产生生物气(优选具有较高燃料值和高质量)的方法，包括将富含蛋白质的原料提供给厌氧消化(AD)反应器，其中在到达生物气产生的峰值速率后，在AD过程期间维持生物气产率基本上稳定。
在某些实施方式中，所述AD反应器可以以分批方式运行。在其他实施方式中，AD反应器可以以连续或半连续方式运行，其中AD过程期间连续或周期性地添加固体/液体和从反应器中去除固体/液体。
无论何种运行方式，富含碳的材料可在AD过程期间提供给反应器，以维持生物气产生的峰值速率。例如，在分批方式中，富含碳的材料可以在达到峰值生物气产率后每约5-10天一次半连续或周期性地提供给AD反应器，以维持基本上稳定的生物气产量。这种富含碳的材料可以包括新鲜的植物残体或任何其他容易消化的纤维素。在连续或半连续方式运行中，富含碳的材料和任选的富含蛋白的原料可以一起或顺序地/交替地添加，以维持生物气产生的稳定状态。
在某些实施方式中，所述分批方式运行可以持续小于约30、40、50、60、70、80、90、100、110或120天。
在某些实施方式中，生物气燃料值(由甲烷对CO2之比定义)大致与原料的蛋白含量成正比(或者正性相关)。在最佳条件下，蛋白质降解在AD过程的最初5-10天期间迅速发生。在这期间，峰值蛋白质降解与峰值生物气产率一致。
几乎任何富含蛋白质的原料可用于本发明。在某些实施方式中，所述富含蛋白质的原料是特定风险材料(SRM)。例如，SRM可以包括一种或多种朊病毒或病原体。这种SRM可以包括CNS组织(例如脑、脊髓或其片段/组织匀浆/部分)。朊病毒可以包括羊瘙痒症、CWD和/或BSE朊病毒等(如上)。在某些实施方式中，所述朊病毒对蛋白酶K(PK)消化具有抗性。如果包含朊病毒的SRM用作富含蛋白质的原料，则优选分批方式。
在其他实施方式中，富含蛋白质的原料可以包含激素、抗体、病毒性病原体或细菌性病原体或任何其他的蛋白质性物质。
本发明的另一方面提供蛋白提取方法，以实现厌氧消化物的朊病毒蛋白质的最大回收。该方法可以单独使用，也可和传统的化物化学技术(例如蛋白质印迹法(WB)和任何商业化BSE-羊瘙痒症病毒测试试剂盒等)组合使用，以检验并记录TAD过程期间和之后朊病毒的消除率。优选地，该分析可包含一系列阳性对照。
本发明的另一方面提供测定消化后样品中残余朊病毒的存在和/或相对量的方法。所述方法可以包括用于朊病毒检测的一种或多种技术，或其组合。在优选的实施方式中，如图3所示，在AD过程期间的任何给定时间获得的消化后样品可以进行连续多轮分析，包括EIA、蛋白质印迹法(WB)、iCAMP和转基因小鼠的生物分析，从而仅当前一水平(较不敏感，但是更便宜/更容易/较快)的分析不能确认样品中朊病毒的不存在时才进行下一水平(更敏感，但是昂贵/更困难/较慢)的分析。
例如，如果EIA足以检测朊病毒的存在，将不必进行更复杂的分析以确认朊病毒的存在。只有当EIA不能检测朊病毒时，WB才对于下一水平的分析变得有必要。
类似地，在某些实施方式中，当WB在进行多次测试后仍不能检测朊病毒时，则可使用称为错误折叠蛋白的体外循环扩增(iCAMP)的高灵敏度检测方法来验证在TAD排放物中不存在朊病毒(由此验证朊病毒的破坏)。在某些实施方式中，反复阴性的iCAMP样品可再用例如用于基于小鼠的生物分析来进行检验，以确定朊病毒净化的生物安全终点并确保向环境零排放任何朊病毒。
这些朊病毒检测方法是本领域熟知的。参见Groschup和Buschmann，Rodent Models for Prion Diseases，Vet.Res.39：32，2008(以引用方式合并于此)。例如，若干转基因小鼠模型(例如，Tg 20)可用于验证朊病毒/羊瘙痒症病毒在AD灭活前后的传染性及传播性。朊病毒研究中这种转基因小鼠的大多数是已敲除其内源性朊病毒基因的敲除小鼠。它们通常对朊病毒病原体(包括来自不同物种的朊病毒病原体)具有较高易感性。朊病毒表现的症状-感染动物脑组织的病理改变-可使用免疫组织化学方法来检测或验证，该方法是用于诊断朊病毒疾病的最可靠分析之一。
例如，US 2002-0004937A1描述了这样一种用于朊病毒检测的转基因小鼠模型，包括将动物的朊病毒基因(例如，人类、牛、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠、水貂、羚羊、黑猩猩、大猩猩、恒河猴、绒猴和松鼠猴等的朊病毒基因)引入小鼠(优选已敲除其内源性朊病毒基因的小鼠)中以产生朊病毒基因改造小鼠，并确定当朊病毒基因改造小鼠表现心脏异常时朊病毒基因是异常的。使用该小鼠，可例如通过以下方式来测定AD前后的朊病毒滴度：用样品(AD之前/之后)接种转基因小鼠，并观察朊病毒基因改造小鼠中心肌病的存在。掺有已知滴度的相同类型的对照朊病毒的样品可用于相同实验中以定量测定本发明TAD过程之前/之后的朊病毒滴度。
更具体地说，为用于本发明中，例如在第30天或之后(其中无朊病毒蛋白可通过蛋白质印迹或“WB”检测)获得样品，并过滤以灭菌。然后约50到80μl(通常小于约100μl)的灭菌样品注入麻醉状态的选定的转基因小鼠的脑中，且在相同品系的小鼠中使用未消化的朊病毒/羊瘙痒症病毒作为对照。观察天数通常为接种后100到150天。在较早时间点，例如第18、11或甚至第6天(当WB可以显示可检测水平的朊病毒/羊瘙痒症病毒)获取的较早样品用于平行试验，以确定AD基本上消除样品中的活性朊病毒的时间段。这种类型的生物分析使得可以确定朊病毒/羊瘙痒症病毒是否已经失去其传染性，即使朊病毒蛋白质本身仍可通过WB检测到。
本领域可获得最合适的转基因小鼠，包括从商业机构(例如，JacksonLaboratory)获得。
在某些实施方式中，可使用质谱法及其他蛋白质组工具来研究消化后样品中的朊病毒灭活的机制及其构象变化(参见图3)。该下游研究可以进一步扩展朊病毒结构及其相关发病机理的一般知识，并为基础研究人员提供协同的机会以探索朊病毒的基本知识和开发用于治疗人类朊病毒相关疾病(例如CJD)的药物。
根据本发明可以实现多个优点。例如，可通过TAD在30天、60天或100天内完全破坏朊病毒(羊瘙痒症或BSE等)及其传染性。同时，与常规厌氧消化相比，TAD过程可以利用含有经消毒朊病毒的富含蛋白质的SRM，而非需要高成本处理来进行恰当处置的废物材料，从而增加生物气的燃料值。因此，可同时实现多种社会和经济效益，包括允许养牛业以经济的方式处理SRM，满足某些政府规章，保护环境免受朊病毒病原体的可能污染，降低处置通过其他方法处理的SRM造成的环境足迹，且同时产生有价值的生物气。因此，嗜热性厌氧消化过程可以良好地经由酶促催化和系统中厌氧细菌菌落的生物降解的组合来有效地消除SRM中的朊病毒，并将富含蛋白质的SRM转化为生物能和生物肥料。
具体实施方式
上文已对本发明进行大致描述，下面部分提供阐明本发明的一般原理的例举性试验设计。所述实施例仅用于解释目的，而非在任何方面进行限制。
另外，尽管一些以下实施例基于朊病毒蛋白，但预期在相似实验中，基于其它较不稳定的蛋白质基生物有害材料，包括激素、抗体、病毒性病原体、细菌性病原体和/或杂草种子等的表现相似(如果不是相同的话)。
实施例1：嗜热性厌氧消化(TAD)过程消除羊瘙痒症朊病毒并提高生物气产量
羊瘙痒症朊病毒(一种对蛋白酶K(PK)消化具有很强抗性的朊病毒)用作该实验中的模型，以阐明TAD过程对朊病毒破坏的有效性。
将高(4g)和低(2g)剂量的羊瘙痒症脑组织匀浆(20％)掺入实验室规模的TAD消化器中，并将温度设置在55℃。以分批方式持续消化最长90天。在第0、10、30、60和90天从实验组和对照组中采集约5mL消化物用于评估羊瘙痒症病毒降解。使用含0.5％SDS的缓冲液从消化物中回收羊瘙痒症病毒(PrPsc)(从CFIA国家参考实验室(CFIA National Reference Lab)获得)及细胞朊病毒(PrPc)(回收率为约75到82％)。将细胞朊病毒和羊瘙痒症朊病毒两者在12.5％SDS-PAGE凝胶中解析并通过免疫印迹法使用单克隆抗体(F89，Sigma)检测。使用微气相色谱法(GC)常规地监控生物气产生，以评估厌氧菌活性和评价富含蛋白质的基质对生物气产生的作用。
结果显示羊瘙痒症病毒以时间依赖性的方式降解。尽管在大约第10天细胞朊病毒已经消失，但在第30天在TAD消化器中没有观察到羊瘙痒症病毒带。基于电脑辅助的半定量免疫印迹法图像估计，在30天内羊瘙痒症病毒减低至少约2.0个对数级或更多。同时，在富含蛋白质的TAD中生物气产生及其燃料值(甲烷与CO2之比)明显增强。在90天的AD消化期间，以高剂量蛋白(384.42±6.54NmL)获得比无蛋白的TAD对照(145.93±10.33NmL)高约2.6倍的甲烷和在低剂量蛋白TAD(284.39±2.02NmL)中获得约1.9倍高的甲烷。
数据表明，分批TAD可有效地用作生物和环境友好的方法以净化SRM中的朊病毒，并将生物有害物质的SRM转化成用于生产生物气及其他增值副产物的安全原料。该方法不仅降低朊病毒的环境足迹，而且对养牛业和本地社区产生经济效益。
实施例2：在最佳条件下分批TAD中BSE消除的效力和动力学
具有证实的BSE的牛脑组织及其他类型的SRM组织(例如脊髓、淋巴结或唾液腺)从CFIA国家BSE参考实验室获得，并在冰上在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。基于上述研究的结果，将单独的20％脑组织匀浆或与其他组织混合的组织匀浆掺入稀释的消化物(最终总固体为约7％)中，该消化物新从Vegreville的IMUSTM示范工厂获得。在生物安全III级实验室(例如，在Laboratory Building of Alberta Agriculture and Rural Development)的生物安全柜(IIB级)中进行整个程序。在低和高剂量组的TAD-组织混合物中，组织匀浆的最终含量分别为约2.5和5克(新鲜组织当量)。然后将混合物置于带螺旋盖的安全涂覆的玻璃瓶中。在温度设置为55℃且pH为8的培养箱中开始厌氧消化，并设置特定对照(研究设计参见表1)。
表1、实验设计
*纤维素作为富含碳的材料添加给消化混合物以提供额外的碳水化合物且可增强厌氧细菌的消化活性。
灭活消化物对照(IC)设计用来检查是否无活细菌活性的静止消化混合物中的BSE(B)降解。额外的对照组(N)包括含细胞朊病毒的正常牛脑组织匀浆。这使得可检查在消化过程期间细胞朊病毒的消除速率。细胞朊病毒和BSE朊病毒之间的相关性预测BSE朊病毒在TAD过程中的相对消除速率。
也设计了类似实验来比较含牛脑组织及其他类型SRM组织混合物的TAD消化和单独的牛脑。
用压力传感器和气相色谱法监测生物气产生和组成。在第0到第120天在不同的时间点评估BSE朊病毒净化的时程。在各时间点，使用已建立的方法提取、浓缩和纯化样品的总蛋白，并使用SDS-PAGE、具有识别不同表位的特异性单克隆抗朊病毒抗体的蛋白质印迹法(WB，Schaller等，1999，Stack，2004)来进行分析。将消化后样品中的BSE朊病毒的降低与相同批次的BSE脑组织匀浆和在零时获取的样品的一系列10倍稀释液进行比较。使用密度测定法分析WB图像从而半定量在不同时间和使用不同组织混合物的BSE朊病毒的降低。对所有通过WB检测的阳性样品而言，样品进行蛋白酶-K消化以检查在TAD过程期间BSE朊病毒的抗性是否已经改变。
使用等当量的含有细胞朊病毒(PrPc)的牛脑组织匀浆作为对照来评估TAD中BSE消除的动力学。比较在消化过程中不同时间点的牛PrPc和BSE朊病毒的破坏率。在连续的时间点BSE的一系列消除百分位提供在该过程中BSE破坏的相对动力学。
实施例3：具有用于评估BSE朊病毒完全破坏的高灵敏度的体外循环扩增错误折叠蛋白质(iCAMP)分析
朊病毒蛋白(例如，prpsc)的异常同型体甚至在经受常规灭菌过程后依然保持传染性。用于检测传染性的灵敏方法是生物分析。然而，这种生物分析的结果仅能在数百天后获得。因此，错误折叠蛋白质的循环扩增(CAMP)提供具有吸引力的替代方法，其中可在体外扩增prpsc以评估朊病毒灭活。由于三轮CAMP仅需要约6天，CAMP比传统生物分析快得多。
本发明发展了用于评估TAD中BSE朊病毒净化完成的体外循环扩增错误折叠蛋白质(iCAMP)方法。简言之，在转换缓冲液中制备正常牛脑和具有BSE的牛脑的10％(w/v)组织匀浆。具体地，将iCAMP使用含有不同量的BSE朊病毒(0.0001到1g的组织当量)和相当量的10％(w/v)正常脑组织匀浆基质的50μL体积建立。使用具有微板探头(microplate horn)的可编程超声波仪(例如Misonix S-3000型)在37℃下进行扩增。使用以下条件优化扩增参数：循环：40到150次；接通功率：90到240W；脉冲时间：5到20秒；及间隔：30到60分钟。用WB(蛋白质印迹)和PK消化确认iCAMP的结果。
在评估策略中，如果在TAD消化后没有由WB检测到BSE朊病毒，则使用iCAMP对该样品进行扩增。经纯化的消化后样品用作“种子”，使用含PrPc的10％(w/v)牛脑组织匀浆作为用于iCAMP扩增的基质。含有BSE的脑组织匀浆的连续稀释液作为阳性对照。如果仍存在单一基序的错误折叠的BSE朊病毒蛋白质，则由iCAMP以指数方式增加错误折叠的BSE朊病毒的量。iCAMP的灵敏度能够检测单一基序的BSE朊病毒蛋白质(参见Mahay ana等，Brioche Biophysics Rees Common 348：758-762，2006)。如果150次循环后仍检测不出残余BSE，则其表明TAD过程已经完全清除BSE。iCAMP能够快速且有效地筛选消化后样品中可能残余的BSE朊病毒，因此节省了原本将在基于动物的生物分析中耗费的时间和金钱。
将朊病毒脑内接种到小鼠或仓鼠中是用于评估PrPSC传染性的典型生物分析(Scott et al.，Arch Virol(Suppl)16：113-124，2000)。由于其对BSE感染的易感性，将过表达全长牛PrP(Tg BoPrP)的转基因(Tg)小鼠或近交系转基因小鼠用于该目的(Scott等，Proc Natl Acad Sci USA 94：14279-14284，1997；Scott etal.，J Virol 79：5259-5271，2005)。具体地，经由颅骨环钻在无菌条件下将约50μL的滤液-无菌的iCAMP阴性样品接种到小鼠脑中。持续观察250天或直到发生临床征象。通过WB检测的一些低级阳性样品和WB阴性/iCAMP阳性样品也进行小鼠生物分析(图3，评估策略)。这些分析能够确定在消化后TAD过程中BSE朊病毒的传染性是否已消除或改变。获取脑样品以使用特异性抗体对其进行BSE消毒的免疫组织化学确认(Andreoletu，PrPsc immunohistochemistry.In Techniquesin Prion Research，Edited by Lehmann S and Grassi J，p 82，BirkhauserVerlag，Basel，Switzerland.2004)。
实施例4：TAD中BSE朊病毒消毒的机制
预期TAD中BSE朊病毒的传染性的完全净化由BSE朊病毒蛋白质全部降解或实质结构和构象的变化所产生(Paramithiotis等，2003，Brown，2003，Alexopoulos等，2007)。使用构象分析及当前技术的质谱法进一步研究这些变化(Moroncini等，2006，Domon and Aebersold，2006)。
质谱法(MS)可以确定肽共价结构及其改变。从消化后样品中分离蛋白质，将其分级分离并消化成肽(Lo等，2007，Reiz等，2007a)。鸟枪(shotgun)和/或比较模式分析用于MS分析中。对任意两组比较样品(例如消化和未消化样品)的蛋白质组变化进行相对定量，其中首先使用两个样品中肽的差异稳定同位素标记，随后进行液相色谱MS(LC-MS)分析(Ji等，2005a.b.c)。该方法选择性检测并定量该两个样品中具有高丰度和/或序列改变的蛋白质。最近研究表明，包括错误折叠的朊病毒集合体的各种朊病毒构造都可使用或不使用胰蛋白酶充分消化，且使用微波辅助酸水解(MAAH)获得100％序列覆盖率(Zhong等，2004 and 2005；Wang等，2007；Reiz等，2007b)。
为确定BSE朊病毒是否被TAD降解，通过使用MAAH、同位素标记、LC-MS和/或MS/MS来探测因氨基酸修饰和/或构象变化所导致的结构改变。如果BSE朊病毒已被TAD降解，则由LC-MS/MS鉴定所得肽，LC-MS/MS可用于确定参与切割特异性氨基酸位点的可能的蛋白酶。
嗜热性厌氧菌及其蛋白酶在破坏BSE朊病毒中起着重要作用。用16S核糖体RNA基因的基于实时PCR的基因分型来鉴定含有BSE朊病毒的TAD消化器中的许多厌氧细菌物种(Ovreas等1997)。用azocoll分析进行TAD-BSE混合物和/或细菌分离物的上清液内的蛋白水解活性的功能分析。所有这些分析有助于理解BSE朊病毒破坏的机制，其可获得BSE净化策略的优化以及发现朊病毒相关疾病的潜在药物。
实施例5：使用富含蛋白质且含有消除污染的BSE朊病毒的材料作为原料来增加生物气的燃料值
初步结果表明在羊瘙痒症病毒灭活的先导研究中生物气产生(CO2加上CH4)的蛋白质载荷依赖性增加(参见实施例1)。在消化过程期间，含有高和低剂量的羊瘙痒症病毒和对照脑组织的TAD中的累积甲烷比无蛋白质的TAD对照分别高约2.75倍和1.70倍(图2)。
在该实验中，比较仅含有BSE脑的TAD消化器的生物气产生特征和含有与定义为SRM的其他类型组织混合的BSE脑组织的TAD消化器的生物气产生特征。如果生物气特征未显示差异，则指示厌氧微生物以类似方式处理不同来源的源自组织的蛋白质。WB的比较结果进一步提供是否通过在TAD消化器中混合BSE脑组织和其他类型的SRM组织影响BSE朊病毒净化的证据。已表明，因消化物中的蛋白质/氨基酸富集所致的氨水平的增加抑制TAD(Sung和Liu，2003；Hartmann等，2005)。为减轻该效应(如果有的话)，可以分别用现有的计算机化先导设计以及在分批消化器中优化在TAD中作为原料的蛋白质载荷量。
为进一步改良该系统，可在TAD过程期间汽提生物气中的氨。例如，可通过任何氨吸附材料(例如US 20080047313A1中描述的那些，其以引用方式合并在本文中)来捕获氨，该材料将氨(NH3)转化为(NH4)2SO4或其他化合物。所捕获的氨(例如(NH4)2SO4)可以结合至TAD流出物中并随后经进一步处理以产生生物肥料。该集成技术不仅确保TAD过程的生产率和BSE朊病毒破坏的高效率，而且还增加生物气燃料值和TAD流出物作为生物肥料的市场价值。
实施例6：使用嗜热性厌氧消化的病毒灭活
该实施例提供嗜热性厌氧消化(TAD)过程能够灭活模型病毒及其传染性的证据。该实施例也提供有关TAD对模型病毒的剂量和时间依赖性灭活的数据。此外，该实施例为研究在病毒消毒中发挥作用的TAD的特定成分(例如，酶、VFA、温度、pH)提供平台。
用于该研究的模型病毒是鸟疱疹病毒(ATCC菌株N-71851)，一种DNA病毒。该病毒造成传染性鸟喉气管病(ILT)的爆发以及鸡的死亡。用于该研究的易感细胞系是LMH(ATCC CRL-2117)，一种肝细胞癌上皮细胞系。鸟疱疹病毒体外感染LMH细胞培养物诱导细胞病变效应(CPE或细胞死亡)。
根据研究设计，通过在37℃和5％CO2下孵育感染ILT病毒的LMH细胞培养物来制备浓缩的传染性病毒母液。将所得的浓缩传染性病毒母液与TAD滤液混合，所述TAD滤液通过以下方式获得：离心TAD消化物(55℃厌氧消化)，并分别通过0.45μm和0.22μm过滤器来过滤上清液。在37℃下孵育该混合物不同时间(见下文)。
孵育后，将固定量的混合物等分试样施加于盖玻片上生长的单层LMH细胞上。然后细胞在37℃下孵育约24-72小时，并在显微镜下检查结果。
结果显示，将ILTV母液与TAD(嗜热性厌氧消化)浆料(在大约10000xg下离心并通过0.45μm和0.22μm过滤器过滤，具有或不具有中和pH(原始pH为约8.0))预孵育仅30分钟就可阻止所培养的LMH细胞中出现CPE。该结果表明TAD滤液中的一些分子抑制或灭活ILTV，因为双重过滤后的滴定液中没有任何活的细菌或病毒。
也测定在30分钟预孵育后TAD滤液的剂量依赖性病毒灭活。结果表明，ILTV的组织培养物感染剂量(TCID50)是108稀释的母液病毒。当ILTV母液∶TAD滤液之比为1∶1时，在第2天发生广泛性CPE。当ILTV母液∶TAD滤液之比为1∶4时，在第4天发生中度CPE。相反，当ILTV母液∶TAD滤液之比为1∶10、1∶20或1∶100时，不发生CPE。结果概括于下表。
表2、剂量依赖性病毒灭活
*可检测TCTD50为1x10-8
也研究TAD滤液∶ILTV母液之比为1∶1时的时间依赖性病毒灭活。发现在病毒母液与TADF一起于37℃下一起孵育0、10、30分钟后，第2天接种培养物中发生广泛性CPE。在病毒母液与TADF一起于37℃下孵育60分钟后，第3天接种培养物中发生中度CPE。在病毒母液与TADF一起于37℃下孵育120分钟后，第3天接种培养物中发生最小CPE。结果概括于下表。
表3、时间依赖性病毒灭活
*ILTV∶AD滤液＝1∶1
表2和3的结果概括于图4中。
该实施例中描述的实验提供以下证据：当将传染性病毒母液与滤液一起预孵育时，单独TAD滤液(没有厌氧菌)可以剂量和时间依赖性方式消除ILT病毒的传染性。尽管TAD滤液中的蛋白酶或其他生物活性酶似乎并非病毒灭活的主要决定因素，但给定浓度(例如＞250ppm)下的挥发性脂肪酸(VFA)可在病毒灭活中发挥作用。
尽管该实验使用ILT病毒，但在本发明所述的TAD过程中可有效地破坏其他病毒，特别是相同家族(包括人类病毒)中的其他DNA病毒。尽管不希望受限于任何特定理论，病毒破坏可能是TAD消化系统中小的代谢分子和复杂厌氧细菌菌落之间的协同效应的结果。
可使用任何本领域公认的方法，例如GS-MASS或HPLC-MASS和核酸测试来确定对于病毒消毒至关重要的小分子的确切身份。
实施例7：使用嗜热性厌氧消化(TAD)过程去除传染性喉气管炎病毒(ILTV)的传染性
传染性喉气管炎(ILT)是由疱疹病毒所引起的家禽的上呼吸道疾病。它是加拿大艾伯塔的地方性报道的疾病。由于其地方性，其在经济上对于地方性养禽业很重要。在家禽集中生产区域和在疾病爆发期间，该病毒引起鸟类巨大损失和产蛋量减少。
在鸟类死后，该病毒可在其气管组织存活最长达44小时。尽管可通过有机溶剂和高温(55℃和更高)来灭活ILT病毒(ILTV)，但本发明所述TAD过程提供更经济且对环境可靠的方式来破坏该病毒。
在该实验中，在特定的无病原体鸡胚和鸟类连续细胞系(鸡肺细胞)中成功培养ILTV。该细胞对该病毒高度易感，且在感染后3到4天显示特征性细胞病变效应(CPE)。可直接在显微镜下或使用间接荧光试验(IFAT)来方便地鉴别ILTV感染的细胞。
在第一组实验中，将等体积ILTV(激发剂量为100000TCID 50)和来自活性TAD(TAD-f)消化物的滤液(收集自综合粪肥使用系统(IntegratedManure Utilization System)(IMUS)示范设备，Vegreville)(TAD-f)混合并在37℃下孵育不同时间(10、30、60和120min)，然后接种到组织培养细胞中。在第二组实验中，以不同的消化物对病毒的比例(1∶1、25∶1和100∶1)将TAD-f与1体积病毒悬浮液混合并孵育60分钟，然后接种到组织培养细胞中。用于比较的对照是以相同感染剂量接种到细胞系中的未处理的病毒悬浮液。3到4天后，对细胞培养物的CPE进行评分。将所使用的TAD-f的不同孵育时间和浓度转换为log10对数并相对于所观察的CPE的百分比(数据未显示)绘图。
我们观察到，2小时(120min.)的孵育期后且类似地采用100倍TAD-f对1体积病毒悬浮液的比例，ILTV CPE已经消除，从而表明已完全去除ILTV的传染性。ILTV的CPE百分比与孵育时间和所添加的TAD-f量成反比。
我们在此成功地论证了一种用于ILTV消毒的简单、廉价且环境友好的TAD技术。此外，已经证明嗜热性厌氧消化系统经由生物气产生再生能源并降低在饲养场实践中温室气体的排放和农业生物废物的足迹。由TAD除去病毒为养禽业控制ILT传播和农业生物废物的管理提供另一种环境友好的替代方式。
实施例8：生物废物和消化物中病原体的评估
存在用于厌氧消化的许多不同类型的废物产物，然而，含有粪肥的生物废物具有高密度的大肠细菌(1-6)。大肠细菌可包括与人类疾病相关的病原体(例如沙门氏菌)及其他动物传染病病原体(例如弯曲杆菌属和李斯特菌属)(7-10)。通常，用于表示废物中污染的方法使用如粪便大肠细菌等指示生物体。就水而言，该组生物体的检测和计数用于确定水对于家庭和工业用途的适宜性(11)。在美国，来自废水处理厂的淤泥必须满足环境保护局(USEPA)关于作为指示剂的粪便大肠菌或作为病原体的沙门氏菌的密度要求(12)。
在由Pell(13)提出的关于粪肥中病原微生物的讨论中提到，过去大多数关于生物废物管理的环境关注集中于营养物超负荷、水质或气味问题。没有法规涉及用于厌氧消化的生物废物中的病原体。随着艾伯塔生物气体工业的出现，将产生来自厌氧消化器的大量流出物。缺少关于在厌氧消化器流出物中是否存在病原体以及如果存在，它们对公众、动植物健康是否构成威胁的信息。我们尚未发现关于艾伯塔处理厌氧消化器的流出物的法规信息，尽管有着关于废水系统的信息(14)。艾伯塔农业和农村发展指南(Alberta Agriculture and Rural Development guidelines)提到，消化物的土地利用是依照农业操作实践法规和条例(Agricultural OperationsPractices Act and Regulations)，因为其应用于粪肥(15)。加拿大环境部长委员会(CCME)在其关于仅含有庭院废物的堆肥中生物体含量的指南中提到，粪便来源的粪便大肠菌应＜1000最大可能数(MPN)/g总固体量(TS)(以干重计算)且沙门氏菌＜3MPN/4g TS(16)，且含有其他原料的堆肥所包含的粪便大肠菌应＜1000MPN/g TS或沙门氏菌应＜3MPN/4g TS。具有其他原料的堆肥取决于堆肥种类必须暴露在55℃或更高温度下规定的时间。
USEPA已实施标题40的联邦条例法典(Code of FederalRegulations)(CFR)，第503部分的条例来控制生物固体的使用和处理(17)。生物固体定义为废水处理过程期间产生的可循环有机固体。该规章的第503部分给出生物固体的使用要求，以防止对公众和环境造成污染。一个要求是控制病原体或引起疾病的生物体并降低携带者对生物固体的吸引。病原体可以是细菌、病毒和寄生虫，且携带者包括啮齿类动物、苍蝇、蚊子和携带并传播疾病的生物体。第503部分所述规则确保对于土地应用或表面处置的生物固体安全的病原体水平。A级生物固体的标准与用于具有其他原料的堆肥的CCME指南相同，其中粪便大肠菌＜1000MPN/g TS或沙门氏菌＜3MPN/4g TS。如果病原体降至对公众和环境不构成风险的程度，则认为生物固体为B级。在已施用B级生物固体的区域中，在认为该区域安全之前，必须采取措施来防止在该区域收获农作物、放牧动物和公众接触。B级生物固体要求是粪便大肠菌必须＜2x106MPN/g TS。对于该生物固体，粪便大肠菌用作细菌性和病毒性病原体的平均密度的指示。
我们使用用于生物固体的粪便大肠菌(18)和沙门氏菌(19)的USEPA微生物学试验法对生物废物厌氧消化后未消化的生物废物和流出物进行了小规模研究，并使用结果评估局部生物废物样品。由于进行实验时的时间和资源限制，仅对所选生物废物样品进行所选择的分析。
目的
-评估选定生物废物样品的用作污染指示剂的粪便大肠菌和用作病原体指示剂的沙门氏菌的水平。
-评估使用嗜热性厌氧消化过程后粪便大肠菌和沙门氏菌的减少。
该研究的结果为开发处理和利用生物废物的指南提供了初步数据。
生物废物和样品收集
除非另有说明，所有样品收集到无菌塑料袋或瓶中并在收集后2-3小时内测试。除样品1.4外，所有样品均专门为该研究而收集，样品1.4在ARC，Vegreville，艾伯塔收集并贮存。该研究中，该样品正用于ARC全自动厌氧消化系统ARC试验设备(下文称为ARC试验设备)中。消化系统在55℃下运行。在冬季月份中从同一农场收集所有的牛粪和鸡粪样品。选择该农场的原因是其极其靠近测试实验室，从而允许在USEPA微生物学测试方法的所需时间期限内对粪便大肠菌和沙门氏菌进行有效测试。
该研究中测试以下样品：
-1.1取自乳牛的牛粪。分两次从5只乳牛收集三个牛粪样品。样品1是牛1和2的粪肥混合物，样品2是牛3和4的混合物。样品3来自于牛5。一个样品仅测试沙门氏菌。
-1.2来自一只牛的牛粪，其从牲口棚收集并仅测试沙门氏菌。
-1.3从一般牲口棚区域收集牛粪。一些新收集的粪肥送至EdmontonARC实验室中。其余粪肥输送到Vegreville并在ARC试验设备中消化。在这时，在55℃下运行消化器来处理牛粪。在10天时间内新收集的牛粪进料到消化器中。最后一次粪肥进料是在取样进行分析之前的15小时。
-1.4在ARC试验设备常规用于TAD消化的牛粪。牛粪作为样品1.1到1.3从相同的农场收集并在4℃下贮存2个月。测试贮存的样品和来自消化器料斗的随机样品。来自料斗的牛粪在实验室中稀释并在22℃下静置1小时。收集牛粪的消化后样品并进行测试。
-1.5鸡粪，从牲口棚的鸡笼中收集。
-1.6鸡粪，从一般牲口棚区域收集且包括草垫。
-1.7家庭厨房废物，大部分为在7天时间内每天收集的蔬菜和水果废物，并保持在4-6℃下直到测试。
-1.8破损的蛋，包括蛋壳，从靠近测试实验室的杂货零售店中收集。
-1.9来自乙醇生产工厂的湿蒸馏物颗粒，在桶中收集并贮存在-20℃下直到在ARC试验设备中进行测试。收集该样品用于ARC试验设备并选择用于病原体分析，因为其是非粪肥基生物废物。获取具有8％TS的稀释样品用于粪便大肠菌和沙门氏菌测试。
测试方法
所有脱水培养基购自Neogen(MI，USA)并在Biolevel II级实验室中进行测试。根据USEPA方法所描述使用5管MPN方法来获得粪便大肠菌和沙门氏菌的种群估计值。
生物废物的总固体测量
使用强制通气烘箱干燥法在70℃下经48小时对生物废物进行总固体分析。该方法假定仅去除水。以样品湿重的百分比报告结果。
粪便大肠菌的测试
使用USEPA方法1680评估生物废物和厌氧消化器流出物的粪便大肠菌(17)。简言之，该方法使用MPN过程来获得粪便大肠菌群的种群估计值，并使用月桂基胰蛋白胨肉汤和EC特定培养基及升高的温度分离和计数粪便大肠生物体。该测试的基础在于通常在人及其他温血动物的粪便中发现的粪便大肠菌，包括大肠杆菌(E.coli)。
这些细菌指示可能存在其他细菌性和病毒性病原体。进行生物废物样品的总固体测定并用于以MPN/g干重计算并报告粪便大肠菌。
沙门氏菌的测试
用USEPA方法1682来评估生物废物和厌氧消化器流出物的沙门氏菌(18)。简言之，该方法是用于通过用胰蛋白酶大豆肉汤富集并用改良的半固体Rappaport-Vassiliadis培养基选择而进行的沙门氏菌的检测和计数。用木糖-赖氨酸脱氧胆酸乳糖琼脂进行推定性鉴别，并用赖氨酸-铁琼脂琼脂、三糖铁琼脂和尿素肉汤来证实。进行血清学测试。测定典型的生物废物样品的总固体并用于以MPN/4g干重计算沙门氏菌密度。
质量控制
使用沟污肥(CAS 8049-99-8，Milwaukee Metropolitan SewerageDistrict，UNGRO Corp.ON)(一种通过USEPA证明的热干燥的A级生物固体)，并将合适的对照细菌掺入其中。大肠杆菌(E.coli)(ATCC#25922)用作粪便大肠菌测试的阳性对照以及沙门氏菌测试的阴性对照。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(ATCC#14028)用作沙门氏菌测试的阳性对照。
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(ATCC#13048)和假单胞菌属(Pseudomonas)(ATCC#27853)用作粪便大肠菌测试的阴性对照。
结果和讨论
下表给出生物废物样品的总固体、粪便大肠菌和沙门氏菌的MPN。
选定的生物废物样品的微生物学试验结果的概要
a.TS估计值
该研究中测试来自相同设施的牛粪样品。该样品来自一般牲口棚区域并取自奶牛。当测试时，在所有样品中发现的粪便大肠菌的密度范围为8.8x104MPN/g TS到1.1x107MPN/g TS。在从一般牲口棚区域收集的一个样品中发现沙门氏菌为4x100MPN/4g TS。牛粪在4℃下贮存2个月后粪便大肠菌降低2到3个对数级。通过TAD在55℃下消化牛粪15小时的两种情形中，粪便大肠菌和沙门氏菌降低至低于检测限(对于粪便大肠菌为＜0.18MPN/g TS，对于沙门氏菌为＜0.18MPN/4g TS)。
鸡粪、厨房废物、蛋和湿式蒸馏物颗粒不经过消化。两个鸡粪样品均有粪便大肠菌，4.3x106和2.1x106MPN/g TS。未检出沙门氏菌。在厨房废物、蛋和湿式蒸馏物颗粒中没有粪便大肠菌和沙门氏菌。
该简单研究显示，在牛粪和鸡粪样品中检出粪肥常有的细菌。根据A级生物固体的USEPA指南，在所有粪肥样品中粪便大肠菌密度均高于可接受水平，而就B级生物固体而言，在新收集的粪肥样品中粪便大肠菌的密度高于可接受水平。提高的粪便大肠菌水平表明，病原菌可能存在于这些样品中。这由以下事实验证：一个新鲜牛粪样品含有4x100MPN/4g TS沙门氏菌，来自ARC试验设备的随机料斗样品含有2.1x100MPN/4g TS沙门氏菌。在55℃下厌氧消化15小时后测试该样品，其所含粪便大肠菌和沙门氏菌都低于检测水平。
Bendixen考察了丹麦生物气工厂的动物和人类病原体减少的情况(20)。据报道，在嗜热性消化温度(50℃到55℃)下可明显降低病原体存活，但在低温和嗜中温(5℃到45℃)下则不会。生物气工厂的建造、功能和管理需要监控，以确保病原体破坏，还需要合理的政策以分类消化流出物以进行适当处理。USEPA标准(17)中对于污水污泥使用和处理的要求显示，污水污泥应该分析伤寒病毒和活蠕虫卵。也要求降低携带者吸引并减少挥发性固体。此外，也应该研究其他病原体。例如，已在家畜中发现人类诺如病毒株，表明动物传染病的传播途径(21)。还有，已经制定涉及德国厌氧消化设施的植物病原体的政策(22)。
总结
-使用用于粪便大肠菌＜1000MPN/g TS的堆肥的USEPA A级生物固体及CCME指南，所有的新鲜收集的粪肥(奶牛和鸡)均高于可接受水平。
-使用用于粪便大肠菌＜2x106MPN/g TS的USEPA B级生物固体指南，所有的新鲜收集的粪肥样品(奶牛和鸡)均高于可接受水平。
-对于一份新鲜牛粪，沙门氏菌属超过用于＜3MPN/4g TS的堆肥的USEPA A级生物固体及CCME指南。
-牛粪在4℃下贮存2个月降低粪便大肠菌浓度。
-在55℃下厌氧消化15小时使粪便大肠菌和沙门氏菌属降至检测水平以下。在连续搅拌罐式反应器系统中消化十五小时似乎足够用于降低。
-家庭厨房废物、破损的蛋和湿式蒸馏物颗粒不含粪便大肠菌和沙门氏菌属或所含水平低于使用MPN方法的检测值。
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实施例9：使用嗜热性厌氧消化(TAD)过程增强朊病毒破坏
申请人在该实施例中表明，也通过将基于碳水化合物的基质(非蛋白质基质)添加到消化器中并使厌氧菌聚生体保持活性状态来增强朊病毒破坏。
申请人先前证明，分批消化中生物气特征(CH4和CO2)在第8到11天达到峰值，然后再不进一步将基质添加到消化中的情况下快速降至基线水平。该结果显示大多数厌氧菌在达到平衡后处于静息状态。
在该研究中，从第11天开始将纤维素基质定期地(约每7天)添加到具有10ml 40％羊瘙痒症脑组织的TAD消化研究组中。作为对照，如前一研究以类似方式建立另一个研究组(具有10ml 40％羊瘙痒症脑组织的TAD消化)，但不添加额外的纤维素基质。该研究进行90天。取样时间表如下：第0、6、11、18、26、40、60和90天。在研究结束时，提取羊瘙痒症朊病毒，纯化、脱盐并浓缩以用于使用12％SDS-PAGE和蛋白质印迹的分析。使用Alpha Innotech图像分析仪(Multilmage II，AlphaInnotech，San Leandro，CA)半定量蛋白质印迹图像。
图像分析的结果显示以下：
1)在仅具有羊瘙痒症朊病毒(未添加纤维素基质)的TAD对照组中，分别与TAD中的羊瘙痒症朊病毒在第0天的起始量和在第26天掺入磷酸盐缓冲液(PBS)中的羊瘙痒症朊病毒的量相比，羊瘙痒症朊病毒在第26天降低2.2个对数级。该结果与之前研究中所显示的相同。
2)在具有羊瘙痒症朊病毒和额外的纤维素基质的TAD组中，分别与TAD中的羊瘙痒症朊病毒在第0天的起始量和在第26天掺入PBS中的羊瘙痒症朊病毒的量相比，羊瘙痒症朊病毒在第26天降低大于3个对数级。
3)从第11到18天，TAD仅消除0.8个对数级的羊瘙痒症朊病毒(积分密度和面积(IDA)从12.18到11.38个对数级)，而具有额外纤维素基质(60ml TAD/羊瘙痒症朊病毒混合物中1克)消除1.37个对数级的羊瘙痒症朊病毒(IDA从12.15到10.78个对数级)(p＜0.001，student t检验)。
4)从第18到26天，TAD消除1.05个对数级的羊瘙痒症朊病毒(IDA从11.38到10.34个对数级)，而在第二轮的额外纤维素基质将羊瘙痒症朊病毒消除至以当前蛋白质印迹法不可检测的水平。预期在第二次添加纤维素基质后的这一时间内病毒可进一步获得大于2个对数级的降低(图1，蛋白质印迹图像显示从第11天到26天羊瘙痒症朊病毒的降低)。
5)进行计算机建模来预测使用添加和不添加基于碳水化合物的基质的TAD过程的羊瘙痒症朊病毒的破坏率。该模型允许申请人避免在朊病毒疾病研究和诊断领域中使用现有可用方法的检测灵敏度的限制。
总之，所述TAD技术可以时间依赖性的方式有效地破坏羊瘙痒症朊病毒蛋白质。在TAD过程中周期性地添加基于碳水化合物和非含蛋白质的基质增强破坏能力。据估计，在具有额外的基于碳水化合物(非含蛋白质)的基质的组中，第26天获得羊瘙痒症朊病毒滴度大于3个对数级的降低。基于试验数据，计算模型可用于预测TAD过程中朊病毒降低的时程，以及实现SRM中朊病毒基本上完全消除所需要花费的时间。
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所有参考文献和出版物以引用方式合并于此。
Claims (44)
1.用于降低可能存在于载体材料中的生物有害物质的滴度的方法，包括将载体材料提供给厌氧消化(AD)反应器并在AD过程期间维持生物气产率基本上稳定。
2.权利要求1的方法，其中所述生物有害物质包含激素、抗体、体液、病毒性病原体、细菌性病原体和/或杂草种子。
3.权利要求1的方法，其中所述生物有害物质包含朊病毒。
4.权利要求3的方法，其中所述朊病毒是羊瘙痒症朊病毒、CWD朊病毒或BSE朊病毒。
5.权利要求3或4的方法，其中所述朊病毒对蛋白酶K(PK)消化具有抗性。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述载体材料包含富含蛋白质的材料。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述载体材料包含特定风险材料(SRM)。
8.权利要求7的方法，其中所述SRM包括CNS组织(例如脑、脊髓或其片段/组织匀浆/部分)。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述AD反应器以分批方式、半连续方式或连续方式运行。
10.权利要求9的方法，其中所述分批方式持续少于约0.5hr、1hr、2hr、5hr、10hr、24hr、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、20天、30天、40天、50天或60天。
11.权利要求9或10的方法，其中所述生物气产率在分批方式运行开始后约0.5-5hr、1-7天或5-10天达到峰值。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中在达到峰值生物气产量后每约0.5-5hr、1-7天或5-10天一次半连续地将富含碳的材料提供给AD反应器，以维持基本上稳定的生物气产量。
13.权利要求12的方法，其中所述富含碳的材料包括新鲜的植物残体或其他容易消化的纤维素。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述AD反应器在分批方式运行开始时包含微生物的活性接种体。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中AD过程通过厌氧微生物-例如嗜低温性微生物、嗜中温性微生物或嗜热性微生物-的聚生体进行。
16.权利要求15的方法，其中所述嗜热性微生物用包含具有丰富β-折叠的蛋白质的基质驯化。
17.权利要求15的方法，其中所述嗜热性微生物通过在高温和极端碱性pH下用包含淀粉样物质的基质培养而驯化。
18.权利要求1-17任一项的方法，还包括添加一种或多种选自Ca、Fe、Ni或Co的补充营养物。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述AD在约20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或更高温度下进行。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中约30天或18天的厌氧消化后实现生物有害物质的滴度2个对数级或更多的降低。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中约30或60天的厌氧消化后实现生物有害物质的滴度4个对数级或更多的降低。
22.用于产生生物气的方法，包括将富含蛋白的原料提供给厌氧消化(AD)反应器，其中在AD过程期间生物气产率基本上保持稳定。
23.权利要求22的方法，其中所述AD反应器以分批方式运行。
24.权利要求23的方法，其中所述AD反应器在分批方式运行开始时包含微生物的活性接种体。
25.权利要求23或24的方法，其中所述分批方式持续少于约0.5hr、1hr、2hr、5hr、10hr、24hr、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、20天、30天、40天、50天或60天。
26.权利要求22-25任一项的方法，其中所述生物气产率在分批方式运行开始后约0.5-5hr、1-7天或5-10天达到峰值。
27.权利要求22-26任一项的方法，其中在达到峰值生物气产量后每约0.5-5hr、1-7天或5-10天一次半连续地将富含碳的材料提供给AD反应器，以维持基本上稳定的生物气产量。
28.权利要求27的方法，其中所述富含碳的材料包括新鲜的植物残体或其他容易消化的纤维素。
29.权利要求22-28任一项的方法，其中所述富含蛋白质的原料包括激素、抗体、病毒性病原体或细菌性病原体。
30.权利要求22-29任一项的方法，其中所述富含蛋白质的原料是特定风险材料(SRM)。
31.权利要求30的方法，其中所述SRM包含一种或多种朊病毒或病原体。
32.权利要求31的方法，其中所述朊病毒包括羊瘙痒症、CWD和/或BSE朊病毒。
33.权利要求31的方法，其中所述朊病毒对蛋白酶K(PK)消化具有抗性。
34.权利要求30-33任一项的方法，其中所述SRM包括CNS组织(例如，脑、脊髓或其片段/组织匀浆/部分)。
35.权利要求31-34任一项的方法，其中约30天或18天的厌氧消化后实现朊病毒的滴度2个对数级或更多的降低。
36.权利要求31-35任一项的方法，其中约30或40天的厌氧消化后实现朊病毒的滴度3个对数级或更多的降低。
37.权利要求31-36任一项的方法，其中约30或60天的厌氧消化后实现朊病毒的滴度4个对数级或更多的降低。
38.权利要求22-37任一项的方法，其中所述AD在约20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或更高温度下进行。
39.权利要求22-38任一项的方法，其中进行AD的细菌包括嗜热性微生物的聚生体，和/或厌氧微生物例如嗜低温性微生物、嗜中温性微生物或嗜热性微生物的聚生体。
40.权利要求22-39任一项的方法，其中进行AD的细菌用包含具有丰富β-折叠的蛋白质的基质驯化。
41.权利要求22-40任一项的方法，其中进行AD的细菌通过在高温和极端碱性pH下用包含淀粉样物质的基质培养3个月而驯化。
42.权利要求22-41任一项的方法，还包括添加一种或多种选自Ca、Fe、Ni或Co的补充营养物。
43.用于降低可能存在于载体材料中的病毒性生物有害物质的滴度的方法，包括使载体材料与厌氧消化(AD)消化物，优选嗜热性厌氧消化(TAD)消化物的液体部分接触。
44.权利要求43的方法，其中所述接触步骤在37℃或室温(例如，约20-25℃)下进行。
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