CN102782674A - 用于抛物线状曲线的pcr的肘值的确定 - Google Patents

Abstract

提供了用于处理PCR曲线且用于识别抛物线状PCR曲线的存在的系统和方法。PCR曲线的分段线性逼近的使用使得在抛物线状PCR曲线的情况下能够确定更实际的肘值。

Description

用于抛物线状曲线的PCR的肘值的确定

技术领域

本发明总体上涉及用于处理聚合酶链式反应(PCR)数据的系统和方法，并且更特别地涉及用于确定PCR放大曲线中的特性循环阈值(Ct)或肘值、或具有抛物线形状的其它生长曲线中的肘值的系统和方法。

背景技术

聚合酶链式反应是用于对定义核酸序列进行酶合成或放大的体外方法。该反应通常使用两个低聚核苷酸引物，其混合成相反的股并且位于将被放大的模板或目标DNA序列之侧。引物的延伸物被热稳定的DNA聚合酶催化。涉及模板变性、引物退火和由聚合酶进行的退火引物的扩展的重复循环系列导致特定DNA片段的指数积累。在该过程中通常使用荧光探针或标记以促进放大过程的检测和量化。

特别地，均质且不要求在放大的开始或反应的物理采样之后添加试剂以进行分析的荧光技术是吸引人的。示例性均质技术使用低聚核苷酸引物来对感兴趣区域和荧光标签或染料进行定位以进行信号生成。基于PCR的典型方法使用具有两个相交互发色团的FRET低聚核苷酸探针(相邻混合探针、TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacon)、Scorpion)具有仅一个荧光团的单低聚核苷酸探针(G退火探针、Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；290：89～97和SimpleProbe，Idaho Technology)以及使用dsDNA染料(例如SYBR绿色I)来代替共价的荧光标记低聚核苷酸探针的技术。结合到PCR中的所有双股(ds)DNA的DNA结合染料在结合时引起染料的荧光。因此，PCR期间的DNA产物的增加因此导致荧光强度的增加，并在每个循环进行测量，从而允许将DNA浓度量化。然而，潜在的缺点是到所有dsDNA PCR产品的非特定绑定，影响精确的量化。参考标准稀释，能够确定RCR中的dsDNA浓度。

荧光报告探针仅检测特定探针被绑定到的DNA序列，并因此显著地增加特殊性。这即使在存在非特定DNA扩增的情况下，也允许进行扩增的量化。为了同一反应中的多个靶的检测，可以在多重试验中使用荧光探针，其中，对每个靶使用具有不同色彩的标签的特定探针。荧光报告探针的特殊性还防止由引物二聚体引起的测量干扰，其是扩增期间的不期望的副产物。大多数应用是基于荧光报告化合物与被绑定到探针的荧光的猝灭剂之间的相互作用。只要报告和猝灭剂化合物非常接近，则可以在用激励源(例如激光器、LED等)进行激励时仅检测基本荧光。一旦发生扩增，则报告和淬灭剂化合物的相互作用被破坏，导致可检测的荧光信号。在每个PCR循环处扩增的产物的增加引起由于报告和淬灭剂化合物的减少的相互作用而导致的荧光的成比例增加。通常，在每个扩增循环中检测并测量荧光，并且使用与产物的指数式增加相对应的其几何增加来确定每个反应中的阈值循环(CT)。

在图1中示出了典型的实时PCR曲线(实线)，其中，对比用于典型PCR过程的循环数目对荧光强度值进行绘图。在这种情况下，在PCR过程的每个循环中监视PCR产物的形成。通常在热循环仪中测量扩增，其包括用于测量扩增反应期间的荧光信号的部件和器件。此类热循环仪的示例是Roche Diagnostics LightCycler(商品目录号No.20110468)。例如借助于荧光标签混合探针来检测扩增产物，其仅在其被绑定到靶核酸时发射荧光信号，或者在某些情况下还借助于绑定到双股DNA的荧光染料。

对于典型PCR曲线而言，识别基线区域的末端处的转折点(其通常被称为肘值或循环阈值(Ct)值)对理解PCR扩增过程的特性极其有用。可以使用Ct值作为PCR过程的效率的度量。例如，通常针对要分析的所有反应来确定定义的信号阈值，并针对靶核酸以及针对诸如标准或管家基因的基准核酸来确定达到此阈值值所需的循环数目(Ct)。可以基于针对靶核酸和基准核酸获得的Ct值来确定靶分子的绝对或相对拷贝数(Gibson等人；Genome Research 6：995～1001；Bieche等人，CancerResearch 59：2759～2765，1999；WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。在图1中的基线区域15的末端处的区域20中的肘值将在循环数36左右。

可以通过将结果与由RNA或DNA的已知量的连续稀释的实时PCR产生的标准曲线相比较来确定RNA或DNA的量。可以通过将循环阈值(Ct)值与标准曲线、与基准核酸的循环阈值(Ct)或与绝对量化标准核酸相比较来确定聚合酶链式反应(PCR)扩增中的靶分子的绝对或相对拷贝数。另外，可以通过将用于要分析的每个反应的循环阈值(Ct)与基准核酸的循环阈值(Ct)相比较来确定聚合酶链式反应(PCR)扩增的效率。

实时PCR(RT-PCR)的定量分析需要用于PCR曲线的肘值(或循环阈值Ct)的确定。已针对此用途开发了许多算法，例如，基于归一化数据曲线与阈值的交点或通过在分析上(例如使用曲率算法)或在数值上确定归一化数据曲线上的最大曲率或二阶导数，如在2005年12月20日提交的美国申请序号No.11/316,315；2006年2月6日提交的美国申请序号No.11/349,550，；2006年7月19日提交的美国申请序号No.11/458644；2006年9月19日提交的美国申请序号No.11/533,291；2007年9月25日提交的美国申请序号No.11/861,188；2008年9月12日提交的美国申请序号No.12/209,912(“ELCA算法”)中所述。如果底层曲线近似S形状，则这些方法将非常好地工作。在原始数据曲线具有抛物线形状的罕见情况下，则由这些方法确定的肘值通常将导致比一个人通过数据曲线的检验将预期的更大的肘值。

考虑来自图1所示的西尼罗河病毒(West Nile Virus，WNV)试验的实时PCR(RT-PCR)曲线。实黑色曲线具有典型的S形状，其是可用先前开发的算法针对分析进行修正的。然而，虚线曲线类似于抛物线且缺少平坦区域。当用例如ELCA算法来分析时，图1所示的两个曲线的肘值具有在下表1中给出的值。ELCA算法在数值上确定作为曲率或二阶导数中的最大值的点的肘值。

	ELCA Ct
		实线曲线	35.46
虚线曲线	45.43

表1：用于S形曲线和抛物线状曲线的Ct值

用于实线曲线的肘值与一个人将正常地分配给S形曲线的值一致，而在用于抛物线状虚线曲线的肘值处所画的垂直线在比一个人通常将分配给此曲线的明显更高的值处与虚线曲线交叉。

因此，期望的是开发将处理这些类型的曲线并且还识别此类抛物线曲线存在的时间的系统和方法。

发明内容

本发明提供了处理PCR曲线并识别抛物线状PCR曲线的存在的系统和方法。根据一个实施例，PCR曲线的分段线性逼近法的使用使得在抛物线状PCR曲线的情况下能够确定更实际的肘值。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于确定用于具有抛物线形状的实时PCR数据曲线的Ct值的计算机实现的方法。该方法通常包括在计算机系统或其它设备或机器(例如热循环仪)的处理器中实现的步骤，并且其包括接收表示PCR生长曲线的数据集，该数据集具有多个坐标值(x，y)，以及使用具有在x^*处终止的第一直线段和在x^*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来逼近该数据集。该方法通常还包括步骤：通过确定以下各项来确定PCR生长曲线是否具有抛物线形状：a)与从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在预定阈值值以上，其中，阈值值是0.90或以上；以及b)基本上在所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85或以上的阈值值以上；以及c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则确定第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是这样，则通过确定第二直线段与基线相减水平线的交叉点来估计数据集的Ct值。该方法通常还包括输出Ct值以便显示或进一步处理的步骤。在一个实施例中，两段分段线性函数具有以下形式：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right..$

在某些实施例中，逼近数据集包括使x^*处的目标函数最小化，其中，目标函数具有以下形式：

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2.$

特别地，可以通过向从x＝n0至n-1的所有数据点应用目标函数来确定x^*，其中，n是数据集的长度，n0是预定起始坐标，并且其中，x^*被确定为x的值，其具有最小Akaike信息系数(AIC)。在某些实施例中，用以下等式来定义AIC：

$\mathrm{aic}=n\·\ln \left(\frac{{\left|\right|\hat{y}-y\left|\right|}^2}{n}\right)+2\·m+\frac{2\·m\·(m+1)}{n-m-1},$

其中，m是模型的自由度的数目，y是数据向量且

是预测模型向量。在另一实施例中，估计Ct值包括应用以下形式的等式：

$C_T=x^{*}+\frac{\underset{i=1...x^{*}}{\mathrm{mean}}(y_i-{\mathrm{ax}}_i-b)}{c-a},$

其中，c是第二直线段的斜率且b是第一直线段的y截距。在用于确定到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在预定阈值值以上的某些实施例中，预定阈值值是0.99。在用于确定基本上在所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在阈值值以上的另一实施例中，阈值值是0.95。

根据本发明的另一方面，提供了一种有形计算机可读介质，其存储用于控制处理器以确定用于具有抛物线形状的实时PCR数据曲线的Ct值的代码。该代码通常包括指令，所述指令在被处理器执行时促使处理器接收表示PCR生长曲线的数据集，该数据集具有多个坐标值(x，y)，并使用具有在x^*处终止的第一直线段和在x^*处开始的第二直线段的两段分段时线性函数来逼近该数据集。代码通常还包括确定PCR曲线是否具有抛物线形状的指令。在某些方面，通过确定以下各项来完成此确定：(a)到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R²值是否在0.90或以上的阈值值以上；以及(b)在基本上所述数据集范围内的两段分段拟合的R²值是否在0.85或以上的阈值值以上；以及(c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率。该代码通常还包括如果(a)、(b)和(c)为真、则通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值的指令、并输出Ct值以进行显示或进一步处理的指令。在一个实施例中，两段分段线性函数具有以下形式：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right..$

在某些实施例中，逼近数据集的指令包括使x^*处的目标函数最小化的指令，其中，目标函数具有以下形式：

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2.$

特别地，可以通过向从x＝n0至n-1的所有数据点应用目标函数来确定x^*，其中，n是数据集的长度，n0是预定起始坐标，并且其中，x^*被确定为x的值，其具有最小Akaike信息系数(AIC)。在某些实施例中，用以下等式来定义AIC：

$\mathrm{aic}=n\·\ln \left(\frac{{\left|\right|\hat{y}-y\left|\right|}^2}{n}\right)+2\·m+\frac{2\·m\·(m+1)}{n-m-1},$

其中，m是模型的自由度的数目，y是数据向量且

是预测模型向量。在另一实施例中，估计Ct值的指令包括应用以下形式的等式的指令：

$C_T=x^{*}+\frac{\underset{i=1...x^{*}}{\mathrm{mean}}(y_i-{\mathrm{ax}}_i-b)}{c-a},$

其中，c是第二直线段的斜率且b是第一直线段的y截距。

根据本发明的另一方面，提供了一种实时聚合酶链式反应(PCR)系统，其通常包括生成表示PCR扩增曲线的PCR数据集的PCR分析模块，数据集包括每个具有一对坐标值(x，y)的多个数据点，其中，数据集包括在包括循环阈值(Ct)值的感兴趣区域中的数据点，以及适合于处理PCR数据集以确定Ct值的智能模块。通常通过使用具有在x^*处终止的第一直线段和在x^*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来逼近数据集并确定PCR生长曲线是否具有抛物线形状来确定Ct值。通常通过以下各项来完成确定曲线是否具有抛物线形状，a)确定到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R²值是否在0.90或以上的阈值值以上，以及b)确定基本上在所有数据集范围内的两段分段拟合的R²值是否在0.85或以上的阈值值以上，以及c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率，并且如果a)、b)和c)是真的，则通过确定第二直线段与基线相减水平线的交叉点并输出Ct值以进行显示或进一步处理来估计数据集的Ct值。在PCR系统的一个实施例中，两段分段线性函数具有以下形式：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right..$

在某些实施例中，逼近数据集包括使x^*处的目标函数最小化，其中，目标函数具有以下形式：

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2.$

特别地，可以通过向从x＝n0至n-1的所有数据点应用目标函数来确定x^*，其中，n是数据集的长度，n0是预定起始坐标，并且其中，x^*被确定为x的值，其具有最小Akaike信息系数(AIC)。在某些实施例中，用以下等式来定义AIC：

$\mathrm{aic}=n\·\ln \left(\frac{{\left|\right|\hat{y}-y\left|\right|}^2}{n}\right)+2\·m+\frac{2\·m\·(m+1)}{n-m-1},$

其中，m是模型的自由度的数目，y是数据向量且

是预测模型向量。在另一实施例中，估计Ct值包括应用以下形式的等式：

$C_T=x^{*}+\frac{\underset{i=1...x^{*}}{\mathrm{mean}}(y_i-{\mathrm{ax}}_i-b)}{c-a},$

其中，c是第二直线段的斜率且b是第一直线段的y截距。

对本说明书的其余部分(包括附图和权利要求)的参考将实现本发明的其它特征和优点。下面相对于附图来详细地描述本发明的其它特征和优点，以及本发明的各种实施例的结构和操作。在附图中，类似的参考数字指示相同或在功能上类似的元件。

附图说明

图1示出在具有S形状的PCR过程的情况下的典型生长或扩增曲线(实线)和具有抛物线形状的PCR曲线(虚线)。

图2示出抛物线状PCR曲线和分段线性逼近。

图3示出与图1的虚线(抛物线状PCR曲线)相对应的从循环25至循环49的AIC对比循环数的图。

图4示出根据一个实施例的用于确定PCR曲线中的过渡值的过程。

图5是示出可以用来实现本发明的方法和系统的软件和硬件资源之间的关系的一般方框图的示例。

图6是示出热循环仪设备与计算机系统之间的关系的一般方框图的示例。

具体实施方式

本发明提供了用于识别抛物线状PCR曲线和用于处理此类曲线以确定Ct值的系统和方法。

在图1中将具有S形状的PCR过程的情况下的典型生长和放大曲线10的一个示例示为实线曲线。如所示，曲线10包括停滞阶段区域15和指数阶段区域25。停滞阶段区域15通常被称为基线或基线区域。此类曲线10包括将停滞阶段与指数阶段区域链接的过渡感兴趣区域20。区域20通常被称为肘或肘区域。肘区域通常定义到基线的末端和底层过程的生长或扩增速率的过渡。识别区域20中的特定过渡点可能对分析底层过程的性质有用。在典型PCR曲线中，识别称为肘值或循环阈值(Ct)值的转折点对理解PCR过程的质量特性和数量特性有用。例如，使用Ct值可以用来提供存在于被分析的样本中的DNA的量的量化。通过执行停滞(DNA量)对比Ct值的校准曲线来获得量化。后续样本然后使用Ct值以及校准曲线来直接获得样本中的DNA的估计。Ct值还可以用来提供关于DNA样本的质量信息。

可以提供具有没有平坦区域的抛物线形状的类似曲线的其它过程包括细菌过程、酵素过程和接合过程。在细菌生长曲线中，例如，已将感兴趣的过渡点称为停滞阶段中的时间λ。产生可以根据本发明来分析的数据曲线的其它特定过程包括链置换扩增(SDA)过程、依赖核酸序列扩增(NASBA)过程和转录酶扩增(TMA)过程。分别在Wang、Sha-Sha等人在Clin Chem 2003 49(10)：1599中的“Homogeneous Real-TimeDetection of Single-Nucleotide Polymorphisms by Strand DisplacementAmplification on the BD ProbeTec ET Syste m”和Weusten、Jos J.A.M.等人在Nucleic Acids Research，2002 30(6)：26中的“Principles of Quantitationof Viral Loads Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification inCombination With Homogeneous Detection Using Molecular Beacons”中可以找到SDA和NASBA过程和数据曲线的示例。因此，虽然本文的其余部分将在本发明对PCR曲线的适用性方面讨论其实施例和方面，但应认识到本发明可以应用于与其它过程有关的数据曲线。

如图1所示，可以在二维坐标系中表示用于典型PCR生长曲线的数据，例如，PCR循环数定义x轴且累积多核苷酸生长的指示符定义y轴。通常，累积生长的指示符是荧光强度，因为荧光标记的使用可能是最广泛使用的标签方案。然而，应理解的是根据所使用的特定标签和/或检测方案，可以使用其它指示符。累积信号生长的其它有用指示符的示例包括发光强度、化学发光强度、生物发光强度、磷光强度、电荷转移、电压、电流、功率、能量、温度、粘度、光散射、放射强度、反射率、透射率和吸收率。循环的定义还包括时间、过程周期、单元操作周期和再生周期。

一般过程概观

考虑如图1所示的实时PCR生长曲线。期望的是从图1获得用于每个曲线的称为Ct或肘值的数。常常地，如所示，用于PCR曲线的实际数据导致抛物线状曲线，标准Ct确定过程对于该曲线未很好地起作用。如上文参考表1所讨论的，用于实线曲线的肘值与一个人通常将分配给S形曲线的值一致，而用于抛物线虚线曲线的肘值比一个人通常将分配给此曲线的明显更高。

根据一个实施例，可以参考图4来简要地描述用于确定PCR曲线中的过渡值的过程100，诸如动态PCR扩增曲线的肘值或Ct。在步骤110中，接收或获取表示曲线的实验数据集。在图1中示出了两个绘图的PCR数据集的示例，其中，y轴和x轴分别表示用于PCR曲线的荧光强度和循环数。在某些方面，数据集应包括连续且沿着轴等间距的数据。

在其中在存在于诸如热循环仪的PCR数据获取设备中的智能模块(例如执行指令的处理器)中实现过程100的情况下，可以在正在收集数据时实时地将数据集提供给智能模块，或者可以将其存储在存储器单元或缓冲器中并在实验已完成之后提供给智能模块。类似地，可以经由网络连接(例如LAN、VPN、内部网、因特网等)或到获取设备的直接连接(例如USB或其它直接有线或无线连接)将数据集提供给诸如台式计算机系统或其它计算机系统的单独系统，或者可以在诸如CD、DVD、软盘、记忆棒等的便携式介质上提供。在某些方面，数据集包括具有一对坐标值(或2维向量)的数据点。对于PCR数据而言，该对坐标值通常表示循环数和荧光强度值。在已在步骤110中接收或获取数据集之后，可以分析数据集以确定基线区域的末端。

在步骤120中，根据已知过程来处理数据集以确定用于数据集/曲线的Ct值。例如，可以使用ELCA过程。在步骤130中，进行关于数据集/曲线是否具有抛物线形状特性的确定。在一个实施例中，如果满足了所有以下条件，则将数据集/曲线确定为具有抛物线特性且如下面将讨论的那样将Ct值变成由等式4所预测的值：

1.计算到从x^*开始直至给定数据点的末端的数据点的二次拟合。如果此拟合的R²值在给定阈值(默认＝0.90或更大)以上，则接受CT值。在一个实施例中，将阈值设置为0.99。

2.分段线性拟合的R2值对比原始数据(遍及所有循环)＞阈值(默认＝0.85或更大)。在一个实施例中，将阈值设置为0.95。

3.如果a＞0且c＞0，则比值

大于给定阈值(默认＝1.1)。

如果确定数据集/曲线未显示出抛物线特性，则过程前进至步骤140。

在步骤140中，确定用于抛物线曲线的Ct值。为了对虚线曲线(抛物线)定义更适当的肘值，在一个实施例中使用对RT-PCR曲线的分段线性逼近。如下给出根据一个实施例的抛物线的分段线性函数逼近：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right.$

等式1：分段线性等式

在此等式中，分段线性函数包括在公共点x^*处接合的两个线性函数。在图2中示出等式1的应用，其中示出两个抛物线和分段线性逼近。

在一个实施例中，通过在x^*的给定值的等式2所示的目标函数的最小化来确定分段线性曲线。

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2$

等式2：目标函数以最小化

为了在等式2中确定将使用x^*的哪个值，在一个实施例中，对来自循环x^*＝n₀...n-1的所有数据点应用目标函数。理论上，可以将n₀定义为循环1或循环2或循环3等等，然而，为了帮助减少处理资源消耗，将n₀设置为约循环20或25等，因为这些循环值通常在基线区域的末端之前。选择具有最小Akaike信息系数(AIC)的x^*的值。由下式来定义Akaike信息系数：

$\mathrm{aic}=n\·\ln \left(\frac{{\left|\right|\hat{y}-y\left|\right|}^2}{n}\right)+2\·m+\frac{2\·m\·(m+1)}{n-m-1},$

等式3：Akaike信息系数

其中，m是模型的自由度，n是数据集的长度，y是数据向量且

是预测模型向量。一旦已确定分段线性函数，则将Ct值估计为分段线性函数的第2部分与在基线相减原始数据曲线的平均值处所画的水平线的交叉点。在数学上，这计算出：

$C_T=x^{*}+\frac{\underset{i=1...x^{*}}{\mathrm{mean}}(y_i-{\mathrm{ax}}_i-b)}{c-a}$

等式4：用于抛物线曲线的Ct值

在步骤150中，可以输出或返回如由等式4确定的Ct值，例如以进行显示或进一步处理。可以用显示设备来再现图形显示，诸如监视屏或打印机，其与执行图4的分析的系统耦合，或者可以将数据提供给单独的系统以便在显示设备上呈现。然而，如果在步骤130中，确定数据集/曲线未显示出抛物线特性，则在步骤150中输出由在步骤120中使用的过程确定的Ct值。应认识到如果需要的话，可以输出两个Ct值。并且，在某些实施例中，例如在正在处理的曲线不具有平坦区的条件下，可以使用等式4的抛物线Ct确定过程作为独立的算法而不是作为另一算法的子集，诸如ELCA，如上文所讨论的(例如，省略图4的步骤120)。

在某些实施例中，可以通过使用常规个人计算机系统来实现根据本发明的方法，包括但不限于输入数据集的输入设备，诸如键盘、鼠标等；表示曲线的区域中的特定感兴趣点的显示设备，诸如监视器；执行方法中的每个步骤所需的处理设备，诸如CPU；诸如调制解调器的网络接口、存储数据集的数据存储设备、在处理器上运行的计算机代码，等等。此外，还可以在PCR分析模块中实现该方法。

在图5～6中显示PCR系统的示例。图5示出解释可以用来实现本发明的方法和系统的软件和硬件资源之间的关系的一般方框图。在图6上描绘的系统包括可以位于热循环仪设备中的动态PCR分析模块和作为计算机系统的一部分的智能模块。经由网络连接或直接连接将数据集(PCR数据集)从分析模块传输至智能模块或进行相反操作。可以例如根据如图4所描绘的流程图来处理数据集。可以方便地例如根据如图5所描绘的流程图用存储在计算机系统的硬件上的软件来实现此流程图。参考图5，计算机系统(200)可以包括例如用于接收在PCR反应期间获得的荧光数据的接收装置(210)、用于根据本发明的方法来处理所述数据的计算装置(220)、用于根据由计算装置获得的结果来替换所述数据的一部分的应用装置(230)以及用于在计算机屏幕上显示结果的显示装置(240)。图6示出热循环仪设备与计算机系统之间的交互。该系统包括可以位于热循环仪设备中的动态PCR分析模块和作为计算机系统的一部分的智能模块。经由网络连接或直接连接将数据集(PCR数据集)从分析模块传输至智能模块或进行相反操作。可以由在处理器上运行且被存储在智能模块的存储设备上的计算机代码根据图5来处理数据集，并且在处理之后将其传输回分析模块的存储设备，在那里可以在显示设备上显示已修改数据。

应认识到可以在运行于计算机系统或其它设备或机器(例如热循环仪)的处理器上的计算机代码中实现包括抛物线确定过程的Ct确定过程。该代码包括用于控制处理器实现Ct确定过程的各种方面和步骤的指令。该代码通常被存储在有形介质上，诸如硬盘、RAM或诸如CD、DVD、记忆棒等便携式介质。类似地，可以在PCR设备中实现该过程，诸如包括执行存储在被集成在处理器中或与处理器耦合的存储器单元中的指令的处理器。可以通过到代码源的网络连接或直接连接或使用众所周知的便携式介质将包括此类指令的代码下载到PCR设备存储器单元。

本领域的技术人员应认识到可以使用诸如C、C++、C#、Fortran、VisualBasic等多种编程语言以及提供对数据可视化和分析有用的预先封装例程、函数和程序的诸如Mathematica的应用程序来将本发明的肘值确定过程编码。后者的另一示例是MATLAB

。

如上文所解释的，本发明的系统和方法可用于确定PCR扩增曲线中的特性循环阈值(Ct)或肘值或具有抛物线形状的其它生长曲线中的肘值。实时PCR(RT-PCR)的定量分析需要对于PCR曲线的肘值(或循环阈值Ct)的确定。这例如在向病人传递分析结果时具有真实且有形的实用性。特别地，当使用荧光数据来监视聚合酶链式反应时，当生长曲线的形状是抛物线时，本发明的系统和方法提供更准确的数据。此类数据不仅对监视反应有用，而且提供技术效果，诸如在PCR期间扩增的靶核酸的量化或根据所获得的数据来修改PCR的反应条件。

提供以下示例和图是为了帮助理解本发明，在所附权利要求中阐述了本发明的真实范围。

示例

针对从循环25至循环49的x^*值完成了等式1的回归曲线拟合。针对每个曲线拟合，根据等式3来计算AIC。图3所示的AIC对比循环数的图，从循环25至循环49，其对应于图1所示的虚线曲线。发现最小AIC在循环数41处发生，并且发现用于使用x^*＝41的等式1的系数为{a＝0.002472；b＝0.03460；c＝0.25387}。通过使等式2中的函数最小化来确定这些系数。当满足三个条件时，这些分段线性拟合被接受，即：

(1)c＞0且c/a＝102.7，其大于阈值1.1。

(2)从循环41至循环50的原始数据的二次拟合具有0.99967的R2值，其大于0.90或0.99的阈值。

(3)在所有循环数范围内的分段线性拟合具有0.9872的R2值，其大于0.85或0.95的阈值。

使用等式4和等于0.00533的平均基线相减荧光值，然后将Ct计算为Ct＝41.02。

虽然已以示例的方式且按照特定的实施例描述了本发明，但应理解的是本发明不限于公开的实施例。相反，如对于本领域的技术人员来说将显而易见的，其意图覆盖各种修改和类似布置。

Claims (15)

1.一种确定用于具有抛物线形状的实时PCR数据曲线的Ct值的计算机实现方法，该方法包括在计算机系统中实现的以下步骤：

-接收表示PCR生长曲线的数据集，该数据集具有多个坐标值(x，y)；

-使用具有在x^*处终止的第一直线段且在x^*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来对数据集进行逼近；

-确定：

a)到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R²值是否在0.90的预定阈值值以上；以及

b)在基本上所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85的阈值值以上；以及

c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是这样的话：

-通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值；以及

-输出Ct值以进行显示或进一步处理。

2.权利要求1的方法，其中，所述两段分段线性函数具有以下形式：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right..$

3.权利要求1或2中的任一项的方法，其中，对数据集进行逼近包括使x^*处的目标函数最小化，其中，所述目标函数具有以下形式：

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2.$

4.权利要求3的方法，其中，通过对从x＝n₀至n-1的所有数据点应用目标函数来确定x^*，其中，n是数据集的长度，n0是预定起始坐标，并且其中，x^*被确定为具有最小Akaike信息系数(AIC)的x的值。

5.权利要求4的方法，其中，由以下等式来定义AIC：

$\mathrm{aic}=n\·\ln \left(\frac{{\left|\right|\hat{y}-y\left|\right|}^2}{n}\right)+2\·m+\frac{2\·m\·(m+1)}{n-m-1},$

其中，m是模型的自由度的数目，y是数据向量且

是预测模型向量。

6.权利要求1至5中的任一项的方法，其中，估计Ct值包括应用以下形式的等式：

$C_T=x^{*}+\frac{\underset{i=1...x^{*}}{\mathrm{mean}}(y_i-{\mathrm{ax}}_i-b)}{c-a},$

其中，c是第二直线段的斜率且b是第一直线段的y截距。

7.权利要求1至6中的任一项的方法，其中，为了确定到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在预定阈值值以上，所述预定阈值值是0.99。

8.权利要求1至7中的任一项的方法，其中，为了确定在基本上所有数据集的范围内的两段分段拟合的R2值是否在阈值值以上，该阈值值是0.95。

9.一种存储用于控制处理器确定用于具有抛物线形状的实时PCR数据曲线的Ct值的代码的有形计算机可读介质，该代码包括指令，所述指令在被处理器执行时促使处理器：

-接收表示PCR生长曲线的数据集，该数据集具有多个坐标值(x，y)；

-使用具有在x^*处终止的第一直线段且在x^*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来对数据集进行逼近；

-确定：

a)到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在0.90的预定阈值值以上；以及

b)在基本上所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85的阈值值以上；以及

c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果a)、b)和c)：

-通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值；以及

-输出Ct值以进行显示或进一步处理。

10.权利要求9的计算机可读介质，其中，所述两段分段线性函数具有以下形式：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right..$

11.权利要求9或10的计算机可读介质，其中，对数据集进行逼近的指令包括使x^*处的目标函数最小化的指令，其中，所述目标函数具有以下形式：

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2.$

12.权利要求9至11中的任一项的计算机可读介质，其中，估计Ct值的指令包括应用以下形式的等式的指令：

$C_T=x^{*}+\frac{\underset{i=1...x^{*}}{\mathrm{mean}}(y_i-{\mathrm{ax}}_i-b)}{c-a},$

其中，c是第二直线段的斜率且b是第一直线段的y截距。

13.一种实时聚合酶链式反应(PCR)系统，包括：

-PCR分析模块，其生成表示PCR扩增曲线的PCR数据集，所述数据集包括多个数据点，每个具有一对坐标值(x，y)，其中，所述数据集包括包含循环阈值(Ct)值的感兴趣区域中的数据点；以及

-智能模块，其适合于处理PCR数据集以通过下述来确定Ct值：

-使用具有在x^*处终止的第一直线段且在x^*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来对数据集进行逼近；

-通过下述来确定PCR生长曲线是否具有抛物线形状：

a)确定到从x^*开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在0.90的预定阈值值以上；以及

b)确定在基本上所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85的阈值值以上；以及

c)确定如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是这样的话：

-通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值；以及

-输出Ct值以进行显示或进一步处理。

14.权利要求13的PCR系统，其中，所述两段分段线性函数具有以下形式：

$f\left(x\right)=\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{ax}+b,& x\≤x^{*}\\ c(x-x^{*})+a{x}^{*}+b,& x>x^{*}\end{array}\right..$

15.权利要求13或14中的PCR系统，其中，对数据集进行逼近包括使x^*处的目标函数最小化，其中，所述目标函数具有以下形式：

$E(a,b,c)=\frac{1}{2}\underset{x_i\≤x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{({\mathrm{ax}}_i+b-y_i)}^2+\frac{1}{2}\underset{x_i>x^{*}}{\mathrm{\Σ}}{(c(x_i-x^{*})+{\mathrm{ax}}^{*}+b-y_i)}^2.$

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