CN102776253B - 微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物法生产咪唑啉酮类超高效除草剂中间体2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及其过程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为原料，以通过发酵培养微生物庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）CCTCC No：M2010050生产的腈水合酶为催化剂生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。本方法反应条件温和，废水排放少，环境友好；产率高，转化时间短，成本低，易于实现工业化生产。
Description
本发明为申请号为2010102045352、申请日为2010年6月21日、发明名称为“微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株”的发明专利申请的分案申请。
（一）技术领域
本发明涉及一种微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法，以及在生产过程中用到的新菌株。
（二）背景技术
2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，英文名2-amino-2,3-dimethylbutyamide，外观为白色片状晶体，熔点为84℃，能溶于水和大多数有机溶剂。是咪唑啉酮类超高效除草剂如咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草烟等的通用中间体，市场需求广阔。其中咪唑乙烟酸和咪唑喹啉酸曾占据美国大豆除草剂市场主导地位达10年之久；而我国自从1990年大批量进口咪唑乙烟酸并在黑龙江省大面积应用以来，用量持续增加。特别是在国内该除草剂产品问世以后，由于其价格低廉，除草效果良好，故而被大范围使用，成为黑龙江与内蒙古地区大豆田除草剂的主导品种。
2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺目前主要通过化学法生产。其生产过程可分为两个部分：3-甲基-2-丁酮通过斯特雷克(Strecker)反应得到氨基腈，后者在酸或碱催化下水解得到产物（见下式）。
孙晓红等（西北大学学报，1994，24(3)：227-234）报道了该氨基腈的合成方法，先将氯化铵溶于水后，加入氰化钠和氨水，搅拌均匀后，加少量苄基三乙基氯化铵，滴加甲基异丙基甲酮，搅拌回流4~6小时，用二氯甲烷提纯后，得无色透明液体，纯度为95%，收率为90%。
Peter J.等（US 6339158）报道了由2-氨基-2,3-二甲基丁腈制备2-氨基-2,3-二甲基酰胺的方法，首先加入29.7ml浓硫酸，慢慢加入11.8g2-氨基-2,3-二甲基丁腈，保证反应体系温度不超过25℃，加热至100℃并在该温度下反应1h，反应结束后冷却，加入85ml浓氨水，过程中控制体系温度不超过75℃，然后用二氯甲烷萃取、结晶，最终得到11.2g2-氨基-2,3-二甲基酰胺，收率为81.7%。吕晓东等（辽宁化工，2001，30(10)：455-456）报道将2-氨基-2,3-二甲基丁腈在一定的温度下滴加入95%的浓硫酸中，升温，反应数小时。反应完毕后，冷却至室温，滴加浓氨水中和至弱碱性，加萃取剂，搅拌一定时间，过滤，滤出物用萃取剂洗涤，并将洗液合并入滤液。滤液相分离，有机层蒸出萃取剂，釜底物加入石油醚，冷冻结晶，滤出的固体干燥后得到2-氨基-2,3-二甲基酰胺，最终收率为95%，产物纯度达到96%。
由上可知，化学法生产2-氨基-2,3-二甲基酰胺的主要缺点是：反应需要高温、强酸等条件，能耗原料消耗高，产品易受副产物污染，提纯步骤繁琐，周期长，收率低，产生大量含腈污水，不符合环保要求等。
腈水合酶（Nitrile Hydratase）是一种在自然界中广泛存在的微生物酶，它可催化多种腈化合物水解生成酰胺。微生物腈水合酶可广泛地应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。1980年，Asano等（Agricultural andBiological Chemistry，1982，46(5):1183-1189）首次发现微生物Rhodocococcus sp.N-774可降解有毒的乙腈，不久即被成功地应用于工业生产丙烯酰胺。近年来，腈水合酶也被用于制备手性药物，如Gilligan等（Applied Microbiology and Biotechnology，1993，39:720-725）成功地用Rhodocococcus equi TG328腈水合酶和酰胺酶催化外消旋2-苯基丙腈立体选择性水解，生成了非甾体类抗炎药S-(+)-2-苯基丙酸。现有的研究表明，腈水合酶催化的反应具有高选择性、高效性、条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，符合原子经济和绿色化学的发展方向，有着化学方法无可比拟的优越性，从而促进了精细化工产品和手性药物的研制和开发。因此利用腈水合酶的高效性、高选择性和反应条件温和等特点来催化生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，将可以提高产率和产品质量、降低生产成本和减小环境污染。
据报道，α-氨基腈在水溶液中极不稳定，容易自发水解生产HCN和酮（醛）等物质（Engineering in Life Sciences,2004.4:547-556）。这些副产物特别是HCN是腈水合酶的强烈抑制剂，它通过与腈水合酶活性中心的金属离子Fe2+或Co2+络合而使腈水合酶失活。Nagasawa等（EuropeanJournal of Biochemistry,1991.196:581-589）报道，作为生产丙烯酰胺的高效催化剂Rhodococcus rhodochrous J1生产的腈水合酶，在氰离子浓度为0.01mM时即酶活损失62%。因此筛选得到耐受氰离子的腈水合酶，将有利于实现连续化生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，提高产物浓度。
（三）发明内容
为克服上述化学合成法的缺陷，本发明提供了一种微生物催化水合2-氨基-2,3-二甲基丁腈制备2-氨基-2,3-二甲基酰胺（ADBA）的方法，及制备过程中所用的新菌株。
本发明采用的技术方案是：
一种微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括：在以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，以庆笙红球菌（Rhodococcusqingshengii）CCTCC No：M2010050发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0~10.0、20~40℃下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
所述腈水合酶存在于菌体细胞中，具体制备时，可直接将发酵获得的含菌体细胞的发酵液作为催化剂参与反应，也可以将菌体细胞分离后，作为催化剂参与反应，所述腈水合酶用于催化2-氨基-2,3-二甲基丁腈制备2-氨基-2,3-二甲基酰胺的反应原理如下列反应式所示：
所述反应在水或pH6.0~10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行。
所述反应体系中底物初始浓度为0.03~0.3M。反应过程中，当底物浓度低于0.01M时，可以继续补入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈至浓度为0.03~0.3M，以达到连续生产的效果。
优选的，所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCC No：M2010050经发酵获得的含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5~50g/L。所述含酶菌体细胞可由上述三种菌株在适用于菌种庆笙红球菌、小球诺卡氏菌和红平红球菌的培养基中，经发酵培养获得。所述适用于本发明庆笙红球菌、小球诺卡氏菌和红平红球菌培养基，可以是一些含有可以被庆笙红球菌、小球诺卡氏菌和红平红球菌利用的营养物质的常规培养基。培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。作为碳源的有：蔗糖、葡萄糖、乳糖、柠檬酸钠、淀粉；作为氮源的有：酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉、玉米浆、铵盐等；另可加入：氨基酸类（如甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、天冬氨酸等）、维生素（如VB1、VB2、VB12、VC、VE、烟酸等）、核酸类（如嘌呤、嘧啶及其衍生物等）。用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH值为6.0~8.0。为提高产酶效率，可在培养基中添加诱导剂，所述诱导剂可为下列之一：谷氨酸钠、2,2-二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺、尿素。发酵培养可以是摇瓶培养或通风搅拌培养；可以在摇瓶中进行也可以在发酵罐中进行。
摇瓶培养：在三角摇瓶中分别装入适量的种子培养基和产酶培养基（10~40%，v/v），121℃灭菌20min。用接种环挑入一定量的斜面菌种，接入种子培养基中，于20~40℃下培养24~48h，获得种子液；将种子液以2.5%体积比接入含诱导剂的发酵培养基中，于20~40℃，转速100~300rpm下培养48~96h，获得含腈水合酶的发酵液。
发酵罐培养：在5L种子罐中装入适量的发酵培养基（30~65%，v/v），实罐消毒后接入一定量的斜面菌种，在温度20~40℃，搅拌转速100~300
rpm下培养24~48h，得到种子液；在50L发酵罐中装入适量的产酶培养基（30~65%，v/v），实罐消毒后接入2.5%体积比的种子液，在通气比0.1~1.0：1（每分钟内通过的空气体积与培养液体积之比），温度20~40℃，搅拌转速100~300rpm的条件下进行发酵培养48~96h，获得含腈水合酶的发酵液。
得到菌体培养液后可采用离心或过滤等方式分离出菌体细胞，利用该湿菌体或固定化细胞或从该细胞中破碎分离出的腈水合酶催化2-氨基-2,3-二甲基丁腈制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
发酵液在12000rpm、4℃条件下离心，弃上清，细胞用0.9%生理盐水洗涤后再离心收集菌体；或者发酵液用膜过滤系统进行过滤分离，并加入2倍发酵液体积的0.9%生理盐水洗涤，收集菌体。其中的膜过滤系统可以是中空纤维膜或卷式膜或陶瓷膜或超滤膜。
优选的，所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到：
（1）将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCC No：M2010050接入种子培养基中，于20~40℃下培养24~48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成如下：葡萄糖5~20.0g/L，酵母浸出粉2~8.0g/L，蛋白胨1~4.0g/L，KH2PO4 0.5~1.5g/L，K2HPO4 0.5~1.5g/L，NaCl 0.5~3.0g/L，己内酰胺0.5~2.0g/L，MgSO4 0.05~0.2g/L，CoCl2 0.01~0.05g/L，FeSO4 0.01～0.05g/L，溶剂为水，pH6.0~8.0；
（2）将种子液以1~10%体积比接入产酶培养基中，于20~40℃下培养48~96h，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组成如下：蔗糖5.0~10.0g/L，柠檬酸钠2.0~5.0g/L，牛肉膏2.0~8.0g/L，酵母粉2.0~8.0g/L，氯化钠0.5~2.0g/L，磷酸二氢钾0.5~2.5g/L，氯化钴0.005~0.01g/L，氯化铁0.005~0.01g/L，氯化锰0.005~0.01g/L，诱导剂1.0~3.0g/L，溶剂为水，pH6.0~8.0；所述诱导剂为下列之一：谷氨酸钠、2,2-二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。
所述方法如下：将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后，悬浮于水或pH6.0~10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈至底物浓度为0.03~0.3M，于15~40℃、100~200rpm下反应10~60min；反应结束后，转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
优选的，所述分离纯化方法如下：反应结束后，取转化液12000rpm离心10min，收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤，得到脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0.1Mpa，水浴加热温度40~60℃、转速60~100rpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品；将2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品溶于20~65℃的乙酸乙酯，加入体积为乙酸乙酯体积10%盐析剂正己烷，于0~4℃保温结晶；过滤，取滤渣用正己烷洗涤，干燥得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺晶体。
本发明还涉及制备过程中所用的3株新的菌株，该产生的腈水合酶均具有良好的氰离子耐受性，在KCN浓度高达10mM时，转化丙烯腈仍能保持80%以上的腈水合酶活力：
庆笙红球菌（Rhodococcus qingshengii）ZJB-09153，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M2010050，保藏日期2010年3月10日。
小球诺卡氏菌（Nocardia globerula）ZJB-09141，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M209214，保藏日期2009年9月27日。
红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）ZJB-0910，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCCNo：M209244，保藏日期2009年10月26日。该菌株已在在先中国专利申请201010107481.8中作为新菌株予以保护。
上述三个菌株均由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。
酶活定义：30℃下，每分钟催化生成1μmol的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。腈水合酶的活力以每克干细胞所含有的酶活力单位表示（U/g dcw）。
本发明中2-氨基-2,3-二甲基丁腈和2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的含量通过气相色谱法测定。
本发明的有益效果主要体现在：
（1）反应条件温和、时间短。化学水解法需要在100℃左右进行，必须配备加热和温控装置，反应条件苛刻，能耗高而且对设备要求高，耗费时间达数小时甚至数天；而生物催化法在常温下进行，反应条件温和，反应在1h之内即可完成；
（2）废水产量少。用化学水解法会排放大量含酸废水，而且废水中还含有(NH4)2SO4、Na2SO4等难处理的盐类；用腈水合酶生物催化法生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺，废水中难处理的杂质含量少，更利于实现清洁生产；
（3）成本低。化学法的原料除了2-氨基-2,3-二甲基丁腈外还有浓硫酸、浓氨水、Na2CO3和NaOH等，所需原料多，成本高。而生物催化法一般只需2-氨基-2,3-二甲基丁腈作为原料和产腈水合酶细胞作为催化剂，转化率和产率都可达95%以上，原料简单易得，成本低。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：小球诺卡氏菌ZJB-09141（CCTCC No：M209214）和红平红球菌ZJB-0910（CCTCC No：M209244）的摇瓶发酵培养
配制种子培养基：葡萄糖10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，己内酰胺1.0g/L，MgSO40.1g/L，CoCl2 0.01g/L,FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7.5，121℃灭菌20min。冷却至室温后接入斜面菌种，在温度30℃，搅拌转速150rpm下培养24h，得到种子液。
分别配制摇瓶产酶培养基A、B、C、D、E，其培养基成分如下：
A：蔗糖4.0g/L，柠檬酸钠2.0g/L，牛肉膏3.0g/L，酵母粉3.0g/L，己内酰胺0.5g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钴0.005g/L，氯化铁0.005g/L，氯化锰0.005g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为6.0；
B：蔗糖5.0g/L，柠檬酸钠2.5g/L，牛肉膏4.0g/L，酵母粉4.0g/L，己内酰胺1.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钴0.01g/L，氯化铁0.01g/L，氯化锰0.01g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为6.5；
C：蔗糖6.0g/L，柠檬酸钠3.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母粉5.0g/L，己内酰胺1.5g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钴0.015g/L，氯化铁0.015g/L，氯化锰0.015g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7.0；
D：蔗糖7.0g/L，柠檬酸钠3.5g/L，牛肉膏6.0g/L，酵母粉6.0g/L，己内酰胺2.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，氯化钴0.02g/L，氯化铁0.02g/L，氯化锰0.02g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7.5；
E：蔗糖8.0g/L，柠檬酸钠4.0g/L，牛肉膏7.0g/L，酵母粉7.0g/L，己内酰胺2.5g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钴0.025g/L，氯化铁0.025g/L，氯化锰0.025g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为8.0。
分别将上述配制好的培养基以40ml/瓶倒入5个250ml摇瓶中，121℃灭菌20min。冷却至室温后分别以2.5%的体积比接入上述种子液，于30℃，150rpm转速下培养72h。发酵培养结束后，分别收集发酵液，8000rpm离心收集菌体。分别称取0.05g湿菌体悬浮于5ml去离子水中，于30℃180rpm转速下预热5min后加入2-氨基-2,3-二甲基丁腈（终浓度为0.1M）开始反应，20min后取样1000μl，加入30μl5MHCl终止反应。通过气相色谱法测定转化液中的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺含量，计算酶活，结果如表1所示：
表1：摇瓶发酵培养液的酶活
实施例2：庆笙红球菌ZJB-09153（CCTCC No：M2010050）的发酵罐
发酵培养
配制种子培养基：葡萄糖10.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，己内酰胺1.0g/L，MgSO40.1g/L，CoCl2 0.01g/L，FeSO4 0.01g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7.5。在5L发酵罐中加入3L种子培养基，实罐消毒后接入菌种，在温度30℃，搅拌转速150rpm的条件下培养24h，得到种子液。
分别配制发酵罐产酶培养基A、B、C、D、E，其培养基成分如下：
A：蔗糖4.0g/L，柠檬酸钠2.0g/L，牛肉膏3.0g/L，酵母粉3.0g/L，己内酰胺0.5g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钴0.005g/L，氯化铁0.005g/L，氯化锰0.005g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为6.0；
B：蔗糖5.0g/L，柠檬酸钠2.5g/L，牛肉膏4.0g/L，酵母粉4.0g/L，己内酰胺1.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钴0.01g/L，氯化铁0.01g/L，氯化锰0.01g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为6.5；
C：蔗糖6.0g/L，柠檬酸钠3.0g/L，牛肉膏5.0g/L，酵母粉5.0g/L，己内酰胺1.5g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钴0.015g/L，氯化铁0.015g/L，氯化锰0.015g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7.0；
D：蔗糖7.0g/L，柠檬酸钠3.5g/L，牛肉膏6.0g/L，酵母粉6.0g/L，己内酰胺2.0g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，氯化钴0.02g/L，氯化铁0.02g/L，氯化锰0.02g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为7.5；
E：蔗糖8.0g/L，柠檬酸钠4.0g/L，牛肉膏7.0g/L，酵母粉7.0g/L，己内酰胺2.5g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，氯化钴0.025g/L，氯化铁0.025g/L，氯化锰0.025g/L，溶剂为水，用1.0M HCl或NaOH溶液调节pH为8.0。
在50L发酵罐中分别加入以上各组产酶培养基30L，实罐消毒，冷却至室温后分别以2.5%的体积比接入上述种子液。在温度30℃，搅拌转速150rpm，通气比0.5：1，罐压0.06MPa的条件下培养。培养36h后，每隔12h分别收集发酵液，8000rpm离心收集菌体。按实施例1的方法测定酶活，结果如表2所示：
表2：发酵罐发酵培养液的酶活
实施例3：含酶细胞的收集
取按照实施例1和2中C培养基发酵得到的发酵液1L，按以下固液分离方式进行处理：
A：低温高速离心，在4℃，12000rpm转速下离心10min；
B：卷式膜过滤，流量120ml/min，压力12Kg/cm2；
C：陶瓷膜过滤，流量120ml/min，压力4Kg/cm2；
D：中空纤维膜过滤，流量120ml/min，压力1.0Kg/cm2；
E：平板超滤膜过滤，流量120ml/min，压力3Kg/cm2。
然后用3L0.9%的生理盐水洗涤细胞，收集湿菌体，按实施例1的方法测定酶活，结果如表3所示：
表3：不同方式分离细胞后的细胞酶活
实施例4：
按照实施例3中低温高速离心方法获得的小球诺卡氏菌、卷式膜过滤方法获得的红平红球菌和低温高速离心方法获得的庆笙红球菌，分别取湿菌体0.05g悬浮于5ml pH 8.9的Tris-HCl缓冲液中，加入底物终浓度为0.09M的2-氨基-2,3-二甲基丁腈，分别在15、20、25、30、35、40、45℃，转速150rpm条件下转化。按实施例1的方法测定酶活，结果如表4所示：
表4：静息细胞在不同温度下的催化活性
实施例5：
按照实施例3低温高速离心方法获得的小球诺卡氏菌、卷式膜过滤方法获得的红平红球菌和低温高速离心方法获得的庆笙红球菌，分别取湿菌体0.05g悬浮于5ml不同pH值的缓冲液中。缓冲液的pH值和类型如
表5所示：
表5：缓冲液的pH值和类型
| 缓冲液 | 柠檬酸盐 | 磷酸盐 | Tris-HCl | 甘氨酸-氢氧化钠 |
| pH | 5，5.6，6.2 | 6.6，7.2，7.8 | 8.0，8.4，8.8 | 8.9，9.4 |
加入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈，使2-氨基-2,3-二甲基丁腈的终浓度为0.09M。按实施例1的方法测定酶活，结果如表6所示：
表6：静息细胞在不同pH条件下的催化活性
实施例6：
按照实施例3低温高速离心方法获得的小球诺卡氏菌，取湿菌体3.0g悬浮于180ml pH 7.8的磷酸盐缓冲液中，在30℃，转速180rpm的条件下预热5min，加入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈，使其终浓度达到0.2M，反应40min，取样气相测定转化液中产物2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的浓度。检测结果2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺浓度0.191M，产率为95.5%。
实施例7：
按照实施例3卷式膜过滤方法获得的红平红球菌，取湿菌体3.0g悬浮于200ml pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，在35℃，转速150rpm的条件下预热5min，加入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈，使其终浓度达到0.15M，反应60min，取样气相测定转化液中产物2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的浓度。检测结果2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺浓度0.133M，2-氨基-2,3-二甲基点酰胺产率为88.67%。
实施例8：
按照实施例3低温高速离心方法获得的庆笙红球菌，取湿菌体20g悬浮于1L去离子水或缓冲液，装入2L的三口反应瓶中，加入10ml底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈，使其终浓度约为0.075M，在10℃，转速180rpm的条件下反应。每隔20min添加10ml2-氨基-2,3-二甲基丁腈，累计加入10次。反应结束后取样气相检测转化液中产物2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的浓度。检测结果2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺浓度0.638M，产率为85.1%。
实施例9：
按照实施例8的方法获得的含有2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的转化液，12000rpm离心10min，收集含ADBA的上清液；加入粉末活性炭（0.5%，m/v），加热搅拌脱色30min；转入真空抽滤装置抽滤，得到含ADBA脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0.1Mpa，水浴加热温度40~60℃，转速60~100rpm减压蒸发除去底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品。该粗品溶于热的乙酸乙酯，加入10%（v/v）盐析剂正己烷，于0~4℃保温结晶；过滤，正己烷洗涤，干燥得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺晶体（收率90.5%，纯度98.5%）。所得晶体做1H NMR、红外光谱和质谱分析结果如下：
FT-IR：3521/3372/1602(vNH),2973(vCH),1675(acyl,vC=O),1399(vC-N),708(amino,vNH)；
1H NMR：δH(500MHz;CDCl3)0.86(3H,d,Me),0.90(3H,d,Me),1.3(3H,s,Me),2.2(1H,m,CH),5.5(1H,br s,NH),7.4(1H,br s,NH)；
ESI-MS：m/z283(100%,[2M+Na]+),261(82,[2M+H]+),131(6.4,M+)。
Claims (3)
1.一种微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括：在以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物，以庆笙红球菌（Rhodococcusqingshengii）CCTCC No：M2010050发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6.0～10.0、20～40℃下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺；所述反应在水或pH6.0～10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行；所述反应体系中底物初始浓度为0.03～0.3M；所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCC No：M2010050经发酵获得的含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5～50g/L；所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到：
（1）将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCC No：M2010050接入种子培养基中，于20～40℃下培养24～48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成如下：葡萄糖5～20.0g/L，酵母浸出粉2～8.0g/L，蛋白胨1～4.0g/L，KH2PO40.5～1.5g/L，K2HPO40.5～1.5g/L，NaCl0.5～3.0g/L，己内酰胺0.5～2.0g/L，MgSO40.05～0.2g/L，CoCl20.01～0.05g/L，FeSO40.01～0.05g/L，溶剂为水，pH6.0～8.0；
（2）将种子液以1～10%体积比接入产酶培养基中，于20～40℃下培养48～96h，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组成如下：蔗糖5.0～10.0g/L，柠檬酸钠2.0～5.0g/L，牛肉膏2.0～8.0g/L，酵母粉2.0～8.0g/L，氯化钠0.5～2.0g/L，磷酸二氢钾0.5～2.5g/L，氯化钴0.005～0.01g/L，氯化铁0.005～0.01g/L，氯化锰0.005～0.01g/L，诱导剂1.0～3.0g/L，溶剂为水，pH6.0～8.0；所述诱导剂为己内酰胺。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化水合反应如下：将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后，悬浮于水或pH6.0～10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈至底物浓度为0.03～0.3M，于20～40℃、100～200rpm下反应10～60min；反应结束后，转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：反应结束后，取转化液12000rpm离心10min，收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤，得到脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0.1Mpa，水浴加热温度40～60℃、转速60～100rpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品；将2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品溶于20～65℃的乙酸乙酯，加入体积为乙酸乙酯体积10%盐析剂正己烷，于0～4℃保温结晶；过滤，取滤渣用正己烷洗涤，干燥得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺晶体。
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| Jing-LiangXu等."Rhodococcusqingshengiisp.nov. a carbendazim-degrading bacterium".《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》.2007 |
| 郑裕国 等."腈转化酶在精细化学品生产中的应用".《生物工程学报》.2009,第25卷(第12期),第1795-1807页. |
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