CN102776195A - 微小rna用于调控b7-h4基因表达 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微小RNA用于调控B7-H4基因表达，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体:5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’。所述微小RNA为miR-378。本发明人采用体外生物学功能实验证实，hsa-miR-378可与B7-H4基因3’-UTR结合，从而调控B7-H4分子表达；可通过调控B7-H4信号通路和/或miR-378表达及功能以发挥抗肿瘤作用。

Description

微小 RNA 用于调控 B7-H4 基因表达

技术领域

本发明属于生物技术和医学技术领域，具体地说，本发明涉及基因表达调控技术领域，特别涉及一种微小 RNA 用于调控 B7-H4 基因表达。

背景技术

肿瘤一直严重威胁着人类的健康和生命，传统的治疗方法不尽如人意。免疫治疗通过提高肿瘤的免疫原性，诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的，是一种变被动为主动的生物治疗方法。由 T 细胞介导的细胞免疫是抗肿瘤免疫的主要形式，机体通过对肿瘤抗原的特异性识别，激活 T 细胞，产生相应的免疫杀伤作用。

业已证实， T 细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用：一是抗原肽 -MHC 复合物，由 T 细胞抗原受体（ TCR ）识别；二是协同刺激信号，由抗原递呈细胞（ APC ）和 T 细胞表面的协同刺激分子配体和受体对提供。其中， B7-CD28 是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号，由表达在 T 细胞上的 CD28 和表达在抗原递呈细胞表面的 CD80 和 CD86 相互作用产生【 Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol 2002, 2 (2): 116-126. 】。经过多年的研究， B7-CD28 协同刺激信号的内容得到了极大的丰富，包括数个结构和功能相似的配体和受体组成的 B7-CD28 家族，其中 B7 分子的主要成员有 CD80 、 CD86 、 B7-DC 、 B7-H1 、 ICOSL 、 B7-H3 和 B7-H4 等，受体包括 CD28 、 CTLA-4 、 ICOS 、 PD-1 和 BTLA 等【 Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisited. Annu Rev Immunol 2005, 23: 515-548. 】。这些协同刺激信号分子不仅提供促进 T 细胞生长、分化和产生细胞因子的正性信号，同时还能通过提供负性信号来限制、终止和 / 或减弱 T 细胞应答。 T 细胞的活化正是这种正性信号和负性信号相互平衡的结果【 Carreno BM, Collins M. The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulation and inhibition of immune responses. Annu Rev Immunol 2002, 20: 29-53. 】。其中，负性信号主要是由 B7 家族的新成员 B7-H1 、 B7-H3 和 B7-H4 提供。如果这些负性协同刺激分子表达异常或功能障碍，就将导致疾病发生发展，如恶性肿瘤和自身免疫性疾病等。

（ B7S1 、 B7x 、 VTCN1 ）是 2003 年被发现的协同刺激信号 B7-CD28 家族中的最新成员【 Sica GL, et al. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity. Immunity 2003,18(6):849-61. 】，主要通过抑制 T 细胞增殖、细胞因子的分泌和细胞周期的进程等方式来负性调控 T 细胞的免疫应答，同时它还可以促进人体正常上皮细胞向恶性转化，防止恶变表皮细胞发生失巢凋亡，从而有利于肿瘤的发生和生长。目前， B7-H4 已被发现在结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、肺癌和骨髓瘤等多种恶性肿瘤组织中存在高表达，且与患者预后及临床病理参数密切相关【 Zou W, Chen L. Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment. Nat Rev Immunol 2008,8(6):467-77 】。在肿瘤组织中 B7-H4 主要表达在肿瘤细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞。高表达 B7-H4 的前列腺癌更容易转移、复发，患者死亡率也更高【 Zang X, et al. B7-H3 and B7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with disease spread and poor outcome. Proc Natl Acad Sci USA 2007,104(49): 19458-19463. 】，而高表达 B7-H4 的胃癌、卵巢癌和肾癌患者预后更差【 Jiang J, et al. Tumor expression of B7-H4 predicts poor survival of patients suffering from gastric cancer. Cancer Immunol Immunother 2010, 59(11): 1707-1714. 】。

目前对 B7-H4 在肿瘤组织中表达的调控机制尚不明确。有研究发现，肿瘤微环境中的某些细胞因子和炎症介质对 B7-H4 的表达存在调节作用。 IL-6 和 IL-10 能诱导 B7-H4 在单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和骨髓 DC 细胞上表达。 DC 细胞分化因子 GM-CSF （粒细胞 / 巨噬细胞集落刺激因子）和 IL-4 能降低 IL-6 和 IL-10 对 B7-H4 表达的诱导作用【 Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, et al. B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J Exp Med,2006,203(4):871-881. 】。与 B7-H1 不同， IFN- γ对 B7-H4 表达的影响却很小。在人卵巢癌中，肿瘤相关 Treg 细胞诱导巨噬细胞产生大量 IL-6 和 IL-10 ，进而刺激 B7-H4 以自分泌和 / 或旁分泌方式在 APC 上表达。然而， IL-4 、 IL-6 、 IL-10 和 GM-CSF 都不能诱导 B7-H4 在肿瘤细胞上表达【 Kryczek I, Wei S, Zhu G, et al. Relationship between B7-H4, regulatory T cells, and patient outcome in human ovarian carcinoma. Cancer Res, 2007, 67 (18):8900-8905. 】。

广泛表达于淋巴样及非淋巴样组织，但其蛋白质在各种组织中不表达或低表达，在树突状细胞、单核 / 巨噬细胞、 B 细胞和 T 细胞表面诱导性表达【 Choi IH, et al. Genomic organization and expression analysis of B7-H4, an immune inhibitory molecule of the B7 family. J Immunol 2003,171(9):4650-4654. 】。正常人类组织不表达或极低表达 B7-H4 ，但在多种肿瘤组织中发现 B7-H4 高表达。由此提示，这种负性协同刺激分子蛋白在正常组织中的表达受到转录后调控，而这种调控机制在肿瘤中存在异常。因此，调控 B7-H4 表达有望成为一种新的抗肿瘤治疗途径，具有潜在应用价值【 He C, et al. The inhibitory role of b7-h4 in antitumor immunity: association with cancer progression and survival. Clin Dev Immunol 2011:695834. 】。

是近年来发现于真核细胞中的一类长约 22 个核苷酸的内源性非编码小分子 RNA ，可通过与靶 mRNA 的 3'-UTR 互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。越来越多的研究证实， miRNA 在肿瘤组织中表达异常，与肿瘤发生发展及患者治疗反应密切相关；如 hsa-miR-21 在结直肠癌组织中表达上调，与结直肠癌 TNM 分期及患者预后密切相关【 Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008, 299(4): 425-36. 】。最近，这种在肿瘤组织中表达异常的 miRNA 有的已被证实具有显著的抗肿瘤活性【 Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. Cancer J 2012,18(3):275-84. 】，如 miR-145 和 miR-33a 能抑制 HCT-116 结直肠癌细胞移植瘤的生长【 Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR-33a is efficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224. 】。另外， miR-122 由于能调控丙型肝炎病毒 RNA 的丰度，其互补序列用于治疗丙型肝炎病毒感染患者已经进入 II 期临床试验【 Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S, et al. A randomized, double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of concept study of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatment naBve patients with genotype 1 (gt1) chronic HCV infection. Hepatology. 2011:1430A. 】，显示出 miRNA 作为一种极其重要的基因表达调控因子和作用靶标，具有潜在的治疗作用和实际应用价值。

虽然本领域中已知某些微小 RNA 与肿瘤具有一定的相关性，但本领域中已知的 miRNA 种类繁多，功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案的选择及预后的特定 miRNA 存在较大难度。目前，本领域中尚无 miR-378 和 B7-H4 基因相关性的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种微小 RNA 对 B7-H4 基因表达的调控，特别是 miR-378 用于调控 B7-H4 基因表达。

本发明的目的是通过以下方式实现的：一种微小 RNA 用于调控 B7-H4 基因表达，其特征在于，所述的微小 RNA 为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体 : 5 ’ -ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3 ’ 。

优选地，所述微小 RNA 能与 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 结合，调控 B7-H4 基因表达。

优选地，所述微小 RNA 为 miR-378 。

优选地，所述微小 RNA 通过化学合成得到。

优选地，所述微小 RNA 来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。

本发明微小 RNA 的获取来源可以是来自化学合成和 / 或存在该基因序列的细胞、组织，组织可以选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。

在本文中，术语“样本”指的是潜在可能含有微小 RNAmiR-378 的离体循环血样品，优选是来自人的样品。尽管用抽提出血总 RNA 的纯化样品也能够在本发明中使用，但是，本发明的样品优选是未经提纯的、含有血总 RNA 的裂解液体样品。本领域技术人员知晓将固体的有核血细胞裂解或抽提、纯化并保持其中 miRNA 成分不被降解的细胞分子生物学技术。本发明的样品可以是经过处理的样品，如稀释处理、血细胞裂解处理以及 PCR 扩增等，也可以是未经处理的样品。经过处理的样品可以进一步纯化，以富集 miRNA 。

在本文中，术语“ miR-378 ”指的是指的是包含序列“ ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG ”或其同源序列的微小 RNA 。本领域中已知各种来源的 miR-378 ，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同源序列均包含在本发明的术语“ miR-378 ”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的 miR-378 序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物化学修饰，且仍然具有生物学活性的衍生 RNA 。

本发明人采用实时荧光定量 PCR 技术测定了 6 例结直肠癌 组织和正常组织中 miRNA 的表达；统计分析发现， hsa-miR-378 在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织，结果如图 1 所示。本发明人采用生物信息学软件 miRanda 预测发现， hsa-miR-378 可能与 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 结合，结果如图 2 所示。随后，本发明人采用体外生物学功能实验证实， hsa-miR-378 可与 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 结合，从而调控 B7-H4 分子表达；这为通过调控 B7-H4 信号通路和 / 或 miR-378 表达及功能以发挥抗肿瘤作用的治疗途径奠定了基础。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图 1 为结直肠癌组织中和正常组织 miR-378 表达量测定结果；

图 2 为 miRanda 软件预测结果；

图 3 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 的 PCR 扩增结果；

图 4 B7-H4/3 ’ -UTR/pGEM-T 重组载体酶切验证结果；

图 5 B7-H4/3 ’ -UTR/pGEM-T 重组载体测序验证结果；

图 6 B7-H4/3 ’ -UTR/ pGL-3 重组载体酶切验证结果；

图 7 B7-H4/3 ’ -UTR/ pGL-3 重组载体测序验证结果；

图 8 hsa-miR-378 对 B7-H4/3 ’ -UTR/pGL-3 重组载体表达活性的抑制作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

一、试剂与材料

1 、试剂

胎牛血清（ Hyclone ，美国）；完全培养基：每升 RPMI1640 （ Hyclone ，美国）中，添加胎牛血清 100ml 、 L- 谷氨酰胺 0.15g 、 2- 巯基乙醇 10.0 ml （ 5 × 10^-3mol/L ）；脂质体 2000 （ Invitrogen ，美国）；青霉素、链霉素（上海生工生物技术有限公司）； TRIzol （ Invitrogen ，美国）；琼脂糖（ LP0028A, Oxoid Ltd, 英国）；凝胶电泳加样液和溴化乙锭（ EtBr ）（上海生工生物技术有限公司）；胶回收 DNA 试剂盒和质粒抽提试剂盒（ Axygen ，美国）；蔗糖、 Triton-100 、 MgCl₂ • 6H₂O 、三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷（ Tris ）、盐酸、 EDTA 、 NaCl 、苯酚、氯仿、异戊醇、十二烷基磺酸钠（ SDS ）和无水乙醇等实验所用试剂均为分析纯或优级纯；双荧光素酶检测试剂盒（ Promega ，美国）。 hsa-miR-378 及其实时荧光定量试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司）； Taq DNA 聚合酶、 M-MuLV 反转录酶、 Xba I 限制性内切酶（ MBI ，美国）； T₄ DNA 连接酶（ Takara ，日本）； PCR 引物（ Invitrogen ， PAGE 级）。 pGEM-T 、 pGL-3 、 pRL-TK 载体（ Promega ，美国）。

、组织样本

收集 6 例结直肠癌 患者的新鲜手术组织样本，包括癌组织和远端正常肠组织（离癌边沿 5cm ）。所有患者经 HE 染色、病理诊断确认为结直肠癌；术前未接受化疗或放疗。

、细胞株

中国仓鼠卵巢细胞株 CHO （ ATCC ，美国）；大肠杆菌 TP10 （ Novagen ，美国）。细胞株经检测，无支原体污染。

、仪器

CO₂ 培养箱、低温高速离心机、常速离心机（ Thermo ，德国）；倒置显微镜（ Olympus ，日本）；微弱发光测量仪（ BPCL-K ，中科院生物物理研究所）； PCR 仪（ S1000 ， Bio-Rad ，美国）；电泳仪（ Bio-Rad ，美国）；微量定量分光光度计（ Alpha Innotech ，美国）；凝胶成像系统（ GeneGenius ， SYNGENE ，英国）。

二、实验方法

1 、细胞培养

采用含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基进行培养，培养液中含有 100kU/L 青霉素、 100mg/L 链霉素，培养条件为 37 ° C 、 5% CO₂ 、饱和湿度。 CHO 细胞株贴壁生长，传代时用 0.25% 胰酶消化。间隔 2-3 天更换新鲜培养基。

、实时荧光定量分析 hsa-miR-378 表达量

采用 Trizol 试剂按照使用说明书从 6 对结直肠癌和正常组织样本中提取总 RNA 。实时荧光定量 PCR 试剂盒测定 RNA 样本中 hsa-miR-378 的表达量；以 U6 RNA 为内对照。取 5µM RT 引物工作液 1µL ，加入 79µL RNsae-free 水，配置成 62.5nM RT 引物工作液。 50µL RT 反应体系，加入 2µL RNA 样品，引物工作液各 4µL ，加 RNsae-free 水至 19µL 。以上体系混匀后，瞬时离心， 70 ° C 放置 10min ，冰育 2min ，再加入以下试剂进行 RT 反应： 1 × RT buffer ， 1µL dNTP （ 10mM ）， 40U RNase inhibitor ， 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50µL 。 RT 反应程序： 42 ° C 60min ， 70 ° C 10min 。 RT 反应结束后立即将 cDNA 产物取出，快速置冰上冷却，后续所有步骤都在冰上进行。接着进行 qRT-PCR 反应定量测定 hsa-miR-378 表达量， 20µL 反应体系： 10µL SYBR Green Mix ， 2µL RT 反应产物， Bulge-Loop^TM miR-378 正向引物和反向引物（ 5µM ）各 2µL ，加 RNsae-free 水至 20µL 。反应程序： 95 ° C 预变性 20sec ；接着进行 40 个循环（ 95 ° C 变性 10sec ； 60 ° C 退火 20sec ； 70 ° C 延伸 5sec ）。

、 miRNA 作用靶位点的预测

采用生物信息学软件 miRanda （ www.microRNA.org ）预测可能与 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 结合的 miRNA 。

、构建含 B7-H4 基因 3'-UTR 片段的荧光素酶表达载体

采用 Trizol 试剂按照使用说明书从 MDA-MB-435 细胞中提取总 RNA ，以 Oligo(dT) 为逆转录引物，用 M-MuLV 反转录酶将 RNA 反转录为 cDNA 。

μ L PCR 反应体系中含有 2 μ L cDNA 模板， 1.25U Taq DNA 聚合酶， 1 ×缓冲液， 0.2 mmol/L dNTPs ， 0.4µmol/L 正向引物 5 ’ - GGC TAG TCT AGA ACT CAG CTG GGG TGA TTT CG-3 ’ 和反向引物 5 ’ - GGC TAG TCT AGA TGT AAT ACA GTC ACC GTG GC-3 ’ （下划线碱基为内切酶 Xba I 识别序列）。热循环条件为： 94 ° C 预变性 5min ；然后以 94 ° C 变性 20sec ， 60 ° C 退火 30sec ， 72 ° C 延伸 1min ，扩增 35 个循环；最后 72 ° C 延伸 7min 使反应完全。反应完成后，取反应产物 3µL 在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳（ 1 × TAE 电泳缓冲液，电压 200V ，恒压电泳 5min ），凝胶成像系统拍摄电泳图谱。扩增成功的产物采用 Sanger ’ s 测序法测定 DNA 序列（ Invitrogen ）；另取 30µL 反应产物在 2.0% 琼脂糖凝胶上进行电泳（ 1 × TAE 电泳缓冲液，电压 100V ，恒压电泳 10min ），然后采用胶回收试剂盒回收纯化目的 DNA 片段，并用微量紫外分光光度计测定其浓度。

参考产品说明书，将纯化的 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 片段克隆到 pGEM-T 载体；热转化大肠杆菌 TP10 感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白斑摇菌，抽提质粒； PCR 扩增及酶切鉴定后再进行测序验证。将测序正确的重组子用 Xba I 酶切后，回收 3 ’ -UTR 片段。

用 pGL-3 和 pRL-TK 载体质粒转化常规制备的大肠杆菌 TP10 感受态细胞，进行大量扩增；试剂盒抽提法大量制备 pGL-3 和 pRL-TK 质粒，电泳检测质粒的纯度和含量。用限制性内切酶 Xba I 对提取的 pGL-3 质粒进行酶切，试剂盒直接回收大片段的酶切产物。参考产品说明书，将酶切回收纯化后的 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 片段按适当比例与 pGL-3 载体的 Xba I 酶切片段进行连接反应， 16 ° C 酶连过夜 。取 10 μ L 连接产物直接转化 100 μ L 大肠杆菌 TP10 感受态细胞。经过含有氨苄青霉素的 LB 平板固体培养基中选择培养。从转化子的平板上随机挑取 10 个菌落，经过含氨苄青霉素的 LB 液体培养基扩增培养；经 PCR 扩增、酶切和测序鉴定后，用试剂盒抽提质粒备用。

、细胞转染

首先，将培养于含有 10% FCS 、 100kU/L 青霉素、 100mg/L 链霉素的 RPMI1640 完全培养基中细胞株，按 1 × 10⁴ 个细胞 / 孔的量在 24 孔板中接种指数生长期的细胞，培养过夜，直到细胞 80% 汇片。

然后，将一定量的 hsa-miR-378 、 B7-H4/3 ′ -UTR/pGL3 重组质粒和内参质粒 pRL-TK 稀释至 50 μ L 不含血清和抗生素的 Opti-MEM®I 培养基中，用移液枪混合均匀；然后将 1 μ L 脂质体 2000 悬液加入 50 μ L 不含血清和抗生素的 Opti-MEM^®I 培养基中，在室温孵育 5min ；最后将两者混合在一起，充分混匀，静置 20min ，使 hsa-miR-378 、重组质粒和内参质粒与脂质体充分结合。将只加脂质体的孔作为阴性对照。

最后，吸去接种到 24 孔板中的培养液，用不含血清和抗生素的 Opti-MEM®I 培养基洗一次，在每个孔中加入 100 μ L 上述混合物，培养 3h ；吸弃培养板中的转染培养液，向各孔加入 100 μ L 有血清无抗生素的 Opti-MEM^®I 培养基，继续培养 24h 后进行检测。

、双荧光素酶报告系统基因活性测定

将转染有 pGL-3 和 pRL-TK 的 CHO 细胞经过 24h 培养后收集，吸弃培养基，用 PBS 洗 1 次。加入裂解液 20 μ L/ 孔，室温摇动 15 min 。按照双荧光素酶检测试剂盒的操作说明书，取 100 μ L 荧光素酶分析缓冲液 II 于 1.5ml 离心管中，设定化学发光仪延迟 2sec ，发光仪测读 10sec ；将全部细胞裂解液加入到离心管中，用移液枪轻轻抽吸 2-3 次混匀（不要旋涡振动）；将离心管放入化学发光仪中测读萤火虫荧光素酶发光值 F1 ；将离心管移出发光仪，加入 100 μ L Stop&Glo 试剂，快速旋涡混匀后，将离心管重放回发光仪中测读海肾荧光素酶发光值 F2 。应用 SPSS.10 统计软件的卡方检验分析受试组与空白对照组的 F1/F2 比值差异，以判断 hsa-miR-378 的调控作用。

三、结 果

1. hsa-miR-378 在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织

采用实时荧光定量 PCR 技术测定了 6 例结直肠癌 组织和正常组织中 miRNA 的表达；统计分析发现， hsa-miR-378 在结直肠癌组织中的表达显著低于正常组织，结果如图 1 所示。

与 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 结合

我们采用生物信息学软件 miRanda 预测发现， hsa-miR-378 可能与 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 结合，结果如图 2 所示。

构建 B7-H4/3'-UTR/pGL-3 荧光素酶表达载体

PCR 扩增得到长度为 700bp 的 B7-H4 基因 3 ’ -UTR 序列（图 3 ），切胶纯化回收后，将片段插入 pGEM-T 载体，转化感受态大肠杆菌。随机挑克隆扩增后提取质粒 DNA 。经过 Xba I 酶切鉴定，证实酶切后得到的基因片段与预期大小 758bp 相符（图 4 ）。测序结果表明，插入 pGEM-T 载体的 B7-H4 基因 3'-UTR 片段序列正确，如图 5 所示。抽提 pGEM-T 载体，酶切获得 B7-H4 基因 3'-UTR 片段；将其插入 pGL-3 载体，然后转化感受态大肠杆菌。酶切后得到的基因片段与预期大小 758bp 相符（图 6 ）；测序结果证实插入序列正确（图 7 ）。

、 hsa-miR-378 抑制重组荧光素酶表达活性

将 200ng 重组 B7-H4/3'-UTR/pGL-3 荧光素酶表达载体、 20ng 内参质粒 pRL-TK 与 10pmol hsa-miR-378 共同转染 CHO 细胞后，采用荧光素酶活性检测试剂盒检测转染培养后 CHO 细胞中荧光素酶的活性。结果显示，在 CHO 细胞中加入 hsa-miR-378 后，荧光素酶的活性比值（ pGL-3/pRL-TK ）显著低于不加 hsa-miR-378 的细胞（图 8 ）。由此表明， hsa-miR-378 通过与 B7-H4 基因 3'-UTR 上靶序列 结合，抑制了荧光素酶的表达。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.微小RNA用于调控B7-H4基因表达，其特征在于，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体: 5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能与B7-H4基因3’-UTR结合，调控B7-H4基因表达。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA为miR-378。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通过化学合成而得。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。

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