CN102776190A

CN102776190A - 一种微小rna用于调控pten基因表达

Info

Publication number: CN102776190A
Application number: CN2012102525931A
Authority: CN
Inventors: 汪维鹏; 陈兰心; 朱健洁
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2012-11-14

Abstract

本发明公开了一种微小RNA用于调控PTEN基因表达，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体:5’-caaagugcucauagugcagguag-3’。所述微小RNA为miR-20b，本发明人采用体外生物学功能实验证实，hsa-miR-20b可与PTEN基因3’-UTR结合，从而抑制PTEN分子表达；可通过调控PTEN信号通路和/或miR-20b表达及功能以发挥抗肿瘤作用。

Description

一种微小 RNA 用于调控 PTEN 基因表达

技术领域

本发明属于生物技术和医学技术领域，具体地说，本发明涉及基因表达调控技术领域，特别涉及微小 RNA 用于调控 PTEN 基因表达。

背景技术

基因于 1997 年被发现，是一种具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因（ Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science 1997, 275(5308):1943-7 ），通过负性调控 PI3K/Akt 通路，调节细胞生长和增殖（ Wu H, Goel V, Haluska FG. PTEN signaling pathways in melanoma. Oncogene 2003, 22(20):3113-22 ）。研究发现，在多种肿瘤中 PTEN 基因有不同程度的突变或丢失，如结直肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌及黑色素瘤等。 PTEN 分子表达缺失与结直肠癌的肝转移以及患者的生存率显著相关（ Sawai H, Yasuda A, Ochi N, et al. Loss of PTEN expression is associated with colorectal cancer liver metastasis and poor patient survival. BMC Gastroenterol 2008,8:56 ）。因此，调控 PI3K/PTEN/AKT 信号通路将成为一种潜在的抗肿瘤治疗途径（ Zhang J, Roberts TM, Shivdasani RA. Targeting PI3K signaling as a therapeutic approach for colorectal cancer. Gastroenterology 2011,141(1):50-61 ）。

是近年来发现于真核细胞中的一类长约 22 个核苷酸的内源性非编码小分子 RNA ，可通过与靶 mRNA 的 3'-UTR 互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。越来越多的研究证实， miRNA 在肿瘤组织中表达异常，与肿瘤发生发展及患者治疗反应密切相关；如 hsa-miR-21 在结直肠癌组织中表达上调，与结直肠癌 TNM 分期及患者预后密切相关（ Schetter AJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008, 299(4): 425-36 ）。近期研究还发现， hsa-miR-21 能抑制 PTEN 基因在人肝癌组织中的表达（ Meng F, Henson R, Wehbe-Janek H, et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer. Gastroenterology 2007,133(2):647-58 ）。这种在肿瘤组织中表达异常的 miRNA 有的已被证实具有显著的抗肿瘤活性【 Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. Cancer J 2012,18(3):275-84. 】，如 miR-145 和 miR-33a 能抑制 HCT-116 结直肠癌细胞移植瘤的生长【 Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR-33a is efficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224. 】。另外， miR-122 由于能调控丙型肝炎病毒 RNA 的丰度，其互补序列用于治疗丙型肝炎病毒感染患者已经进入 II 期临床试验【 Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S, et al. A randomized, double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of concept study of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatment naBve patients with genotype 1 (gt1) chronic HCV infection. Hepatology. 2011:1430A. 】，显示出 miRNA 作为一种极其重要的基因表达调控因子和作用靶标，具有潜在的治疗作用和实际应用价值。

虽然本领域中已知某些微小 RNA 与肿瘤具有一定的相关性，但本领域中已知的 miRNA 种类繁多，功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案的选择及预后的特定 miRNA 存在较大难度。目前，本领域中尚无 miR-20b 和 PTEN 基因相关性的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种微小 RNA 对 PTEN 基因表达的调控，特别是 miR-20b 用于调控 PTEN 基因表达。

本发明的目的是通过以下方式实现的：一种微小 RNA 用于调控 PTEN 基因表达，其特征在于，所述的微小 RNA 为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体 : 5 ’ -caaagugcucauagugcagguag- 3 ’。

优选地，所述微小 RNA 能与 PTEN 基因 3 ’ -UTR 结合，抑制 PTEN 基因表达。

优选地，所述微小 RNA 为 miR-20b 。

优选地，所述微小 RNA 通过化学合成得到。

优选地，所述微小 RNA 来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。

本发明微小 RNA 的获取来源可以是来自化学合成和 / 或存在该基因序列的细胞、组织，组织可以选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。

在本文中，术语“样本”指的是潜在可能含有微小 RNAmiR-20b 的离体循环血样品，优选是来自人的样品。尽管用抽提出血总 RNA 的纯化样品也能够在本发明中使用，但是，本发明的样品优选是未经提纯的、含有血总 RNA 的裂解液体样品。本领域技术人员知晓将固体的有核血细胞裂解或抽提、纯化并保持其中 miRNA 成分不被降解的细胞分子生物学技术。本发明的样品可以是经过处理的样品，如稀释处理、血细胞裂解处理以及 PCR 扩增等，也可以是未经处理的样品。经过处理的样品可以进一步纯化，以富集 miRNA 。

在本文中，术语“ miR-20b ”指的是指的是包含序列“ caaagugcucauagugcagguag ”或其同源序列的微小 RNA 。本领域中已知各种来源的 miR-20b ，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同源序列均包含在本发明的术语“ miR-20b ”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的 miR-20b 序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物化学修饰，且仍然具有生物学活性的衍生 RNA 。

发明人采用实时荧光定量 PCR 技术测定了 6 例结直肠癌组织和癌旁组织中 miRNA 的表达；统计分析发现， hsa-miR-20b 在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织，结果如图 1 所示。本发明人采用生物信息学软件 miRanda 和 TargetScan 联合预测发现， hsa-miR-20b 可能与 PTEN 基因 3 ’ -UTR 结合，结果如图 2 所示。随后，发明人采用体外生物学功能实验证实， hsa-miR-20b 可与 PTEN 基因 3 ’ -UTR 结合，从而抑制 PTEN 分子表达，可通过调控 PTEN 信号通路和 / 或 miR-20b 表达及功能以发挥抗肿瘤作用。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图 1 为为结直肠癌组织中和正常组织 miR-20b 表达量测定结果；

图 2 A 为 miRanda 软件预测结果 ; 图 2 B 为 TargetScan 软件预测结果；

图 3 为 PTEN 基因 3 ’ -UTR 的 PCR 扩增结果；

图 4 为 PTEN/3 ’ -UTR/pGEM-T 重组载体酶切验证结果；

图 5 为 PTEN/3 ’ -UTR/pGEM-T 重组载体测序验证结果；

图 6 为 PTEN/3 ’ -UTR/ pGL-3 重组载体酶切验证结果；

图 7 为 PTEN/3 ’ -UTR/ pGL-3 重组载体测序验证结果；

图 8 为 hsa-miR-20b 对 PTEN/3 ’ -UTR/ pGL-3 重组载体表达活性的抑制作用。请提供黑白图

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

一、试剂与材料

1 、试剂

胎牛血清（ Hyclone ，美国）；完全培养基：每升 RPMI1640 （ Hyclone ，美国）中，添加胎牛血清 100ml 、 L- 谷氨酰胺 0.15g 、 2- 巯基乙醇 10.0 ml （ 5 × 10^-3mol/L ）；脂质体 2000 （ Invitrogen ，美国）；青霉素、链霉素（上海生工生物技术有限公司）； TRIzol （ Invitrogen ，美国）；琼脂糖（ LP0028A, Oxoid Ltd, 英国）；凝胶电泳加样液和溴化乙锭（ EtBr ）（上海生工生物技术有限公司）；胶回收 DNA 试剂盒和质粒抽提试剂盒（ Axygen ，美国）；蔗糖、 Triton-100 、 MgCl₂ • 6H₂O 、三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷（ Tris ）、盐酸、 EDTA 、 NaCl 、苯酚、氯仿、异戊醇、十二烷基磺酸钠（ SDS ）和无水乙醇等实验所用试剂均为分析纯或优级纯；双荧光素酶检测试剂盒（ Promega ，美国）。 hsa-miR-20b 及其实时荧光定量试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司）； Taq DNA 聚合酶、 M-MuLV 反转录酶、 Xba I 限制性内切酶（ MBI ，美国）； T₄ DNA 连接酶（ Takara ，日本）； PCR 引物（ Invitrogen ， PAGE 级）。 pGEM-T 、 pGL-3 、 pRL-TK 载体（ Promega ，美国）。

、组织样本

收集 6 例结直肠癌患者的新鲜手术组织样本，包括癌组织和远端正常肠组织（离癌边沿 5cm ）。所有患者经 HE 染色、病理诊断确认为结直肠癌；术前未接受化疗或放疗。

、细胞株

中国仓鼠卵巢细胞株 CHO （ ATCC ，美国）；大肠杆菌 TP10 （ Novagen ，美国）。细胞株经检测，无支原体污染。

、仪器

CO₂ 培养箱、低温高速离心机、常速离心机（ Thermo ，德国）；倒置显微镜（ Olympus ，日本）；微弱发光测量仪（ BPCL-K ，中科院生物物理研究所）； PCR 仪（ S1000 ， Bio-Rad ，美国）；电泳仪（ Bio-Rad ，美国）；微量定量分光光度计（ Alpha Innotech ，美国）；凝胶成像系统（ GeneGenius ， SYNGENE ，英国）。

二、实验方法

1 、细胞培养

采用含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基进行培养，培养液中含有 100kU/L 青霉素、 100mg/L 链霉素，培养条件为 37 ° C 、 5% CO₂ 、饱和湿度。 CHO 细胞株贴壁生长，传代时用 0.25% 胰酶消化。间隔 2-3 天更换新鲜培养基。

、实时荧光定量分析 hsa-miR-20b 表达量

采用 Trizol 试剂按照使用说明书从 6 对结直肠癌和正常组织样本中提取总 RNA 。实时荧光定量 PCR 试剂盒测定 RNA 样本中 hsa-miR-20b 的表达量；以 U6 RNA 为内对照。

、 miRNA 作用靶位点的预测

采用生物信息学软件 miRanda （ www.microRNA.org ）和 TargetScan （ http://www.targetscan.org/ ）预测可能与 PTEN 基因 3 ’ -UTR 结合的 miRNA 。

、构建含 PTEN 基因 3'-UTR 片段的荧光素酶表达载体

采用 Trizol 试剂按照使用说明书从 MDA-MB-435 细胞中提取总 RNA ，以 Oligo(dT) 为逆转录引物，用 M-MuLV 反转录酶将 RNA 反转录为 cDNA 。

μ L PCR 反应体系中含有 2 μ L cDNA 模板， 1.25U Taq DNA 聚合酶， 1 ×缓冲液， 0.2 mmol/L dNTPs ， 0.4µmol/L 正向引物 5 ’ -GC TCT AGA TGA CAC CAC TGA CTC TGA TC-3 ’和反向引物 5 ’ -GC TCT AGA CGC AAA CAA CAA GCA GTG AC-3 ’（下划线碱基为内切酶 Xba I 识别序列）。热循环条件为： 94 ° C 预变性 5min ；然后以 94 ° C 变性 20sec ， 60 ° C 退火 30sec ， 72 ° C 延伸 1min ，扩增 35 个循环；最后 72 ° C 延伸 7min 使反应完全。反应完成后，取反应产物 3µL 在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳（ 1 × TAE 电泳缓冲液，电压 200V ，恒压电泳 5min ），凝胶成像系统拍摄电泳图谱。扩增成功的产物采用 Sanger ’ s 测序法测定 DNA 序列（ Invitrogen ）；另取 30µL 反应产物在 2.0% 琼脂糖凝胶上进行电泳（ 1 × TAE 电泳缓冲液，电压 100V ，恒压电泳 10min ），然后采用胶回收 DNA 试剂盒回收纯化目的 DNA 片段，并用微量紫外分光光度计测定其浓度。

参考产品说明书，将纯化的 PTEN 基因 3 ’ -UTR 片段克隆到 pGEM-T 载体；热转化大肠杆菌 TP10 感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白斑摇菌，抽提质粒； PCR 扩增及酶切鉴定后再进行测序验证。将测序正确的重组子用 Xba I 酶切后，回收 3 ’ -UTR 片段。

用 pGL-3 和 pRL-TK 载体质粒转化常规制备的大肠杆菌 TP10 感受态细胞，进行大量扩增；试剂盒抽提法大量制备 pGL-3 和 pRL-TK 质粒，电泳检测质粒的纯度和含量。用限制性内切酶 Xba I 对提取的 pGL-3 质粒进行酶切，试剂盒直接回收大片段的酶切产物。参考产品说明书，将酶切回收纯化后的 PTEN 基因 3 ’ -UTR 片段按适当比例与 pGL-3 载体的 Xba I 酶切片段进行连接反应， 16 ° C 酶连过夜。取 10 μ L 连接产物直接转化 100 μ L 大肠杆菌 TP10 感受态细胞。经过含有氨苄青霉素的 LB 平板固体培养基中选择培养。从转化子的平板上随机挑取 10 个菌落，经过含氨苄青霉素的 LB 液体培养基扩增培养；经 PCR 扩增、酶切和测序鉴定后，用试剂盒抽提质粒备用。

、细胞转染

首先，将培养于含有 10% FCS 、 100kU/L 青霉素、 100mg/L 链霉素的 RPMI1640 完全培养基中细胞株，按 1 × 10⁴ 个细胞 / 孔的量在 24 孔板中接种指数生长期的细胞，培养过夜，直到细胞 80% 汇片。

然后，将一定量的 hsa-miR-20b 、 PTEN/3 ′ -UTR/pGL3 重组质粒和内参质粒 pRL-TK 稀释至 50 μ L 不含血清和抗生素的 Opti-MEM®I 培养基中，用移液枪混合均匀；然后将 1 μ L 脂质体 2000 悬液加入 50 μ L 不含血清和抗生素的 Opti-MEM®I 培养基中，在室温孵育 5min ；最后将两者混合在一起，充分混匀，静置 20min ，使 hsa-miR-20b 、重组质粒和内参质粒与脂质体充分结合。将只加脂质体的孔作为阴性对照。

最后，吸去接种到 24 孔板中的培养液，用不含血清和抗生素的 Opti-MEM®I 培养基洗一次，在每个孔中加入 100 μ L 上述混合物，培养 3h ；吸弃培养板中的转染培养液，向各孔加入 100 μ L 有血清无抗生素的 Opti-MEM®I 培养基，继续培养 24h 后进行检测。

、双荧光素酶报告系统基因活性测定

将转染有 pGL-3 和 pRL-TK 的 CHO 细胞经过 24h 培养后收集，吸弃培养基，用 PBS 洗 1 次。加入裂解液 20 μ L/ 孔，室温摇动 15 min 。按照双荧光素酶检测试剂盒的操作说明书，取 100 μ L 荧光素酶分析缓冲液 II 于 1.5ml 离心管中，设定化学发光仪延迟 2sec ，发光仪测读 10sec ；将全部细胞裂解液加入到离心管中，用移液枪轻轻抽吸 2-3 次混匀（不要旋涡振动）；将离心管放入化学发光仪中测读萤火虫荧光素酶发光值 F1 ；将离心管移出发光仪，加入 100 μ L Stop&Glo 试剂，快速旋涡混匀后，将离心管重放回发光仪中测读海肾荧光素酶发光值 F2 。应用 SPSS.10 统计软件的卡方检验分析受试组与空白对照组的 F1/F2 比值差异，以判断 hsa-miR-20b 的调控作用。

三、结果

1. hsa-miR-20b 在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织

采用实时荧光定量 PCR 技术测定了 6 例结直肠癌组织和正常组织中 miRNA 的表达；统计分析发现， hsa-miR-20b 在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织，结果如图 1 所示。

与 PTEN 基因 3 ’ -UTR 结合

我们采用生物信息学软件 miRanda 和 TargetScan 联合预测发现， hsa-miR-20b 可能与 PTEN 基因 3 ’ -UTR 结合，结果如图 2 所示。

构建 PTEN/3'-UTR/pGL3 荧光素酶表达载体

PCR 扩增得到长度为 752bp 的 PTEN 基因 3 ’ -UTR 序列（图 3 ），切胶纯化回收后，将片段插入 pGEM-T 载体，转化感受态大肠杆菌。随机挑克隆扩增后提取质粒 DNA 。经过 Xba I 酶切鉴定，证实酶切后得到的基因片段与预期大小 740bp 相符（图 4 ）。测序结果表明，插入 pGEM-T 载体的 PTEN 基因 3'-UTR 片段序列正确，如图 5 所示。抽提 pGEM-T 载体，酶切获得 PTEN 基因 3'-UTR 片段；将其插入 pGL3 载体，然后转化感受态大肠杆菌。酶切后得到的基因片段与预期大小 740bp 相符（图 6 ）；测序结果证实插入序列正确（图 7 ）。

、 hsa-miR-20b 抑制重组荧光素酶表达活性

将 200ng 重组 PTEN/3'-UTR/pGL3 荧光素酶表达载体、 20ng 内参质粒 pRL-TK 与 10pmol hsa-miR-20b 共同转染 CHO 细胞后，采用荧光素酶活性检测试剂盒检测转染培养后 CHO 细胞中荧光素酶的活性。结果显示，在 CHO 细胞中加入 hsa-miR-20b 后，荧光素酶的活性比值（ pGL-3/pRL-TK ）显著低于不加 hsa-miR-20b 的细胞（图 8 ）。由此表明， hsa-miR-20b 通过与 PTEN 基因 3'-UTR 上靶点序列结合，抑制了荧光素酶的表达。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种微小RNA用于调控PTEN基因表达，其特征在于，所述的微小RNA为包含以下序列的核酸或者功能片段或变体: 5’-caaagugcucauagugcagguag- 3’。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能与PTEN基因3’-UTR结合，抑制PTEN基因表达。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA为miR-20b。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通过化学合成得到。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA来自生物体样本，包括组织、细胞和外周血。