CN102776120B - 中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种平板膜给氧自循环式微生物培养装置及方法，属于微生物培养领域和膜技术领域。包括：供气泵、进气阀、空气流量计、加热器、液封瓶、储气槽、进气口、疏水性中空纤维微孔膜丝、膜支撑孔板、自循环导流筒、加料及取样口、接种口、出气口、上盖、外器壁等；空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝的端口进入疏水性中空纤维微孔膜丝内部，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；根据膜支撑孔板上通气小孔与自循环导流筒的相对位置，可使液体培养基在培养器内随着气泡的上升过程相对于自循环导流筒既能形成外循环，又能形成外循环方式；培养液在培养器内循环，有利于微生物与空气充分接触；本发明克服了传统膜生物反应器需要另外安装空气过滤器及扰动或搅拌装置的不足。

Description

中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置及方法
技术领域
本发明涉及微生物好氧培养设备，特别涉及一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置及方法，属于环保技术领域技术领域。
背景技术
目前，微生物好氧培养通常将微生物接种到装有微生物生长培养基的三角瓶中，然后用多层纱布将三角瓶瓶口包裹并置于恒温振荡器中进行培养，微生物好氧培养往往需氧进行呼吸代谢，而恒温振荡器具有通气设备，三角瓶震荡过程中使流通的空气透过纱布浸入三角瓶并溶解于培养基中，使微生物进行呼吸代谢。
微生物的呼吸强度与微生物的种类以及细胞的生长期有关。不同微生物细胞生长过程中呼吸强度不同，同一种微生物在不同的生长阶段，其呼吸强度亦有差别。在微生物生长的各个阶段，菌体密度和呼吸强度各不相同，致使好氧速率有较大差别，在微生物耗氧速率发生改变时，相应地对通氧量进行调节。通常情况下，氧气溶解到液体培养基中是通过气-液两相的界面进行的。增大气-液两相接触面积，将有利于提高氧气溶解到液体培养基中的溶氧速率。当前围绕微生物培养器的研究取得了一定的进展，但现有的一些反应器仍然存在一些问题：通过恒温振荡器震荡或者摇床转动使氧气溶解在培养基中的溶解度很小，而且震荡方式易使培养基形成漩涡，不利于微生物与氧气的充分接触，同时由于该恒温振荡器具备的通气设备，无法控制通过的空气流量，而且不具备过滤空气中细菌的过滤装置，这就导致微生物培养的生物量较低，因此，现有报道的微生物培养器的诸多缺点在一定程度上限制了微生物培养器的商业化应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有微生物好氧培养过程中氧气接触不充分，通氧过程须另设空气过滤装置及扰动或搅拌装置等问题，提供了一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置及方法。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的：
本发明的一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置，包括：供气泵、进气阀、空气流量计、培养器、加热器、液封瓶；连接关系为供气泵、进气阀、空气流量计通过管路顺次连接后，再与培养器的进气口连接，培养器置于加热器中，培养器的出气口用通气管置于液封瓶的液面以下进行液封，防止微生物染杂菌。
其中，培养器包括：储气槽、进气口、疏水性中空纤维微孔膜丝、膜支撑孔板、自循环导流筒、加料及取样口、接种口、出气口、上盖、外器壁、第一垫圈、第二垫圈、螺栓、固定柱，支架、支撑柱；
其连接关系为：储气槽为中空的圆柱体，储气槽内壁下半部分的直径小于上半部分的直径，储气槽内壁成阶梯型，在储气槽下半部分设有与管路相连接的进气口；第一垫圈的外径与储气槽上半部分阶梯内壁的直径相同；外器壁的外径与储气槽上半部分阶梯内壁的直径相同，外器壁的内径与膜支撑孔板的直径相同；膜支撑孔板上开有小孔，用于固定疏水性中空纤维微孔膜丝的两端，空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝的端口进入中空后，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝壁面自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；膜支撑孔板上还设有用于支撑自循环导流筒的支架；固定柱的下端与储气槽外壁固连，上端设有螺纹；上盖上开有加料及取样口、接种口、出气口，加料及取样口、接种口、出气口均可通过第二垫圈的中空部分直接与空气接触；上盖上还开有用于固定柱穿过的螺栓孔；上盖上设有用于固定外器壁的突台，突台的内径与外器壁的外径相同；第一垫圈放置于储气槽的阶梯面上，第一垫圈上方放有膜支撑孔板；储气槽、第一垫圈、膜支撑孔板通过螺栓固连；外器壁的径向下端部分通过储气槽内壁和膜支撑孔板固定，外器壁的径向上端部分通过上盖固定，外器壁的轴向通过第一垫圈和第二垫圈固定；储气槽的外壁与固定柱的下端部分固连，固定柱的上端部分通过螺栓与上盖固连；自循环导流筒固定于膜支撑孔板的支架上。
所述的膜支撑孔板上还可以设有用于缠绕疏水性中空纤维微孔膜丝的支撑柱；疏水性中空纤维微孔膜丝缠绕支撑柱后，两端分别固定在膜支撑孔板上开的小孔的孔壁上；空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝的两端进入中空后，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝壁面自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；
所述的支撑柱位于自循环导流筒的外部，用于缠绕疏水性中空纤维微孔膜丝；
所述的膜支撑孔板表面固联有至少两个支架，用来支撑自循环导流筒。
所述的自循环导流筒为上下均无底盖的圆柱形，材料优选为：玻璃，不锈钢或者聚四氟乙烯。
所述的储气槽、第一垫圈、膜支撑孔板通过螺栓固连，至少用2个螺栓固连。
本发明所采用的疏水性中空纤维膜丝的膜材料主要为疏水性微孔高分子有机膜，例如：聚偏氟乙烯(PVDF)，聚四氟乙烯(PTFE)，聚丙烯(PP)，聚乙烯(PE)，聚氯乙烯(PVC)的微滤膜或超滤膜。
所述的自循环导流筒的整体浸没于液体内，距离上液面高度为液高的1/20-1/4，下缘与膜支撑孔板间的间距为液高的1/20-1/4。
其工作过程为：空气经过供气泵和空气流量计到达培养器，通过进气口进入储气槽，空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝的端口进入疏水性中空纤维微孔膜丝内部，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；根据膜支撑孔板上的通气小孔与支撑自循环导流筒的支架的位置关系，培养液随着气泡的上升向上运动，到达自循环导流筒的上缘沿筒壁向下流动，在培养器内部相对于自循环导流筒形成外循环或者内循环形式，培养液的循环运动，使微生物在培养基中呈悬浮态，有利于微生物与空气充分接触；多余的空气通过与出气口相通的管路流到液封瓶中。
本发明的一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养方法：具体步骤如下：
步骤一、将盛有液体培养基的培养器置于加热器的恒温水浴内，将出口管液封，开启进气泵；
步骤二、空气进入储气槽后经过疏水性中空纤维微孔膜丝的过滤作用，过滤掉空气中的细菌及杂质，并使空气经疏水性中空纤维微孔膜丝的微孔分散成微小气泡进入液体培养基，增加气-液接触面积，从而提高溶氧速率；同时培养器内部设有自循环导流筒，当膜支撑孔板上的通气小孔位于支架内侧时，自循环导流筒内侧的培养液随气泡上升而向上运动，在自循环导流筒的导流作用下，使液体培养基到达自循环导流筒上缘后向下运动，在培养器内形成外循环；当膜支撑孔板上的通气小孔位于支架外侧时，自循环导流筒外侧的培养液随气泡上升而向上运动，在自循环导流筒的导流作用下，使液体培养基到达自循环导流筒上缘后向下运动，在培养器内形成内循环；培养液的循环确保微生物呈悬浮态，与氧气充分接触，利用培养液中的溶解氧进行呼吸代谢。
有益成果
1、本发明采用培养器采用中空纤维微滤或超滤膜给氧气升式供气，将空气分散为微小气泡，有效降低了传统震荡搅拌或者搅拌器搅拌过程中剪切力对微生物的剪切力，增大了气-液接触面积，提高培养基中的溶氧率。
2、本发明所用的培养器设置有自循环导流筒，以自循环导流筒为基准，可形成内循环和外循环两种方式，提高氧气利用率，微生物培养过程的生物量，无须另外安装空气过滤器及扰动或搅拌装置，降低过程中能耗。
3、本发明采用的培养器组合方便，操作简单，可适用于高压蒸汽灭菌，易于反应器的放大。
4、本发明所用的膜为疏水性微孔高分子有机膜，由于高分子有机膜的结构稳定，抗污染及微生物腐蚀能力强，再生简易且可以高温蒸汽灭菌等优点，适用于微生物培养过程中的一些复杂环境，本培养器中起曝气作用的微孔膜，本身孔径较小，在空气通过的同时，有效截留空气中的细菌及霉菌等有害微生物，而且膜在与液体培养基中微生物接触过程中，不易使微生物在膜表面沉积，不易堵塞及污染膜孔，从而可提高微生物培养过程中的生物量。
附图说明
图1是本发明一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置及方法的结构图；
图2是本发明所述的培养器的结构剖视图，即图1中A-A面剖视图；
图3是实施例1中所述的培养器中膜支撑孔板及自循环导流筒的侧视图；
图4是实施例1中所述的培养器中膜支撑孔板及自循环导流筒的俯视图；
图5是实施例2中所述的培养器中膜支撑孔板及自循环导流筒的俯视图；
图6是实施例3中所述的培养器中膜支撑孔板及自循环导流筒的俯视图；
图7是实施例4中所述的培养器中膜支撑孔板及自循环导流筒的俯视图；
其中，1-供气泵、2-进气阀、3-空气流量计、4-培养器、5-加热器、6-液封瓶、401-储气槽、402-进气口、403-疏水性微孔平板膜、404-膜支撑孔板、405-自循环导流筒、406-加料及取样口，407-接种口、408-出气口、409-上盖、4010-外器壁、4011-第一垫圈、4012-第二垫圈、4013-螺栓、4014-固定柱、4015-支架、4016-支撑柱。
具体实施方式
下面结合附图说明具体实施方式。
实施例1
一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置如图1所示，包括：供气泵1、进气阀2、空气流量计3、培养器4、加热器5、液封瓶6；连接关系为供气泵1、进气阀2、空气流量计3通过管路顺次连接后，再与培养器4的进气口402连接，培养器4置于加热器5中，培养器4的出气口408用通气管置于液封瓶6的液面以下进行液封，防止微生物染杂菌。
其中，如图2所示：培养器4包括：储气槽401、进气口402、疏水性中空纤维微孔膜丝403、膜支撑孔板404、自循环导流筒405、加料及取样口406、接种口407、出气口408、上盖409、外器壁4010、第一垫圈4011、第二垫圈4012、螺栓4013、固定柱4014、支架4015、支撑柱4016；
其连接关系如图2所示：储气槽401为中空的圆柱体，储气槽401内壁下半部分的直径小于上半部分的直径，储气槽401内壁成阶梯型，在储气槽401下半部分设有与管路相连接的进气口；第一垫圈4011的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm；外器壁的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm，外器壁4010的内径与膜支撑孔板404的直径同为75mm；如图3及图4所示：膜支撑孔板404上开有2个孔径为1mm的小孔，并设有用于缠绕疏水性中空纤维微孔膜丝403的6个支撑柱4016，每根支撑柱4016的外侧开有7个凹槽，防止缠绕的疏水性中空纤维微孔膜丝403滑脱，疏水性中空纤维微孔膜丝403缠绕支撑柱后，两端分别固定在膜支撑孔板404上开的小孔的孔壁上，所用的中空纤维膜丝403的膜材料为聚丙烯PP，平均孔径为0.02μm，厚度为50μm，长度为15cm，空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝403的端口进入后，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝403自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；如图3及图4所示：膜支撑孔板404上还设有用于支撑自循环导流筒405的支架4015，支架高度为0.5cm，自循环导流筒405为玻璃材质，内径为2.8cm，高度为3cm，上缘浸没于培养液中，距离液面高度为液高的1/4，且支撑柱4016位于自循环导流筒405的外侧；膜支撑孔板的中心位置开6个直径为1mm的小孔，用3跟长度为4cm的疏水性中空纤维微孔膜丝403两端分别固定在相邻的小孔内壁上，防止自循环导流筒405中心处出现死区；固定柱4014的下端与储气槽401外壁固连，上端设有螺纹；上盖409上开有加料及取样口406、接种口407、出气口408，加料及取样口406、接种口407、出气口408均可通过第二垫圈4012的中空部分直接与空气接触；上盖409上还开有用于固定柱4014穿过的螺栓孔；上盖409上设有用于固定外器壁4010的突台，突台的内径与外器壁4010的外径相同；第一垫圈4011放置于储气槽401的阶梯面上，第一垫圈4011上方放有膜支撑孔板404；储气槽401、第一垫圈4011、膜支撑孔板404通过螺栓固连；外器壁4010的径向下端部分通过储气槽401内壁和膜支撑孔板404固定，外器壁4010的径向上端部分通过上盖409固定，外器壁4010的轴向通过第一垫圈4011和第二垫圈4012固定；储气槽401的外壁与固定柱4014的下端部分固连，固定柱4014的上端部分通过螺栓与上盖409固连；自循环导流筒405固定于膜支撑孔板404的支架4015上。
本发明的一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养方法：具体步骤如下：
步骤一、配制200ml用于鹰嘴豆孢克鲁维酵母产酶的YEPD培养基(具体组成：1％的酵母提取物yeast extract，2％蛋白胨peptone，2％葡萄糖glucose)于500ml三角瓶中，包上纱布，将组装好的培养器4和装有YEPD培养基的三角瓶分别放入高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min；
步骤二、在无菌操作台内，首先将YEPD培养基通过加料及取样口406、加到培养器4中，接着，用接种环取一环鹰嘴豆孢克鲁维酵母从接种口407加入到培养器4中，进样垫封闭以上两口，将盛有液体培养基的培养器置于加热器3的恒温水浴内，用通气管依次将进气泵1，进气阀2，空气流量计3及培养器5的进气口402连接，向液封瓶6中加入100ml去离子水，将连接出气口408的通气管置于液封瓶6液面以下进行液封；
步骤三、开启进气泵1，调节进气阀2及空气流量计3使空气流量保持至80ml/min；调节加热器5使加热器的恒温水浴锅内温度为30℃，开始鹰嘴豆孢克鲁维酵母的好氧发酵产酶过程；
步骤四、在鹰嘴豆孢克鲁维酵母发酵产酶过程中，所通空气中氧气经过疏水性中空纤维微孔膜丝403的过滤作用，过滤掉空气中的细菌及杂质，使空气经疏水性中空纤维微孔膜丝403壁面的微孔分散成微小气泡进入液体培养基，通过增加气-液接触面积来提高培养基中的溶氧速率，同时培养器内部设有自循环导流筒405，如图5所示：液体随气泡上升在自循环导流筒405的外侧向上运动，在自循环导流筒405的导流作用下，当YEPD液体培养基到达自循环导流筒405上缘后向下运动，在培养器内形成内循环，增大氧气与微生物接触机会，鹰嘴豆孢克鲁维酵母利用其中的溶解氧进行呼吸代谢。
步骤五、从取样口(406)进行取样，将样品置于低温离心机中4℃、8000rpm下离心5min，取上清液作为粗酶液，稀释100倍后，用DNS法测定酶活力为320U/ml。下层沉淀置于60℃烘箱中烘至恒重，测得生物量为14.2g/L；传统的产酶方法为：配制200ml YEPD培养基于500ml三角瓶中，包上纱布，在摇床中30℃、170rpm下培养120h，取样，测酶活为186U/ml，酵母的生物量为8.6g/L，采用平板膜给氧自循环式微生物培养装置及方法使Kl-Inu酵母所产酶活力提高了72％，同时酵母的生物量提高了65.1％。
实施例2
一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置如图1所示，包括：供气泵1、进气阀2、空气流量计3、培养器4、加热器5、液封瓶6；连接关系为供气泵1、进气阀2、空气流量计3通过管路顺次连接后，再与培养器4的进气口402连接，培养器4置于加热器5中，培养器4的出气口408用通气管置于液封瓶6的液面以下进行液封，防止微生物染杂菌。
其中，如图2所示：培养器4包括：储气槽401、进气口402、疏水性中空纤维微孔膜丝403、膜支撑孔板404、自循环导流筒405、加料及取样口406、接种口407、出气口408、上盖409、外器壁4010、第一垫圈4011、第二垫圈4012、螺栓4013、固定柱4014、支架4015；
其连接关系如图2所示：储气槽401为中空的圆柱体，储气槽401内壁下半部分的直径小于上半部分的直径，储气槽401内壁成阶梯型，在储气槽401下半部分设有与管路相连接的进气口；第一垫圈4011的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm；外器壁的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm，外器壁4010的内径与膜支撑孔板404的直径同为75mm；如图5所示：膜支撑孔板404上开有两圈内外交错直径为1mm的小孔，外圈24个小孔，内圈有12个小孔，用于固定疏水性中空纤维微孔膜丝403的两端，每根疏水性中空纤维微孔膜丝403长度为4cm，两端分别固定在相邻的内外圈小孔内壁上，所用的中空纤维膜丝403的膜材料为聚丙烯PP，这样，外圈的每个小孔中固定有一根膜丝，内圈的小孔中固定有两根膜丝；同时，膜支撑孔板的中心位置开6个直径为1mm的小孔，用3跟长度为4cm的疏水性中空纤维微孔膜丝403两端分别固定在相邻的小孔内壁上，防止自循环导流筒405中心处出现死区；空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝403的端口进入后，再通过微孔中空纤维膜丝403自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；如图5所示：膜支撑孔板404上还设有用于支撑自循环导流筒405的支架4015；支架高度为0.5cm，自循环导流筒405为玻璃材质，内径为2.8cm，高度为3cm，上缘浸没于培养液中，距离液面高度为液高的1/4，且小孔位于自循环导流筒的外侧；膜支撑孔板的中心位置开6个直径为1mm的小孔，用3跟长度为4cm的疏水性中空纤维微孔膜丝403两端分别固定在相邻的小孔内壁上，防止自循环导流筒405中心处出现死区；固定柱4014的下端与储气槽401外壁固连，上端设有螺纹；上盖409上开有加料及取样口406、接种口407、出气口408，加料及取样口406、接种口407、出气口408均可通过第二垫圈4012的中空部分直接与空气接触；上盖409上还开有用于固定柱4014穿过的螺栓孔；上盖409上设有用于固定外器壁4010的突台，突台的内径与外器壁4010的外径相同；第一垫圈4011放置于储气槽401的阶梯面上，第一垫圈4011上方放有膜支撑孔板404；储气槽401、第一垫圈4011、膜支撑孔板404通过螺栓固连；外器壁4010的径向下端部分通过储气槽401内壁和膜支撑孔板404固定，外器壁4010的径向上端部分通过上盖409固定，外器壁4010的轴向通过第一垫圈4011和第二垫圈4012固定；储气槽401的外壁与固定柱4014的下端部分固连，固定柱4014的上端部分通过螺栓与上盖409固连；自循环导流筒405固定于膜支撑孔板404的支架4015上。
本发明的一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养方法：具体步骤如下：
步骤一、配制200ml用于毕赤酵母生长的LB培养基于500ml三角瓶中：0.5％的酵母提取物yeast extract，1％的蛋白胨trypton，1％的氯化钠NaCl，包上纱布，将组装好的培养器4和装有LB培养基的三角瓶分别放入高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min；
步骤二、在无菌操作台内，将LB培养基及毕赤酵母分别通过加料及取样口406、接种口407加到培养器4中后，用进样垫封闭以上两口，将盛有液体培养基的培养器置于加热器3的恒温水浴内，用通气管依次将进气泵1，进气阀2，空气流量计3及培养器5的进气口402连接，向液封瓶6中加入100ml去离子水，将连接出气口408的通气管置于液封瓶6液面以下进行液封；
步骤三、开启进气泵1，调节进气阀2及空气流量计3使空气流量保持至80ml/min；调节加热器5使加热器的恒温水浴锅内温度为30℃，开始毕赤酵母的培养；
步骤四、在毕赤酵母培养过程中，所通空气中氧气经过疏水性中空纤维微孔膜丝403的过滤作用，过滤掉空气中的细菌及杂质，并使空气经疏水性中空纤维微孔膜丝403壁面的微孔分散成微小气泡进入液体培养基，通过增加气-液接触面积来提高培养基中的溶氧速率，同时培养器内部设有自循环导流筒405，如图3及图4所示：液体随气泡上升在自循环导流筒405的外侧向上运动，在自循环玻璃圆筒的导流作用下，当LB液体培养基到达自循环导流筒405上缘后向下运动，在培养器内形成内循环，增大氧气与微生物接触机会，赤毕酵母利用其中的溶解氧进行呼吸代谢。
步骤五、培养24h后，从取样口406进行取样，将样品置于低温离心机中4℃、8000rpm下离心5min，弃去上层清夜，将沉淀置于60℃烘箱中烘至恒重，称重测得生物量为18g/L。
传统的毕赤酵母培养方法为：配制200ml LB培养基于500ml三角瓶中，包上纱布，在摇床中30℃、170rpm下培养24h，取样，测得生物量为12g/L，采用平板膜给氧自循环式微生物培养装置及方法使赤毕酵母生物量提高了50％。
实施例3
一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置如图1所示包括：供气泵1、进气阀2、空气流量计3、培养器4、加热器5、液封瓶6；连接关系为供气泵1、进气阀2、空气流量计3通过管路顺次连接后，再与培养器4的进气口402连接，培养器4置于加热器5中，培养器4的出气口408用通气管置于液封瓶6的液面以下进行液封，防止微生物染杂菌。
其中，如图2所示的培养器4包括：储气槽401、进气口402、疏水性中空纤维微孔膜丝403、膜支撑孔板404、自循环导流筒405、加料及取样口406、接种口407、出气口408、上盖409、外器壁4010、第一垫圈4011、第二垫圈4012、螺栓4013、固定柱4014、支架4015、支撑柱4016；
其连接关系如图2所示：储气槽401为中空的圆柱体，储气槽401内壁下半部分的直径小于上半部分的直径，储气槽401内壁成阶梯型，在储气槽401下半部分设有与管路相连接的进气口；第一垫圈4011的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm；外器壁的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm，外器壁4010的内径与膜支撑孔板404的直径同为75mm；如图6所示：膜支撑孔板404上开有2个孔径为1mm的小孔，并设有用于缠绕疏水性中空纤维微孔膜丝403的6个支撑柱4016，每根支撑柱4016的外侧开有7个凹槽，防止缠绕的疏水性中空纤维微孔膜丝403滑脱，疏水性中空纤维微孔膜丝403缠绕支撑柱后，两端分别固定在膜支撑孔板404上开的小孔的孔壁上，所用的中空纤维膜丝403的膜材料为聚乙烯PE，平均孔径为0.015μm，厚度为75μm，长度为12cm，空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝403的端口进入后，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝403自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；如图6所示：膜支撑孔板404上还设有用于支撑自循环导流筒405的支架4015，支架高度为0.5cm，自循环导流筒405为玻璃材质，内径为5cm，高度为3cm，上缘浸没于培养液中，距离液面高度为液高的1/4，且支撑柱4016位于自循环导流筒的内侧；固定柱4014的下端与储气槽401外壁固连，上端设有螺纹；上盖409上开有加料及取样口406、接种口407、出气口408，加料及取样口406、接种口407、出气口408均可通过第二垫圈4012的中空部分直接与空气接触；上盖409上还开有用于固定柱4014穿过的螺栓孔；上盖409上设有用于固定外器壁4010的突台，突台的内径与外器壁4010的外径相同；第一垫圈4011放置于储气槽401的阶梯面上，第一垫圈4011上方放有膜支撑孔板404；储气槽401、第一垫圈4011、膜支撑孔板404通过螺栓固连；外器壁4010的径向下端部分通过储气槽401内壁和膜支撑孔板404固定，外器壁4010的径向上端部分通过上盖409固定，外器壁4010的轴向通过第一垫圈4011和第二垫圈4012固定；储气槽401的外壁与固定柱4014的下端部分固连，固定柱4014的上端部分通过螺栓与上盖409固连；自循环导流筒405固定于膜支撑孔板404的支架4015上。
本发明的一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养方法：具体步骤如下：
步骤一、配制200ml用于大肠杆菌培养的LB培养基(组成为：0.5％的酵母提取物yeast extract，1％的胰蛋白胨tryptone，1％的氯化钠NaCl)于500ml三角瓶中，包上纱布，将组装好的培养器4和装有LB培养基的三角瓶分别放入高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min；
步骤二、在无菌操作台内，将LB培养基及大肠杆菌分别通过加料及取样口406、接种口407加到培养器4中后，用进样垫封闭以上两口，将盛有液体培养基的培养器置于加热器3的恒温水浴内，用通气管依次将进气泵1，进气阀2，空气流量计3及培养器5的进气口402连接，向液封瓶6中加入100ml去离子水，将连接出气口408的通气管置于液封瓶6液面以下进行液封；
步骤三、开启进气泵1，调节进气阀2及空气流量计3使空气流量保持至80ml/min；调节加热器5使加热器的恒温水浴锅内温度为37℃，开始大肠杆菌的培养；
步骤四、在大肠杆菌培养过程中，所通空气中氧气经过疏水性中空纤维微孔膜丝403的过滤作用，过滤掉空气中的细菌及杂质，并使空气经疏水性中空纤维微孔膜丝403壁面的分散成微小气泡进入液体培养基，通过增加气-液接触面积来提高培养基中的溶氧速率，同时培养器内部设有自循环导流筒405，如图6所示：液体随气泡上升在自循环导流筒405的内侧向上运动，在自循环玻璃圆筒的导流作用下，当LB液体培养基到达自循环导流筒405上缘后向下运动，在培养器内形成外循环，增大氧气与微生物接触机会，大肠杆菌利用其中的溶解氧进行呼吸代谢。
步骤五、从取样口406进行取样，测得菌体密度为6.8×109CFU/mL。
传统的大肠杆菌培养方法为：配制200ml LB培养基于250ml三角瓶中，包上纱布，在摇床中37℃、170rpm下培养24h，取样，测得菌体密度为4.5×109CFU/mL，采用平板膜给氧自循环式微生物培养装置及方法使菌体密度提高了51％。
实施例4
一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置如图1所示，包括：供气泵1、进气阀2、空气流量计3、培养器4、加热器5、液封瓶6；连接关系为供气泵1、进气阀2、空气流量计3通过管路顺次连接后，再与培养器4的进气口402连接，培养器4置于加热器5中，培养器4的出气口408用通气管置于液封瓶6的液面以下进行液封，防止微生物染杂菌。
其中，如图2所示：培养器4包括：储气槽401、进气口402、疏水性中空纤维微孔膜丝403、膜支撑孔板404、自循环导流筒405、加料及取样口406、接种口407、出气口408、上盖409、外器壁4010、第一垫圈4011、第二垫圈4012、螺栓4013、固定柱4014、支架4015；
其连接关系如图2所示：储气槽401为中空的圆柱体，储气槽401内壁下半部分的直径小于上半部分的直径，储气槽401内壁成阶梯型，在储气槽401下半部分设有与管路相连接的进气口；第一垫圈4011的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm；外器壁的外径与储气槽401上半部分阶梯内壁的直径同为80mm，外器壁4010的内径与膜支撑孔板404的直径同为75mm；如图7所示：膜支撑孔板404上开有两圈内外交错直径为1mm的小孔，外圈36个小孔，内圈有18个小孔，用于固定疏水性中空纤维微孔膜丝403的两端，每根疏水性中空纤维微孔膜丝403长度为4cm，两端分别固定在相邻的内外圈小孔内壁上，所用的中空纤维膜丝403的膜材料为聚偏氟乙烯PVDF，这样，外圈的每个小孔中固定有一根膜丝，内圈的小孔中固定有两根膜丝；空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝403的端口进入后，再通过微孔中空纤维膜丝403自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；如图7所示：膜支撑孔板404上还设有用于支撑自循环导流筒405的支架4015；支架高度为0.5cm，自循环导流筒405为玻璃材质，内径为5cm，高度为3cm，上缘浸没于培养液中，距离液面高度为液高的1/4，且通气的小孔位于自循环导流筒的内侧；固定柱4014的下端与储气槽401外壁固连，上端设有螺纹；上盖409上开有加料及取样口406、接种口407、出气口408，加料及取样口406、接种口407、出气口408均可通过第二垫圈4012的中空部分直接与空气接触；上盖409上还开有用于固定柱4014穿过的螺栓孔；上盖409上设有用于固定外器壁4010的突台，突台的内径与外器壁4010的外径相同；第一垫圈4011放置于储气槽401的阶梯面上，第一垫圈4011上方放有膜支撑孔板404；储气槽401、第一垫圈4011、膜支撑孔板404通过螺栓固连；外器壁4010的径向下端部分通过储气槽401内壁和膜支撑孔板404固定，外器壁4010的径向上端部分通过上盖409固定，外器壁4010的轴向通过第一垫圈4011和第二垫圈4012固定；储气槽401的外壁与固定柱4014的下端部分固连，固定柱4014的上端部分通过螺栓与上盖409固连；自循环导流筒405固定于膜支撑孔板404的支架4015上。
本发明的一种中空纤维膜给氧自循环式微生物培养方法：具体步骤如下：
步骤一、配制200ml用于鹰嘴豆孢克鲁维酵母培养的SD培养基(组成为：0.67％的缺少氨基酸的酵母氮源yeast nitrogen base without amino acids，2％的葡萄糖glucose，2mg/ml的甲硫氨酸Met及10mg/ml的亮氨酸Leu)于500ml三角瓶中，包上纱布，将组装好的培养器4和装有SD培养基的三角瓶分别放入高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min；
步骤二、在无菌操作台内，将SD培养基及鹰嘴豆孢克鲁维酵母分别通过加料及取样口406、接种口407加到培养器4中后，用进样垫封闭以上两口，将盛有液体培养基的培养器置于加热器3的恒温水浴内，用通气管依次将进气泵1，进气阀2，空气流量计3及培养器5的进气口402连接，向液封瓶6中加入100ml去离子水，将连接出气口408的通气管置于液封瓶6液面以下进行液封；
步骤三、开启进气泵1，调节进气阀2及空气流量计3使空气流量保持至60ml/min；调节加热器5使加热器的恒温水浴锅内温度为30℃，开始鹰嘴豆孢克鲁维酵母的培养；
步骤四、在鹰嘴豆孢克鲁维酵母培养过程中，所通空气中氧气经过疏水性中空纤维微孔膜丝403的过滤作用，过滤掉空气中的细菌及杂质，并使空气经疏水性中空纤维微孔膜丝403壁面的分散成微小气泡进入液体培养基，通过增加气-液接触面积来提高培养基中的溶氧速率，同时培养器内部设有自循环导流筒405，如图6所示：液体随气泡上升在自循环导流筒405的内侧向上运动，在自循环玻璃圆筒的导流作用下，当SD液体培养基到达自循环导流筒405上缘后向下运动，在培养器内形成外循环，增大氧气与微生物接触机会，大肠杆菌利用其中的溶解氧进行呼吸代谢。
步骤五、培养36h后，从取样口406进行取样，测得菌体密度为2.9×108CFU/mL。
传统的鹰嘴豆孢克鲁维酵母培养方法为：配制200ml SD培养基于500ml三角瓶中，包上纱布，在摇床中30℃、170rpm下培养36h，取样，测得菌体密度为1.5×108CFU/mL，采用平板膜给氧自循环式微生物培养装置及方法使菌体密度提高了93％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换和替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内。

Claims (5)

1.中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置，其特征在于：包括：供气泵、进气阀、空气流量计、培养器、加热器、液封瓶；供气泵、进气阀、空气流量计通过管路顺次连接后，再与培养器的进气口连接，培养器置于加热器中，培养器的出气口用通气管置于液封瓶的液面以下进行液封，防止微生物染杂菌；其中，培养器包括：储气槽、进气口、疏水性中空纤维微孔膜丝、膜支撑孔板、自循环导流筒、加料及取样口、接种口、出气口、上盖、外器壁、第一垫圈、第二垫圈、螺栓、固定柱、支架、支撑柱；储气槽为中空的圆柱体，储气槽内壁下半部分的直径小于上半部分的直径，储气槽内壁成阶梯型，在储气槽下半部分设有与管路相连接的进气口；第一垫圈的外径与储气槽上半部分阶梯内壁的直径相同；外器壁的外径与储气槽上半部分阶梯内壁的直径相同，外器壁的内径与膜支撑孔板的直径相同；膜支撑孔板上开有小孔，空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝的端口进入中空后，再通过微孔中空纤维膜丝壁面自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中；膜支撑孔板上还设有用于支撑自循环导流筒的支架；固定柱的下端与储气槽外壁固连，上端设有螺纹；上盖上开有加料及取样口、接种口、出气口，加料及取样口、接种口、出气口均可通过第二垫圈的中空部分直接与空气接触；上盖上还开有用于固定柱穿过的螺栓孔；上盖上设有用于固定外器壁的突台，突台的内径与外器壁的外径相同；第一垫圈放置于储气槽的阶梯面上，第一垫圈上方放有膜支撑孔板；外器壁的径向下端部分通过储气槽内壁和膜支撑孔板固定，外器壁的径向上端部分通过上盖固定，外器壁的轴向通过第一垫圈和第二垫圈固定；储气槽的外壁与固定柱的下端部分固连，固定柱的上端部分通过螺栓与上盖固连；所述的储气槽、第一垫圈、膜支撑孔板通过螺栓固连，至少用2个螺栓固连；膜支撑孔板上固连有至少2个支架，自循环导流筒固定于膜支撑孔板的支架上；所述的疏水性中空纤维微孔膜丝既可置于自循环导流筒的外部，使液体形成内循环，也可置于自循环导流筒的内部，使液体形成外循环；所述的自循环导流筒为上下均无底盖的圆柱形，自循环导流筒的整体浸没于液体内，距离上液面高度为液高的1/20-1/4，下缘与膜支撑孔板间的间距为液高的1/20-1/4，自循环导流筒材质可以为玻璃，不锈钢或者聚四氟乙烯；所述的疏水性中空纤维微孔膜丝主要为疏水性微孔高分子有机膜。 
2.如权利要求1所述的中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置，其特征在于：所述的膜支撑孔板上还可以设置用于缠绕疏水性中空纤维微孔膜丝的支撑柱；疏水性中空纤维微孔膜丝缠绕支撑柱后，两端分别固定在膜支撑孔板上开的小孔的孔壁上；空气通过疏水性中空纤维微孔膜丝的两端进入中空后，再通过疏水性中空纤维微孔膜丝壁面自身的微孔分散成微小气泡进入到培养液中。 
3.如权利要求1所述的中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置，其特征在于：所述的疏水性中空纤维微孔膜丝为微滤膜或超滤膜。 
4.如权利要求1所述的中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置，其特征在于：所述的疏水性中空纤维微孔膜丝主要为聚偏氟乙烯，聚四氟乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯的微滤膜或超滤膜。 
5.采用权利要求1所述的中空纤维膜给氧自循环式微生物培养装置培养微生物的方法，其特征在于，具体步骤如下： 
步骤一、将盛有液体培养基的培养器置于加热器的恒温水浴内，将出口管液封，开启供气泵； 
步骤二、空气进入储气槽后经过疏水性中空纤维微孔膜丝的过滤作用，过滤掉空气中的细菌及杂质，并使空气经疏水性中空纤维微孔膜丝的微孔分散成微小气泡进入液体培养基，增加气-液接触面积，从而提高溶氧速率，同时培养器内部设有自循环导流筒，当膜支撑孔板上的通气小孔位于支架内侧时，自循环导流筒内侧的培养液随气泡上升而向上运动，在自循环导流筒的导流作用下，使液体培养基到达自循环导流筒上缘后向下运动，在培养器内形成外循环；当膜支撑孔板上的通气小孔位于支架外侧时，自循环导流筒外侧的培养液随气泡上升而向上运动，在自循环导流筒的导流作用下，使液体培养基到达自循环导流筒上缘后向下运动，在培养器内形成内循环；培养液的循环，确保微生物呈悬浮态，与氧气充分接触，利用培养液中的溶解氧进行呼吸代谢。 
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