CN102766597A - 利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法 - Google Patents
利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102766597A CN102766597A CN2012102681484A CN201210268148A CN102766597A CN 102766597 A CN102766597 A CN 102766597A CN 2012102681484 A CN2012102681484 A CN 2012102681484A CN 201210268148 A CN201210268148 A CN 201210268148A CN 102766597 A CN102766597 A CN 102766597A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- foxp3
- antibody
- cells
- treg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,具体为,收集外周血单核细胞,用PBS液重悬,然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体,在温度为10-28℃条件下孵育;然后用PBS洗涤,离心收集细胞,得洗涤细胞;将所得洗涤细胞中加入FOXP3固定破膜剂洗涤,再用FOXP3破膜剂重悬细胞,避光孵育,离心收集沉淀;然后用FOXP3破膜剂重悬细胞;再加入荧光标记的FOXP3抗体,室温避光反应,最后加入细胞染色液重悬细胞,上流式细胞仪进行分选,本发明公开的分选方法,其灵敏度高,分选的Treg细胞纯度高,其纯度大于99.0%。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分选方法,具体涉及利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法。
背景技术
调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是T细胞的一个亚群,能抑制对自身或外源抗原有害的的免疫反应。Treg细胞表达CD4,CD25和转录因子FOXP3(forkhead box P3,Scurfin)。其中 FOXP3主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织,在小鼠中特异性表达于CD4+CD25+T细胞,而不表达于CD8+T细胞。在人类FOXP3不仅可表达于CD4+CD25+T细胞,还可表达于CD8+CD28-T细胞,但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞。
目前,FOXP3是目前公认的调节性T细胞的最敏感的标志。但是FOXP3定为于细胞内,对Treg细胞进行FOXP3染色,必须要经过细胞固定和通透,对细胞会有一定损坏,所以在现有技术中进行Treg细胞的流式细胞术分选时,通常会选取CD4和CD25这作为标记物进行标记,而不会选取FOXP3为标记物。为了提高分选Treg细胞的灵敏度,急需一种流式细胞术分选Treg细胞的方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其灵敏度高,分选的Treg细胞亚群纯度高。
为实现上述发明目的,技术方案为:
利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,具体步骤为:
A.收集外周血单核细胞,用PBS液重悬,然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体,在温度为10-28℃条件下孵育;然后用PBS洗涤,离心收集细胞,得洗涤细胞;
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入FOXP3固定破膜剂洗涤,然后用FOXP3固定破膜剂重悬细胞,避光孵育,离心收集沉淀;然后用FOXP3固定破膜剂重悬细胞;然后加入荧光标记的FOXP3抗体,室温避光反应,得FOXP3抗体标记的细胞;
C.将步骤B所得FOXP3抗体标记的细胞加入细胞染色液重悬细胞,上流式细胞仪进行分选。
优选的,所述步骤a是将收集的外周血单核细胞在4℃预冷的PBS液重悬至浓度为1×105~1×107个/100μL,加入CD4抗体和CD25抗体至终浓度分别为0.125-0.25μg/106细胞,在温度为10-28℃条件下孵育20-40分钟,然后用PBS洗涤细胞三次,洗涤后在转速大于1000转/分钟条件下,离心至少5分钟。
优选的,所述步骤a中,加入CD4抗体和CD25抗体至终浓度分别为0.2μg/106细胞,在温度为18℃条件下孵育30分钟,洗涤后在转速为1100转/分钟条件下,离心8分钟。
优选的,所述步骤B中,所述避光孵育时间为30-50分钟,加入所述荧光标记的FOXP3抗体至抗体终浓度为0. 125-0.25μg/106细胞。
优选的,所述步骤B中,所述避光孵育时间为40分钟,加入所述荧光标记的FOXP3抗体至抗体终浓度为0.2μg/106细胞。
本发明的有益效果在于:本发明公开的利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其方法简单,不需要特殊试剂;突破了传统的Treg细胞分选方法,同时用CD4、CD25和FOXP3这三个标记物标记Treg细胞,灵敏度高,分选的Treg细胞纯度高,其纯度大于99.0%。
附图说明
图1为利用FOXP3为标记物分选细胞的结果图。
具体实施方式
以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。其中FOXP3固定破膜剂、荧光标记的FOXP3和细胞染色液均购自eBioscience公司。
实施例1
利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,具体步骤为:
A.收集外周血单核细胞约1×106个,用100μL在4℃预冷的PBS液重悬,然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体,至CD4抗体和CD25抗体的终浓度分别为0.2μg/106细胞,在温度为18℃条件下孵育30分钟;然后用PBS洗涤细胞三次,每次洗涤后在转速为1100转/分钟条件下离心8分钟,弃上清,得洗涤细胞;
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入1mL 1×FOXP3固定破膜剂洗涤,然后加入1mL 1×FOXP3固定破膜剂重悬细胞,室温避光孵育40分钟,离心后弃上清;用100μL 1×FOXP3破膜剂重悬细胞;然后加入荧光标记的FOXP3抗体,至抗体终浓度为0.2μg/106细胞,室温避光反应30分钟,得FOXP3抗体标记的细胞;
C.将步骤B所得FOXP3抗体标记的细胞加入0.35mL 1×细胞染色液重悬细胞,上流式细胞仪进行分选。
本实施例为本发明的最佳实施例。
实施例2
利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,具体步骤为:
A.收集外周血单核细胞约1×105个,用100μL在4℃预冷的PBS液重悬,然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体,至CD4抗体和CD25抗体的终浓度分别为0.125μg/106细胞,在温度为28℃条件下孵育20分钟;然后用PBS洗涤细胞三次,每次洗涤后在转速为1500转/分钟条件下离心5分钟,弃上清,得洗涤细胞;
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入0.5mL 1×FOXP3固定破膜剂洗涤,然后加入0.5mL 1×FOXP3固定破膜剂重悬细胞,室温避光孵育30分钟,离心后弃上清;用100μL 1×FOXP3破膜剂重悬细胞;然后加入适量荧光标记的FOXP3抗体,至抗体终浓度为0.125μg/106细胞,室温避光反应30分钟,得FOXP3抗体标记的细胞;
C.将步骤B所得FOXP3抗体标记的细胞加入0.2mL 1×细胞染色液重悬细胞,上流式细胞仪进行分选。
实施例3
利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,具体步骤为:
A.收集外周血单核细胞约1×107个,用100μL在4℃预冷的PBS液重悬,然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体,至CD4抗体和CD25抗体的终浓度分别为0.25μg/106细胞,在温度为10℃条件下孵育40分钟;然后用PBS洗涤细胞三次,每次洗涤后在转速为1000转/分钟条件下离心10分钟,弃上清,得洗涤细胞;
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入0.75mL 1×FOXP3固定破膜剂洗涤,然后加入0.75mL 1×FOXP3固定破膜剂重悬细胞,室温避光孵育50分钟,离心后弃上清;用100μL 1×FOXP3破膜剂重悬细胞;然后加入适量荧光标记的FOXP3抗体,至抗体终浓度为0.25μg/106细胞,室温避光反应30分钟,得FOXP3抗体标记的细胞;
C.将步骤B所得FOXP3抗体标记的细胞加入0.5mL 1×细胞染色液重悬细胞,上流式细胞仪进行分选。
上述实施例1-3流式细胞仪分选的主要条件为,按CD4\CD25\FOXP3抗体的同型对照抗体的荧光值划定阳性和阴性的界限,将被分选的细胞划分为FOXP3+Treg细胞和FOXP3-T细胞,然后进行分选,结果如图1所示。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (5)
1.利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其特征在于,具体步骤为:
A.收集外周血单核细胞,用PBS液重悬,然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体,在温度为10-28℃条件下孵育;然后用PBS洗涤,离心收集细胞,得洗涤细胞;
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入FOXP3固定破膜剂洗涤,然后用FOXP3固定破膜剂重悬细胞,避光孵育,离心收集沉淀;然后用FOXP3固定破膜剂重悬细胞;然后加入荧光标记的FOXP3抗体,室温避光反应,得FOXP3抗体标记的细胞;
C.将步骤B所得FOXP3抗体标记的细胞加入细胞染色液重悬细胞,上流式细胞仪进行分选。
2.根据权利要求1所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其特征在于:所述步骤a是将收集的外周血单核细胞在4℃预冷的PBS液重悬至浓度为1×105~1×107个/100μL,加入CD4抗体和CD25抗体至终浓度分别为0.125-0.25μg/106细胞,在温度为10-28℃条件下孵育20-40分钟,然后用PBS洗涤细胞三次,洗涤后在转速大于1000转/分钟条件下,离心至少5分钟。
3.根据权利要求2所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其特征在于:所述步骤a中,加入CD4抗体和CD25抗体至终浓度分别为0.2μg/106细胞,在温度为18℃条件下孵育30分钟,洗涤后在转速为1100转/分钟条件下,离心8分钟。
4.根据权利要求1所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其特征在于:所述步骤B中,所述避光孵育时间为30-50分钟,加入所述荧光标记的FOXP3抗体至抗体终浓度为0. 125-0.25μg/106细胞。
5.根据权利要求4所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法,其特征在于:所述步骤B中,所述避光孵育时间为40分钟,加入所述荧光标记的FOXP3抗体至抗体终浓度为0.2μg/106细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2012102681484A CN102766597A (zh) | 2012-07-31 | 2012-07-31 | 利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2012102681484A CN102766597A (zh) | 2012-07-31 | 2012-07-31 | 利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102766597A true CN102766597A (zh) | 2012-11-07 |
Family
ID=47094177
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2012102681484A Pending CN102766597A (zh) | 2012-07-31 | 2012-07-31 | 利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102766597A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103698261A (zh) * | 2014-01-07 | 2014-04-02 | 中国人民解放军第三军医大学 | 利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法 |
CN106932576A (zh) * | 2017-03-22 | 2017-07-07 | 山东大学深圳研究院 | 一种人调节性t细胞的免疫抑制功能的检测方法 |
CN107937351A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-04-20 | 中山大学附属第三医院 | 一种炎症状态下的稳定型调节性t细胞及其制备方法 |
CN108508196A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-09-07 | 沈阳汇敏源生物科技有限责任公司 | 一种检测人调节性t细胞亚型的试剂盒及检测方法 |
US11873530B1 (en) | 2018-07-27 | 2024-01-16 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for metabolome analysis |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101883844A (zh) * | 2007-10-12 | 2010-11-10 | 分子医学马克斯德尔布吕克中心 | 快速分离人Foxp3+Treg细胞的方法和试剂盒 |
-
2012
- 2012-07-31 CN CN2012102681484A patent/CN102766597A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101883844A (zh) * | 2007-10-12 | 2010-11-10 | 分子医学马克斯德尔布吕克中心 | 快速分离人Foxp3+Treg细胞的方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
田易: "组蛋白的甲基化修饰在人Treg细胞基因表达调节中作用机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, 15 July 2012 (2012-07-15) * |
谭雨龙等: "乙肝病毒感染者外周血中CD4+Foxp3+T细胞亚群的表达及临床意义", 《免疫学杂志》, vol. 26, no. 5, 31 May 2010 (2010-05-31), pages 438 - 441 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103698261A (zh) * | 2014-01-07 | 2014-04-02 | 中国人民解放军第三军医大学 | 利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法 |
CN106932576A (zh) * | 2017-03-22 | 2017-07-07 | 山东大学深圳研究院 | 一种人调节性t细胞的免疫抑制功能的检测方法 |
CN107937351A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-04-20 | 中山大学附属第三医院 | 一种炎症状态下的稳定型调节性t细胞及其制备方法 |
CN108508196A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-09-07 | 沈阳汇敏源生物科技有限责任公司 | 一种检测人调节性t细胞亚型的试剂盒及检测方法 |
CN108508196B (zh) * | 2018-04-13 | 2020-10-27 | 何韶衡 | 一种检测人调节性t细胞亚型的试剂盒及检测方法 |
US11873530B1 (en) | 2018-07-27 | 2024-01-16 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for metabolome analysis |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102766597A (zh) | 利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法 | |
CN101329230B (zh) | 改进的免疫荧光细胞染色方法 | |
CN106932576A (zh) | 一种人调节性t细胞的免疫抑制功能的检测方法 | |
NZ600681A (en) | Assay for jc virus antibodies | |
Coughlan et al. | Measuring cellular immunity to influenza: methods of detection, applications and challenges | |
CN105974122A (zh) | 一种检测外泌体gpc1蛋白的方法 | |
DE08838013T1 (de) | Verfahren und kit zur schnellen isolierung humaner foxp3+-treg-zellen | |
Da Silva et al. | Natural killer cells response to IL-2 stimulation is distinct between ascites with the presence or absence of malignant cells in ovarian cancer patients | |
CN104020297A (zh) | 用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒及其用途 | |
Üreyen et al. | Usefulness of FGSI and UFGSI scoring systems for predicting mortality in patients with Fournier’s gangrene: a multicenter study | |
Rad et al. | Microvesicles preparation from mesenchymal stem cells | |
Petit et al. | Direct Meta-analyses reveal unexpected microbial life in the highly radioactive water of an operating nuclear reactor core | |
Marlow et al. | Spatially resolved correlative microscopy and microbial identification reveal dynamic depth‐and mineral‐dependent anabolic activity in salt marsh sediment | |
Godlewski et al. | Oncolytic virus therapy alters the secretome of targeted glioblastoma cells | |
CN104106497B (zh) | 一种测试昆虫行为的双向选择系统 | |
Giorda et al. | Neuropathological characterization of Dolphin Morbillivirus infection in Cetaceans stranded in Italy | |
Jackson et al. | IL-10-Secreting CD8+ T Cells Specific for Human Cytomegalovirus (HCMV): Generation, Maintenance and Phenotype | |
Wang et al. | Expression and significance of CD4+ CD25+ CD127-regulatory T cells in peripheral blood of patients with different phenotypes of Guillain-Barré syndrome | |
CN102206678A (zh) | 应用核转染法体外转染猪t淋巴细胞的方法 | |
Luo et al. | Isolation and Identification of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Forest Musk Deer | |
CN103698261A (zh) | 利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法 | |
CN106226524A (zh) | 一种食用菌dsRNA病毒的检测方法 | |
CN102621320B (zh) | 一种用于快速检测人禽流感病毒的非诊断性双抗体夹心法 | |
CN103451157B (zh) | 一种从混合病毒样品中分离新型鸭呼肠孤病毒的方法 | |
CN102062774A (zh) | 检测结核病治疗效果的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121107 |