CN101883844A - 快速分离人Foxp3+Treg细胞的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从样品中分离人forkhead box P3(Foxp3+)CD4+调节性T细胞(在本文称作Foxp3+Treg细胞)的方法，所述样品含有(i)外周血单个核细胞(PBMC)，(ii)含有淋巴细胞的液体或者(iii)含有淋巴细胞的组织；本发明还涉及分离人Foxp3+Treg细胞的试剂盒以及抗CD49d抗体用于分离人Foxp3+Treg细胞的应用。
Description
本发明涉及从样品中分离人forkhead box P3(Foxp3+)CD4+调节性T细胞(在本文称作Foxp3+ Treg细胞)的方法，所述样品含有(i)外周血单个核细胞(PBMC)，(ii)含有淋巴细胞的液体或者(iii)含有淋巴细胞的组织；本发明还涉及分离人Foxp3+ Treg细胞的试剂盒以及抗CD49d抗体在分离人Foxp3+ Treg细胞中的应用。
背景技术
Foxp3+调节性T细胞或者“Treg”是控制多种免疫应答的基础，其中Treg可迅速抑制其它免疫细胞的活性。特别地，Treg通过下调对自身和非自身抗原的非所需免疫应答而对于维持耐受性是至关重要的(见例如Fontenot，J.D.& Rudensky，A.Y.Nat Immunol 6，331-7(2005)；Sakaguchi，S.，Annu Rev Immunol 22，531-62(2004))。例如，在多发性硬化症(MS)、1型糖尿病(T1D)、银屑病、重症肌无力(MG)及其它自身免疫疾病的患者中已发现Treg缺陷(Baecher-Allan，C.& Hafler，D.A.，Immunol Rev 212，203-16(2006))。在特异反应性和过敏性疾病中也存在类似关联(Robinson，D.S.，Larche，M.& Durham，S.R.，J Clin Invest 114，1389-97(2004))。对于所有这些疾病均存在指向患者Treg细胞的降低的体外免疫抑制的报道。这已导致对于在治疗或者预防慢性感染、自身免疫疾病、过敏和移植相关并发症如移植物排斥或者移植物抗宿主疾病的免疫治疗中使用Treg的可能性的日益增长的兴趣(GvHD)(见Roncarolo，M.G.& Battaglia，M.，Nat Rev Immunol 7，585-98(2007)中的综述)。
在人和啮齿动物中，Treg细胞组成了大约2-10％的CD4+ T细胞并组成性表达CD25、CTLA-4和GITR以及参与其发育和功能的转录因子Foxp3。Treg细胞的特征性标记是Foxp3。用于分离人Foxp3+ Treg细胞的方法是已知的。例如，Hoffmann，P.et al.Biol Blood Marrow Transplant 12，267-74(2006)中描述了在优质生产规范(GMP)条件下通过使用两步磁性细胞分离方案从标准白细胞采集物(leukapheresis)产物中分离具有调节功能的CD4+CD25+T细胞。所产生的细胞产物含有平均49.5％的Foxp3+ Treg细胞。而且，商业试剂盒如Miltenyi Biotec的CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒或者Invitrogen的Dynal
CD4+CD25+Treg试剂盒也是可用的。
迄今为止所描述的所有分离人Foxp3+ Treg细胞的方法均使用基于Treg细胞表面标记的对Foxp3+ Treg细胞的阳性选择(见例如Seddiki，N.etal.，J Exp Med203，1693-700(2006))。也就是说，通过使用与Treg相关的细胞表面标记主要是CD25的抗体来分离Foxp3+ Treg细胞。但是大多数Treg细胞表面标记如CD4和CD25并非局限于Treg。例如，常用的CD25并不是在所有Foxp3+ Treg细胞上均存在，其在效应和记忆CD4+ T细胞上也表达(见例如Baecher-Allan，C，Brown，J.A.，Freeman，G.J.& Hafler，D.A.，JImmunol 167，1245-53(2001))。因此，上述这些阳性选择方法不能分离占Foxp3+ Treg细胞大多数的均一细胞群；Hoffmann，P.等获得平均49.5％的Foxp3+ Treg细胞。
目前方法的另一缺点是分离的Treg亚群中有效应T细胞的污染。后者代表有害反应的固有风险，因其通过分泌细胞因子如IFN-γ或者IL-17来驱动促炎免疫反应。当采用标记如CD25时，这些污染可以严重到高达一半的所分离的CD4+细胞群包括效应T细胞(Hoffmann，P.et al.Biol Blood MarrowTransplant 12，267-74(2006))。
另外，在细胞治疗中，对于基于Treg细胞表面标记的阳性选择而分离的Foxp3+ Treg细胞的应用会造成严重问题。首先，基于细胞表面标记如CD25对Foxp3+ Treg细胞的分离导致Foxp3+ Treg细胞群或多或少地被其它细胞如代表Treg抑制的主要靶的CD4+效应细胞所严重污染。因此，如果这种阳性选择的Foxp3+ Treg细胞被应用于细胞治疗中，将会存在高风险，因其可导致所治疗的患者的免疫系统被潜在地致命性激活。这种致命性的免疫应答最近在“Tegenero”实验的失败中有记载，其中预期使Treg细胞扩展的抗体导致效应细胞激活(Suntharalingam，G.et al.，N Engl J Med355，1018-28(2006))。其次，已经用抗体标记的阳性选择的Foxp3+Treg细胞可呈现出受损的功能。例如，用抗体标记的细胞被潜在地预先激活，可经受补体-或者细胞-介导的耗竭或者呈现出改变的归巢(homing)和迁移模式。因此，在其分离期间被抗体定靶向的Foxp3+ Treg细胞在治疗性的应用中并不合意，而这不仅仅是出于安全原因。
正如所讨论的那样，上述方法和试剂盒对于分离Foxp3+ Treg细胞显示出主要缺点。首先，目前分离免疫抑制性Foxp3+ Treg细胞的方法不能有效地去除污染CD4+效应和记忆T细胞。这是因为目前使用的技术和标记如基于CD25的Foxp3+ Treg的分离不能将这些污染CD4+效应和记忆T细胞与免疫抑制性Foxp3+ Treg细胞区分。例如，CD25是也存在于这些污染CD4+细胞上的标记。此外，至少若干这些污染CD4+细胞甚至不能通过细胞内Foxp3染色区分，因为激活的人CD4+效应细胞已知可瞬时表达Foxp3(Allanet al.，Int Immunol.19：345-54(2007))。因此，即使通过目前方法所分离的高纯度的CD25highCD4+T细胞群也含有相当部分的可产生细胞因子的促炎效应细胞(Dieckmann et al.，J.Exp Med.193，1303-1310(2001))，即分离的Foxp3+ Treg细胞明显被CD4+效应和记忆T细胞所污染。
此外，目前还没有通过阴性选择获取Foxp3+ Treg细胞的方法，即保留无标记/抗体的Foxp3+ Treg细胞。
由前述可知，对于用于分离几乎不含CD4+效应和记忆T细胞的Foxp3+Treg细胞的方法和试剂盒/组合物特别需要。对于不需要阳性选择Foxp3+Treg细胞的方法也是特别需要的。
因此，本发明的一个目的是提供避免上述现有技术缺点的方法。特别地，本发明的一个目的是提供分离免疫抑制性Foxp3+ Treg细胞的方法，这种方法可以有效除去产生细胞因子的CD4+细胞，包括瞬时表达Foxp3的CD4+效应细胞，其污染目前基于CD25的Treg制品。此外，本发明进一步的一个目的是提供分离Foxp3+ Treg细胞的试剂盒。并且，通过采用导入可以从Foxp3+ Treg细胞中区分产生细胞因子的效应T细胞的新标记，相对于通过其它方法获得的制品，本发明的方法和试剂盒提供了改善Treg制品的质量的新途径，特别是由于其对产生细胞因子的效应T细胞的去除。
发明描述
本发明是基于Foxp3+ Treg细胞的特异性细胞表面标记与非调节性CD4+ T细胞的细胞表面标记之间相关性的结果。特别地，检验细胞表面标记CD49d。在本发明的实验中，可以示出所述表面标记CD49d在大多数Foxp3+ Treg细胞中缺失。在本发明中，可以示出人Foxp3+ Treg细胞可通过使用针对CD49d的抗体来分离。此外，所分离的Foxp3+ Treg细胞的阻抑物活性已被本发明的实验所确认。所述分离的Foxp3+ Treg细胞能够在阻抑检验中阻抑效应T细胞的增殖，在体外强烈抑制混合淋巴细胞反应(MLR)以及在基于Rag2-/-γc-/-小鼠的GvHD模型中在体内防止转移的人PBMC的致命攻击。
在本发明的第一个方面，其目的之一可以由从样品中分离人Foxp3+Treg细胞的方法所解决，所述样品含有(i)外周血单个核细胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋巴细胞的液体，或者(iii)含有淋巴细胞的组织，所述方法包括如下步骤：
(a)用抗CD49d抗体处理该样品；
(b)分离Foxp3+ Treg细胞。
如本发明所用的术语“处理样品”应特别意指样品中含有的细胞以所述抗体可与被靶向的细胞相互作用的方式而与该抗体直接物理接触。换言之，在本发明的方法中，将外周血单个核细胞(PBMC)、含有淋巴细胞的液体或含有淋巴细胞的组织与抗CD49d抗体接触，并分离Foxp3+ Treg细胞。
如本文所用的术语“分离”是指用物理手段或者从其它细胞类型如CD4+效应细胞中取出一种细胞类型如Foxp3+ Treg细胞，或者从Foxp3+Treg细胞中去除所有非调节性CD4+ T细胞，从而保留富集的Foxp3+ Treg细胞群。也应注意所述分离可以在一个或多个步骤中进行，所述多个步骤也可以连续进行，即在第一次用一或多种抗体处理样品之后可以进行第一次分离，然后可以用一或多种抗体对分离自第一次分离的样品进行另一次处理，再紧接着另一次分离等等。关于分离技术的更详细的描述见P.T.Sharpe，Methods of Cell Separation，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Vol.18，ELSEVIER(1988)以及D.Fisher，G.E.Francis，D.Rickwood(Eds.)，Cell Separation：A Practical Approach，Oxford UniversityPress(1999)所述。
如本发明所用的术语“样品”是指含有外周血单个核细胞或者“PBMC”或者淋巴细胞的体液或组织。
如本发明所用的术语“含有淋巴细胞的液体”是指含有淋巴细胞的任何液体，如滑液。如本发明所用的术语“含有淋巴细胞的组织”是指含有淋巴细胞的任何组织，如脾、胸腺、淋巴结、骨髓、淋巴集结和扁桃体。
正如上文及在其它术语中所述，本发明通过简便、高度可靠及可重复的分离Foxp3+ Treg细胞的方法解决了所述技术问题。特别地，如上所述，现有技术方法依赖于Foxp3+Treg细胞的细胞表面标记，例如CD25。然而正如所解释的那样，所述方法仅可以允许有明显CD4+效应和记忆T细胞污染的Foxp3+ Treg细胞的分离。此外，由于目前所有方法均基于CD25，因此所有分离的Foxp3+ Treg细胞均是标记的，即由针对Foxp3+ Treg细胞的细胞表面标记之一的抗体所标记。再者，所述方法需要至少两个分离步骤：(i)耗竭(depletion)非CD4细胞；(ii)通过阳性分选分离CD25+细胞。与此相反，本发明的方法首先允许在单一步骤中分离Foxp3+ Treg。这是因为本发明的方法利用可以区分效应T细胞与Foxp3+ Treg细胞的CD49d作为标记。CD49d存在于大多数CD4+效应和记忆T细胞上，而在免疫阻抑性Foxp3+ Treg细胞上缺失。因此，其可用于从Foxp3+ Treg制品中去除污染细胞，如产生细胞因子的效应T细胞。CD49d+细胞的衰竭除去了几乎所有产生细胞因子的CD4+细胞，包括瞬时表达Foxp3的效应细胞，其污染基于CD25的Treg制品。这种方法适用于全体CD4+细胞，更引人注目地是适用于CD25+细胞的常规制品。
因此，使用本发明的方法分离Foxp3+ Treg细胞更快、更简单并且尤其是在对于占样品中所含Foxp3+ Treg细胞的大多数的均一细胞群的分离时更有效。换言之，应用本发明方法分离Foxp3+ Treg细胞可产生几乎没有污染CD4+效应和记忆T细胞的免疫阻抑性Foxp3+ Treg细胞群。最后，本发明的方法可以是自动化的，因此进一步增加该方法的易于应用性。
优选地，本发明分离Foxp3+ Treg细胞的方法包括：(a)用抗CD49d抗体处理含有Foxp3+ Treg细胞的样品；以及(b)通过抗CD49d抗体耗竭样品的CD49d+细胞，从而分离Foxp3+调节性T细胞，其中所述样品是(i)外周血单个核细胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋巴细胞的液体，或者(iii)含有淋巴细胞的组织。
根据本发明获得的最鼓舞人心的结果是发现在本发明的方法中，通过组合(相继或者同时)使用抗CD49d抗体和抗CD127抗体也可以获得高纯度不受影响(untouched)的Foxp3+ Treg细胞，即几乎没有污染CD4+效应和记忆T细胞，所述抗CD49d抗体和抗CD127抗体靶向两个细胞表面标记CD127和CD49d，其与Foxp3的表达反向相关。通过本发明的方法获得的分离的Foxp3+ Treg细胞是完全功能性的，这已被其体外抑制混合的淋巴细胞反应以及体内防止致死xeno-GvHD应答的能力而证实。迄今为止，所分离的Foxp3+ Treg细胞中非调节性CD4+细胞如效应和记忆CD4+细胞的污染是Foxp3+ Treg细胞分离方法中的主要缺点。相当大量的非调节性CD4+细胞存在于通过基于Treg细胞表面标记的阳性选择而分离的Foxp3+ Treg细胞群中。例如，Hoffmann，P.et al.Biol Blood Marrow Transplant 12，267-74(2006)在GMP条件下使用阳性选择所分离的Foxp3+ Treg细胞群中平均50％以上的细胞是非调节性CD4+细胞。自然，这种相当大量的非所需非调节性CD4+细胞妨碍了这种Foxp3+ Treg细胞群例如在上述的免疫治疗中的应用。
优选在本发明的方法中，步骤(a)和(b)可以同时进行。此外，步骤(a)和(b)也可以重复进行，即在进行第一次步骤(a)和第一次步骤(b)后，接着进行第二次步骤(a)和第二次步骤(b)，任选接着分再别进行第三次、第四次等的步骤(a)和(b)。值得注意的是，如果重复进行步骤(a)和(b)，对每个随后步骤(即第二次步骤(a)或(b)，第三次步骤(a)或(b)等)的各自样品应个别且独立于任何其它样品进行处理和分离。因此，例如如果在第一次步骤(a)中用抗CD49d处理样品，随后是第一次Foxp3+ Treg细胞的分离步骤(b)，例如通过使用选自离心、细胞淘析、磁性分离、荧光激活细胞分选术、免疫分离、粘附、补体溶解或者荧光激活细胞分选术的熟知的分离方法进行，然后在第二次步骤(a)中，第一次步骤(b)的这些Foxp3+ Treg细胞可以用例如抗CD25抗体和/或抗CD127抗体处理，接着进行第二次分离步骤(b)例如使用磁性细胞分离法分离CD25+Foxp3+ Treg细胞。
同时进行步骤(a)和(b)的优势在于Foxp3+ Treg细胞的分离更加省力、简便、快速且更具成本效益。重复进行步骤(a)和(b)的优势在于不同的细胞标记例如阳性标记如CD4、CD25或者阴性标记如CD127可用于分离，而且携带这些特定标记的细胞可以在随后的分离步骤中分离或者除去。因此可以分离出具有特定性质如特定细胞表面受体的单一细胞群。
在本发明的方法中，步骤(a)可另外包括用抗CD25抗体处理样品。优选将使用抗CD49d抗体分离的Foxp3+ Treg细胞用抗CD25抗体处理，随后分离CD25+Foxp3+ Treg细胞。
优选本发明分离Foxp3+ Treg细胞的方法包括：(a)用抗CD49d和抗CD25抗体处理含有Foxp3+ Treg细胞的样品；(b)通过抗CD49d抗体耗竭样品的CD49d+细胞，从而分离Foxp3+调节性T细胞，其中所述样品是(i)外周血单个核细胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋巴细胞的液体，或者(iii)含有淋巴细胞的组织。任选地，步骤(b)可另外包括通过抗CD25抗体对CD25+细胞的阳性选择。
如本发明所用的术语“阳性选择”意指通过标记/捕获所期望的细胞，而使不期望的细胞保持无标记，从而从细胞所有组成部分中取出所期望的细胞。
再者，在本发明方法中，步骤(a)可另外包括用抗CD127抗体处理样品。
优选本发明的分离Foxp3+ Treg细胞的方法包括：(a)用抗CD49d和抗CD127抗体处理含有Foxp3+ Treg细胞的样品；(b)通过抗CD49d抗体或者抗CD127抗体耗竭样品的CD49d+CD127+细胞，从而分离Foxp3+调节性T细胞，其中所述样品是(i)外周血单个核细胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋巴细胞的液体，或者(iii)含有淋巴细胞的组织。
再者，在本发明方法中，步骤(a)可另外包括从样品中分离非CD4+ T细胞。
从样品中另外分离非CD4+ T细胞的优势在于更高效地除去非CD4+ T细胞，并且其结果是所获得细胞群的纯度更高。
在本发明方法中，可以通过使用抗CD4抗体的阳性选择从样品中分离非CD4+ T细胞。
再者，在本发明方法中，可以使用允许特异性耗竭样品的非CD4+ T细胞的一或多种抗体通过阴性选择从样品中分离非CD4+ T细胞。
如本发明所用的术语“阴性选择”是指通过标记/捕获不需要的细胞，而使感兴趣的细胞保持无标记，从而从细胞所有组成成分中除去所述不需要的细胞。
通过耗竭来从样品中分离非CD4+ T细胞的优势在于CD4+ T细胞得以保持未受污染且未受影响。
本发明优选这样的方法，其中用于特异性耗竭样品的非CD4+ T细胞的一或多种抗体可选自包含抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD35抗体、抗CD36抗体、抗CD49b抗体、抗CD56抗体、抗CD66a抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体、抗CD66d抗体、抗CD89抗体、抗CDw92抗体、抗CD93抗体、抗CD111抗体、抗CD112抗体、抗CD123抗体、抗CD141抗体、抗CD156a抗体、抗CD170抗体、抗TCRg/d抗体、抗CD235a抗体、抗CD282抗体以及抗CDw329抗体、抗β7-整联蛋白抗体或者其混合物的组。
本发明优选使用抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体和/或抗CD66b抗体特异性耗竭样品的非CD4+ T细胞。
使用选自抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体和抗CD66b抗体的一或多种抗体特异性耗竭非CD4+ T细胞的优势是这种抗体亚群比一些可商业途径获得的亚群要小。
本发明的方法进一步优选使用抗CD14抗体和/或抗CD16抗体和/或抗CD66b抗体特异性耗竭样品的非CD4+ T细胞。
本发明优选的进一步方法，其步骤(a)中使用的至少一种抗体是标记或固定化的。
如本发明所用的术语“标记的”意指分子如抗体与标记缀合。可以与抗体缀合的许多不同标记为本领域技术人员所熟知。例如，放射性同位素如32P、35S或者3H；荧光或者发光标记，如荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；抗体或者抗体片段，如F(ab)2片段；亲和标记，如生物素、抗生物素蛋白、琼脂糖、骨形态发生蛋白(BMP)、基质结合型(matrix bound)、半抗原；以及酶或者酶底物，如碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)。
如本发明所用的术语“固定化的”是指抗体可与其连接且保持其活性的任何支持物。优选所述支持物可以是基质如尼龙基质的表面；微量滴定板或者类似的固体塑料支持物；珠，例如琼脂糖或者磁珠。固定化的抗体在例如US 4,615,985及其引用的参考文献中描述。
使用标记的或者固定化的抗体相对于未标记的抗体的优势是标记的或者固定化的抗体可易于与标准设备使用，也有利于对标准分离技术的适应。
本发明优选在步骤中(a)使用的至少一种抗体是固定化的。
在本发明方法中优选在步骤(a)中使用的至少一种抗体被固定于尼龙基质上。
将抗体固定于尼龙基质上的优势在于在尼龙基质上的固定非常有效，且允许灵活、容易、快速、简便及低成本地基于柱的细胞分离。在尼龙基质上的固定在例如US 4,615,985中描述。
本发明的方法进一步优选在步骤(a)中使用的抗体可以是均一标记的。
均一标记抗体的优势在于可以同时检测所有抗体。
在本发明的方法中优选所述标记可选自包含同位素、荧光或者发光标记、抗体或者抗体片段、亲和标记以及酶或酶底物的组。
本发明的方法优选抗CD25抗体可以用生物素、荧光素(FITC)或者藻红蛋白(PE)标记。
本发明的方法优选抗CD127抗体可以用生物素、荧光素(FITC)或者藻红蛋白(PE)标记。
本发明的方法优选抗CD49d抗体可以用生物素、荧光素(FITC)或者藻红蛋白(PE)标记。
本发明的方法优选步骤(b)可以通过使用离心特别是密度梯度离心、细胞淘析、磁性分离、荧光激活细胞分选术、免疫分离、粘附、补体溶解或者流式细胞术进行。
本发明的方法优选步骤(b)可以通过使用磁性细胞分离、荧光激活细胞分选术或者基于柱的免疫分离进行。
术语“基于柱的免疫分离”是指分选细胞的方式，其中本发明方法中使用的抗体可以附着于层析柱的树脂且用于结合具有该特异性抗体识别的抗原的细胞。
本发明的方法优选抗CD45RO抗体可用作步骤(a)中额外的抗体，且分离的Foxp3+ Treg细胞是CD45RA+ T细胞。
使用抗CD45RO抗体作为步骤(a)中额外的抗体的优势在于特异的Foxp3+ Treg细胞亚群即CD45RA+ T细胞能够以高度有效的方式及极高纯度被分离。
本发明的方法优选抗CD45RA抗体可用作步骤(a)中的额外的抗体，且分离的Foxp3+ Treg细胞是CD45RO+ T细胞。
使用抗CD45RA抗体作为步骤(a)中额外抗体的优势在于特异的Foxp3+Treg细胞的亚群即CD45RO+ T细胞能够以高度有效的方式及极高纯度被分离。
在本发明的第二个方面，其目的之一可以由分离人Foxp3+ Treg细胞的试剂盒解决，所述试剂盒包含抗CD49d抗体和抗CD25抗体或者抗CD49d抗体和抗CD127抗体。
再者，本发明的试剂盒可包含抗CD49d抗体、抗CD25抗体和抗CD127抗体。
优选本发明的试剂盒可另外包含一或多种选自如下组的抗体：抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD35抗体、抗CD36抗体、抗CD49b抗体、抗CD56抗体、抗CD66a抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体、抗CD66d抗体、抗CD89抗体、抗CDw92抗体、抗CD93抗体、抗CD111抗体、抗CD112抗体、抗CD123抗体、抗CD141抗体、抗CD156a抗体、抗CD170抗体、抗TCRg/d抗体、抗CD235a抗体、抗CD282抗体以及抗CDw329抗体、抗β7-整联蛋白抗体或者其混合物。
再者，本发明的试剂盒可含有至少一种固定化的抗体。
此外，本发明的试剂盒可含有至少一种标记的抗体。
优选本发明的试剂盒可含有均一标记的抗体。
本发明的试剂盒优选可含有标记的抗体，其中所述标记可选自包含同位素、荧光或者发光标记、抗体或者抗体片段、亲和标记以及酶或者酶底物的组。
优选所述试剂盒可含有可以用生物素、FITC或者PE标记的抗CD127抗体、抗CD25抗体和/或抗CD49d抗体。
在本发明第三个方面，其目的之一可通过使用(i)抗CD49d抗体，(ii)抗CD49d抗体组合抗CD25抗体和/或抗CD127抗体，或者(iii)本发明用于分离人Foxp3+ Treg细胞的试剂盒解决。特别地，抗CD49d抗体、抗CD49d抗体组合抗CD25抗体和/或抗CD127抗体或者本发明的试剂盒可用于从样品中分离人Foxp3+ Treg细胞，所述样品含有(i)外周血单个核细胞(PBMC)，(ii)含有淋巴细胞的液体，或者(iii)含有淋巴细胞的组织。
优选本发明的应用的特征在于人Foxp3+ Treg细胞的分离可以通过从Foxp3+ Treg细胞中分离CD49d+ PBMC(包括非调节性CD4+ T细胞)而实现，其中所述分离通过离心、细胞淘析、磁性分离、荧光激活细胞分选术、免疫分离、粘附、补体溶解或者流式细胞术进行。
再者，本发明的应用的特征在于使用至少一种选自包含如下的组的抗体耗竭样品的非CD4+ T细胞：抗CD8抗体、抗CD10抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD35抗体、抗CD36抗体、抗CD49b抗体、抗CD56抗体、抗CD66a抗体、抗CD66b抗体、抗CD66c抗体、抗CD66d抗体、抗CD89抗体、抗CDw92抗体、抗CD93抗体、抗CD111抗体、抗CD112抗体、抗CD123抗体、抗CD141抗体、抗CD156a抗体、抗CD170抗体、抗TCRg/d抗体、抗CD235a抗体、抗CD282抗体以及抗CDw329抗体、抗β7-整联蛋白抗体或者其混合物。
附图简述
图1：CD127和CD49d与Foxp3表达的反向相关性。将人PBMC针对CD4、CD25、CD127、CD49d和Foxp3染色，并通过FACS分析。a.人PBMC针对CD4和CD25的双重染色。示出总PBMC中CD4+细胞的百分比。b.CD25、CD127和CD49d与Foxp3表达的相关性。将人PBMC针对CD4、CD25、CD127、CD49d和Foxp3染色，并通过FACS分析。示出根据图1a门控(gated)获得的CD4+细胞的Foxp3与CD25(左图)、CD127(中间)及CD49d的共染色。数字表示每个象限中细胞的百分比。
图2：CD49d区分Foxp3+ Treg细胞与Foxp3- CD127-细胞。a.Foxp3在CD4+T细胞的CD127/CD49d亚群中的表达。将人PBMC针对CD4、CD25、CD127、CD49d和Foxp3染色并针对CD4+细胞门控选择。上图：CD49d和CD127的共染色。示出三个主要细胞群的门(gate)和百分比。下图：示出对于CD127+细胞(左侧)、CD49d-CD127-细胞(中间图)和CD49d+CD127-细胞(右侧)的CD25与Foxp3共染色。百分比表示指定象限中CD25+Foxp3+ Treg细胞数。b.通过FACS分选分离CD49d-CD127-和CD49d+CD127-细胞。将用商购的MACS-耗竭试剂盒从PBMC中分离的未受影响的CD4+细胞用α-CD49d和α-CD127染色(左图)，并且由FACS分选出CD49d-CD127-(中间图)和CD49d+CD127-亚群(右图)。数字表示每个象限中细胞的分数。c.阻抑能力。如图3b所示，两个分离的细胞亚群对于增殖应答的抑制作用由基于FACS的阻抑测定来确定。CD4+细胞的增殖由α-CD3抗体诱导，以1∶2比率加入阻抑细胞。阻抑作用以“％抑制”表示，并通过分裂的细胞相对于分裂的α-CD3刺激的CD4+细胞数目的分数来计算。
图3：通过MACS从CD4+ T细胞中分离未受影响的Foxp3+ Treg细胞。由商购CD4分离试剂盒通过MACS分离的人PBMC未受影响的CD4+细胞在CD127/CD49d表达细胞的第二步中被MACS耗竭。a.耗竭的细胞的FACS分析。示出耗竭之前(左图)CD4+细胞群以及CD49d/CD127耗竭之后留下的细胞(右图)的FACS图。所示数据为染色CD49d对比CD127(上图)和CD25对比Foxp3(下图)。百分比是指每个象限中细胞数。b.阻抑能力。已耗竭CD49d/CD127+细胞的CD4+ T细胞在基于FACS的体外测定中被用作阻抑细胞(Treg)。将通过衰竭除去的CD4+效应细胞用CFDA标记，并用作应答物(responder)细胞。图中示出无任何刺激(上图)、与α-CD3温育后(中间图)或者在存在未受影响的1∶1比率的Treg细胞的条件下与α-CD3温育之后(下图)的CD4+细胞的CFDA染色。数字表示分裂的CD4效应细胞的百分比。
图4：从PBMC中分离未受影响的Treg细胞。Treg细胞通过MACS-耗竭从总PBMC中分离。a.仅用α-CD49d/α-CD127来耗竭。如图3所述使用α-CD49d和α-CD127进行人PBMC的耗竭，不同之处是使用总PBMC而不是纯化的CD4+细胞。b.使用α-CD49d/α-CD127组合CD4+ T细胞分离试剂盒的一步耗竭。为了增加纯度，将α-CD127和α-CD49d加入商购CD4+T细胞分离试剂盒的抗体混合物中。图中示出耗竭之前PBMC(左图)以及耗竭之后所得珠阴性级分(右图)的CD49d对比CD127和CD25对比Foxp3的染色。数字表示每个象限中细胞的百分比。
图5：体外对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制及体内对GvHD的防止。通过如图4所述一步CD127/CD49d耗竭法从人PBMC中分离未受影响的Treg细胞。a.MLR的抑制。示出三个不同供体的MLR反应。在每个反应中将105个PBMC与相同数目的单元型错配的另一个供体(异源(allogen))的经辐射的PBMC一起温育。通过加入在一步MACS耗竭中分离的2.5×104自体Treg细胞(异源 & Treg)来抑制该反应。增殖可通过参入3H-胸苷来确定，并以“每分钟计数(cpm)”来表示。b.急性GvHD的防止。通过将30×106 CD25耗竭的人PBMC(CD25-PBMC)过继转移至Rag2-/-γc-/-小鼠中来诱导急性异种-GvHD。疾病的进展通过确定体重降低(左图)记录。一组仅接受CD25-PBMC(实心圆)，第二组在共转移中接受CD25-PBMC以及0.5×106未受影响的自体Treg细胞(空心圆)。使用每组6只小鼠；相对于实验开始时体重确定平均相对体重，并以“体重降低百分比”表示。临床迹象(皱褶的毛皮，背部躬曲姿势以及不活动)和死亡的发生率在右图示出。
图6：通过α-CD49d耗竭纯化CD25+ Treg细胞。a.CD49d表达与细胞因子分泌的分离。分泌细胞因子的CD4+细胞表达CD49d。在体外用PMA/离子霉素刺激CD4+ T细胞，并在6h后通过FACS分析。示出总CD4+细胞(上图)和Foxp3+CD4+细胞(下图)针对CD49d对比IL-17(左上图)或者CD49d对比IFN-γ(右上图)的染色。总CD4+细胞的百分比是指每个象限的细胞数。Foxp3门控的CD4+细胞的百分比是指CD49d+或者CD49d-细胞的分数，在虚线门中分泌细胞因子的细胞的百分比参照CD49d+细胞数。b.CD49d从CD25high Treg制品中除去Th1-和Th17-样细胞。人Treg细胞的特征在于CD25high表达。使用α-CD4、α-CD25和α-CD49d对PBMC染色，并通过FACS将其分选为CD4+亚群CD49d+CD25high和CD49d-CD25high。分选的细胞亚群用PMA/离子霉素激活，并且针对IFN-γ和IL-17进行胞内染色。百分比表示指定象限中细胞数。
图7：通过耗竭人CD4+ T细胞中的CD49d+细胞富集Foxp3+ Treg。人CD4+细胞被CD49d耗竭，并通过FACS分析CD25和Foxp3表达。左图：总CD4+细胞；右图：CD49d耗竭的CD4+细胞。示出CD25对比Foxp3(上方)和Foxp3对比CD49d(下方)的染色。数字表示每个门控中细胞的百分比。
图8：从CD127- Treg制品中去除产生细胞因子的效应细胞。如图2a所述进行实验，不同之处是在用PMA/离子霉素分选之后刺激纯化的CD4+T细胞亚群以测量细胞因子产生。如图2a所述进行FACS分析，不同之处细胞使用α-IFN-γ和α-IL-17进行胞内染色。
本发明现将通过如下非限制性的关于附图的实施例进一步描述。对于本发明的目的，本文引用的所有参考文献均以其全部内容援引加入。此外，本发明基于对源自志愿者的生物学样本所进行的科学实验。志愿者已给出许可在本发明所公开的研究中使用所述样本。
实施例
在实施例中使用的特定方法和材料：
抗体和试剂
特异于CD4(RPA-T4)、CD25(MA251)和CD127(hIL-7R-M21)的抗体购自BD Bioscience。抗IFN-γ购自Miltenyi Biotech(45-15)。抗CD49d(BU49)得自ImmunoTools。α-CD3(UCHT-1)由MDC生产。αFoxp3(PCH101)和α-IL-17(eBio64CAP17)购自eBioscience，胞内染色根据厂商推荐进行。CFDA得自Molecular Probes，3H-胸苷得自GE Healthcare。
流式细胞术和细胞制备
人PBMC得自健康志愿者。单个核细胞通过Ficoll梯度离心(GEHealthcare)分离。FACS分析在FACSCalibur或者LSR II设备(BD Bioscience)上进行。使用FACSDiva软件(BD Bioscience)、CellQuest(BD Bioscience)或者Flowjo软件(Treestar)分析数据。
细胞因子检测
将细胞用PMA和离子霉素刺激4-6小时，并且在最后3-4小时有布雷菲德菌素A(brefeldin A)存在。细胞因子分泌通过使用MACS-或者FACS-分选的CD4+ T细胞亚群用α-IL-17和α-IFN-γ进行胞内染色来确定。细胞是新鲜使用或者在刺激之前在补加了50U/ml IL-2的RPMI中维持过夜。
Treg分离
使用MACS系统(Miltenyi Biotech)进行磁性细胞分选，FACS分选使用FACSAria设备(BD Bioscience)。A)通过CD49d耗竭进行Treg富集：将分选的MACS(hCD4-分离试剂盒II/Miltenyi Biotech)与α-CD49d-FITC在4-8℃温育10分钟。用MACS缓冲液在4-8℃洗涤10分钟之后，将每107个细胞与10μl α-FITC-磁珠(Miltenyi Biotech)在4-8℃温育15分钟。用MACS缓冲液洗涤后，使用LD-柱(Miltenyi Biotech)分离细胞。B)不受影响的两步MACS流程：未受影响的人CD4+ T细胞首先用hCD4-分离试剂盒II(Miltenyi Biotech)从PBMC中分离。在第二个步骤中，将该细胞与α-CD49d-FITC和α-CD127-生物素在4-8℃温育10分钟。用MACS在4-8℃洗涤10分钟后，将每107个细胞与10μl α-FITC-和20μlα-生物素-磁珠(Miltenyi Biotech)在4-8℃温育15分钟。用MACS缓冲液洗涤后，使用LD-柱(Miltenyi Biotech)分离细胞。C)不受影响的一步MACS流程：将人PBMC与FITC-标记的α-CD49d、生物素标记的α-CD127以及生物素标记的人CD4+T细胞分离试剂盒II的抗体混合物在4-8℃温育10分钟。用MACS缓冲液洗涤后，将每107个细胞与10μlα-FITC-和25μlα-生物素磁珠在4-8℃温育15分钟。用MACS缓冲液洗涤后，使用LD-柱分离细胞。D)不受影响的一步MACS流程(仅CD49d和CD127耗竭)：将人PBMC与FITC-标记的α-CD49d、生物素标记的α-CD127在4-8℃温育10分钟。用MACS缓冲液洗涤后，将每107个细胞与15μlα-FITC-和20μlα-生物素磁珠在4-8℃温育15分钟。用MACS缓冲液洗涤后，使用LD-柱分离细胞。E)FACS-分选：未受影响的CD4+T细胞使用人CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotech)从人PBMC中获得。将细胞用α-CD49d-FITC和α-CD127-PE在4-8℃染色10分钟。用MACS缓冲液洗涤后，将细胞重悬浮于MACS缓冲液中，并在细胞分选仪上分选。未受影响的Treg细胞通过使用针对CD49d-CD127-细胞的分选门(sorting gate)而获得。对于CD25+细胞的FACS分选，将人PBMC用α-CD49d、α-CD4和α-CD25在4-8℃染色10分钟。用MACS缓冲液洗涤后，将细胞重悬浮于MACS缓冲液中并在细胞分选仪上使用针对CD4+CD25highCD49d+或者CD4+CD25highCD49d-细胞的分选门分选。死亡细胞通过碘化丙锭(Sigma)排除。
基于CFDA的增殖测定
如前(Kleinewietfeld，M.et al.Blood 105，2877-86(2005))所述，用0.5μM5-羧基二乙酸荧光素(CFDA；Molecular Probes)标记CD4+效应细胞。将CD4+效应T细胞(25,000个细胞/孔)与经照射的CD4-耗竭的PBMC(50,000个细胞/孔；3000rad)以及10μg/ml抗CD3(UCHT-1)在96孔V形底平板(Costar)中温育3-4天。对于T细胞阻抑，以指定比率加入Treg细胞。CD4+T细胞的增殖情况通过FACS分析。
混合淋巴细胞反应(MLR)
人PBMC的MLR如(Ebert，L.M.& McCoI1，S.R.J Immunol 166，4870-8(2001))所述进行。将人PBMC(100.000个细胞/孔)与经照射的(3.000rad)同种异体PBMC(100.000个细胞/孔)在RPMI/10％FCS(Invitrogen)中温育5天。对于增殖的阻抑，以指定比率加入分离的自体Treg细胞。增殖情况通过额外的10-15小时培养的3H-胸苷参入(1μCi/孔)来监测，并使用β-平板读数仪(Wallac)来确定。
异种移植物抗宿主疾病(x-GvHD)
一种急性形式的GvHD可在Rag2-/-γc-/-小鼠(购自Taconic)中如先前所述9被诱导。简而言之，PBMC由α-CD25微珠(Miltenyi Biotech)使用LD柱(Miltenyi Biotech)耗竭。Treg细胞可使用一步流程从健康供体PBMC中获得。在转移前一天，小鼠经静脉内接受0.2ml含有氯膦酸盐/酯的脂质体。在转移细胞之前4小时，对小鼠进行照射(350rad)。静脉内注射30×106CD25耗竭的PBMC，其单独使用或者在PBS/0.1％人血清白蛋白中与0.5×106Treg细胞以混合物的形式使用。在整个实验期间测定小鼠的体重和临床症状；所述疾病的临床迹象是皱褶的毛皮、背部躬曲姿势和受损的运动。
实施例1：CD127和CD49d与Foxp3反向相关
根据供体情况，大约30-60％的人PBMC是CD4+ T细胞(图1a)，这些细胞中大约3-10％是Treg细胞。虽然大多数的人Treg细胞表达高水平的IL-2受体α-链CD25(CD25high)，但是这个标记不能如在小鼠中那样明确分离Treg细胞群与非调节性CD4+细胞。一些效应和记忆CD4+细胞也表达较少的量的CD25(CD25low)，由此其细胞群部分地与CD25highTreg亚群重叠(Baecher-Allan，C，Brown，J.A.，Freeman，G.J.& Hafler，D.A.，J Immunol 167，1245-53(2001))。因此基于这个标记的Treg分离物具有被这些细胞所污染的固有风险。与一些其它基因一样，Treg细胞上的CD25表达由Foxp3直接驱动(Hori，S.，Nomura，T.& Sakaguchi，S.，Science 299，1057-61(2003))。因此用Foxp3对比染色表示对CD25high细胞的接近线性的相关性，其中表达最高量Foxp3的细胞对于CD25也是最亮染色(图1b，左图)。
与CD25相反，IL-7受体(CD127)的α-链与Foxp3表达反向相关(Liu，W.et al.，J Exp Med 203，1701-11(2006)；Seddiki，N.et al.，J Exp Med 203，1693-700(2006))(图1b，中间图)。此处所述相关性也接近线性，但是具有最高水平Foxp3的细胞具有最低的CD127表达水平。然而，此分离并不完全。在图1b(中间图)所示实例中，大约2/3的CD127-细胞也是Foxp3-。因此对于Treg细胞鉴别，CD127总是与CD25组合使用(Liu，W.et al.，J ExpMed203，1701-11(2006)；Seddiki，N.et al.，J Exp Med203，1693-700(2006))。
我们自己的研究鉴定出了第二种在大多数Treg细胞上缺失的表面标记。CD49d是整联蛋白VLA-4(α4β1)的α-链。且在此处的共分离也是不完全的(图1b，右图)。然而，正如对CD127所观测到的，与Foxp3的反向线性相关显然并不存在。而双重染色显示了在Foxp3+细胞中不依赖于Foxp3表达水平的CD49d的缺失。
实施例2：CD49d区分Foxp3+ Treg细胞与Foxp3-CD127-细胞
虽然这两个标记与Treg细胞的分离都不完全，但是组合使用CD127和CD49d可彼此互补。用α-CD127和α-CD49d双重染色可将CD4+细胞群分为三个主要细胞群：CD127+、CD49d+CD127-和CD49d-CD127-细胞(图2a，上图)。用α-CD25和α-Foxp3染色证实绝大多数CD127+细胞是非调节性CD25-Foxp3-细胞(图2a，左下图)。更重要的是，CD49d将CD127-亚群分为两个几乎等大的亚群。大多数CD49d+CD127-细胞是Foxp3-，仅18％以下的细胞是CD25+Foxp3+(图2a，右下图)。相反，CD49d-CD127-细胞群几乎只由Foxp3+细胞组成。83％以上的细胞是表达高水平Foxp3的CD25+Foxp3+ Treg(图2a，中下图)。
为了证实CD49d-CD127-表型与阻抑能力相关，通过FACS分选从CD4+PBMC中分离CD49d+CD127-和CD49d-CD127-细胞(图2b)。几乎无抑制作用可在CD49d+CD127-亚群观测到(图2c)。相反，仅基于缺失CD49d和CD127所分选的CD4+细胞有效地防止激活的CD25-CD4+细胞的扩增。因此，使用CD49d可区分非阻抑性CD127-细胞与功能性Foxp3+ Treg细胞。
实施例3：通过MACS纯化未受影响的Foxp3+ Treg细胞
FACS分选实验的结果表明通过MACS组合耗竭具有由α-CD127和α-CD49d的CD4+ T细胞应产生未受影响Treg细胞的干净细胞群。为了验证这种方法的可应用性，将从人PBMC分离的未受影响的CD4+细胞用α-CD127和α-CD49d标记并通过MACS使用常规磁珠标记抗体使其耗竭(图3)。FACS分析表明所述耗竭产生纯度＞95％的CD49d-CD127-细胞群(图3a，上图)。CD25和Foxp3的染色证实了92％以上的这些细胞是CD25+Foxp+细胞，另外2％是CD25-Foxp3+(图3a，下图)。为了证实分离的Treg细胞的功能性，所述细胞在基于FACS的体外阻抑测定中检测(图3b)。将CD4+效应细胞用CFDA标记以监测增殖情况。没有任何刺激时，所述细胞不分裂(图3b，上图)；但是用α-CD3刺激则触发增殖性应答，其由大约45％的细胞的CFDA荧光降低表明(图3b，中间图)。MACS纯化的Treg细胞的加入将增殖抑制至14％，其中大多数在单一复制周期之后已经终止扩增(图3b，下图)。因此，通过用α-CD127和α-CD49d的MACS耗竭分离的未受影响的Treg细胞在体外完全能够阻抑自体CD4+效应细胞。
实施例4：通过MACS经单一步骤从PBMC中纯化未受影响的Foxp3+ Treg细胞
当使用总PBMC而不是预先纯化的CD4+细胞时，CD49d的选择性特别显著(图4)。与在几乎一半的PBMC上缺失的CD127相反，绝大多数非CD4+ T细胞仍表达CD49d(图4，左图)。在总PBMC中，40-50％是CD49d+CD127-，而仅大约2-4％的CD49d-CD127-。因此仅CD49d+/CD127+细胞的耗竭已经足以直接从PBMC中获得未受影响的Foxp3+细胞，其纯度＞75％(11.8％CD25-Foxp3+，64.3％CD25+Foxp3+；图4a)。将α-CD49d/α-CD127加入商购CD4+T细胞分离试剂盒的抗体混合物中时，该纯度可进一步提高(图4b)。耗竭后对PBMC级分的FACS分析表明＞90％是Foxp3+细胞(76.2％CD25+Foxp3+，14.1％CD25-Foxp3+)。因此通过一步PBMC耗竭获得的细胞的纯度与用预先分离的CD4+T细胞获得的纯度相当(比较图3)。
实施例5：在体外和体内抑制同种反应/异种反应
为了证实通过直接PBMC耗竭分离的Treg细胞的功能和生存力，阻抑能力在混合淋巴细胞反应(MLR)中检测。MLR是GvHD的体外相关反应。其基于“外来”MHC分子对T细胞的同种激活，在混合两个不同供体的PBMC之后显现。为了确定Treg细胞是否能控制同种反应应答，将其加入与单元型错配供体的经照射的PBMC混合的未经照射的自体PBMC中(图5a)。在这些实验中，证实根据实施例4从PBMC纯化的Treg细胞(图4b)是同种应答的有效阻抑物。如对于三个不同供体所示，Treg细胞的存在强有力地阻抑自体PBMC的增殖。因此，未受影响的PBMC衍生的Foxp3+细胞是能体外控制同种免疫应答的完全功能性Treg细胞。
MLR实验明确证明了分离的Treg细胞在体外的阻抑能力。然而关于未来治疗应用，关键是证明未受影响的Treg细胞也可以在体内阻抑破坏性免疫应答。一个急性GvHD体内模型被用于此目的，该模型基于将CD25-耗竭的人PBMC转移至Rag2-/-γα-/-小鼠中(Mutis，T.et al.，Clin Cancer Res 12，5520-5(2006))。从转移的细胞群中消除Treg细胞可以刺激该疾病的一种特别有攻击性的形式，其经常导致动物死亡。用α-CD25微珠通过MACS耗竭PBMC中的Treg细胞，在单一步骤中未受影响的Treg细胞可通过组合使用α-CD127/α-CD49d以及商购CD4+分离试剂盒再次分离(如实施例4所述，图4b)。接受30×106CD25耗竭的PBMC的所有小鼠在实验的前几天均呈现出较显著或不太显著的体重降低(图5b)。6只小鼠中有4只发展出临床症状，其中2只小鼠在实验期间死亡。与先前的出版物一致，当共转移自体Treg细胞时，PBMC诱导的GvHD的严重程度降低(Mutis，T.et al.，ClinCancer Res 12，5520-5(2006))。在这个情况中，0.5×106未受影响的Treg细胞足以完全消除体重降低，治疗组的所有小鼠在整个实验期间均保持无症状出现。因此，通过CD127/CD49d耗竭分离的未受影响的Treg细胞是能体外和体内控制破坏性免疫应答的有效阻抑物细胞。
实施例6：从CD25high Treg制品中分离污染效应细胞
CD25由Treg细胞(CD25high)高水平表达。然而，在人体内这个标记也由促炎细胞包括效应和记忆CD4+ T细胞(Baecher-Allan et al.，J Immunol.167：1245-53(2001))以及瞬时表达Foxp3的激活的CD4+ T细胞(Allan et al.，Int Immunol.19：345-54(2007))少量表达。与Treg细胞相反，这些效应细胞能分泌促炎细胞因子如IFN-γ或者IL-17。如图6a所示，CD49d的表达是与分泌细胞因子的能力相分离的。这既适用于全部CD4+细胞也适用于Foxp3+细胞亚群。因此，CD49d可用于从基于CD25分离的Treg制品中除去可分泌细胞因子的污染效应细胞。在FACS-分选的情况中(图6b)，可通过对CD49d-CD25highCD4+亚群的门控(gating)获得纯Treg细胞；对于MACS-分选，在包括用a-CD25阳性分离的分选流程之前用α-CD49d耗竭细胞。
实施例7：单独用CD49d耗竭产生Treg富集的CD4细胞制品
由于CD49d在大多数Foxp3+ Treg细胞上缺失，因此其可以通过从总CD4+ T细胞中耗竭CD49d+细胞而被显著富集。通过MACS使人CD4+ T细胞的所有CD49d+细胞耗竭，并分析其Foxp3表达且与总CD4+ T细胞对比。如图7所示，通过从人CD4+ T细胞中耗竭CD49d+细胞，Foxp3+ Treg已经可以被富集直至4-5倍。更重要的是，大多数产生细胞因子的细胞从这个亚群中被除去，因为细胞因子分泌与这个标记相分离(图6a)。
实施例8：CD49d+细胞的耗竭除去污染CD127- Treg制品的产生细胞因子的CD4+效应细胞
组合CD49d与CD127可以分离未受影响的Treg细胞(图2)。此外，CD49d与细胞因子生产之间的分离也使得可以不仅除去Foxp3-细胞，也除去污染CD127-Treg制品的Th1-或者Th17-样细胞。如图8所示，根据其CD49d和CD127表达分选的CD4+细胞亚群的激活清楚地显示产生IFN-γ或者IL-17的细胞在CD49d-CD127-亚群中缺失，但是在CD49d+CD127-亚群中存在。
工业实用性
本发明的方法具有如下优势：
1)安全性。对用于人体治疗中的试剂的管理是非常严格的。这特别适用于在治疗期间施用的化合物。通过阳性分选产生的细胞在其表面携带外源抗体。抗体的固有风险难以确定，且“人源化”也未必可以防止不利作用，如最近在超拮抗性α-CD28的戏剧性失败中所记载的(Suntharalingam，G.et al.，N Engl J Med 355，1018-28(2006)；Sharpe，A.H.& Abbas，A.K.，N EnglJ Med 355，973-5(2006))。当使用仅用耗竭抗体纯化的未受影响的Treg细胞时可以避免这一风险。此外，CD49d在潜在危险的分泌细胞因子的效应T细胞上存在，但是在Foxp3+ Treg细胞上缺失。因此，常规所得的Treg细胞的安全性可以通过除去CD49d+细胞而增加。
2)细胞存活性和功能状态。与阳性分选的细胞相比，未受影响的细胞的另一优势是在体内具有存活性。抗体标记的细胞趋于衰竭。在细胞表面上的抗体可以结合补体，或者根据抗体亚型而附着于NK细胞或者巨噬细胞表面上的Fc受体。这种相互作用的结果通常是由于补体介导的裂解或者抗体依赖性细胞介导的胞毒性(ADCC)而使细胞死亡。与抗体包被的珠的结合也可以导致较大的细胞簇形成，其由受体(recipient)的非特异性吸收机制消除。结果，转移的细胞的主要部分会在其可显示有益作用之前被清除。此外，在纯化期间抗体与细胞表面受体的结合也会改变其功能状态。在Treg细胞的阳性分选时被靶向的分子是CD25。作为IL-2受体的α-链，其对于Treg细胞的存活和功能至关重要。阻断会消除扩增和阻抑功能(Thornton，A.M.，Donovan，E.E.，Piccirillo，C.A.& Shevach，E.M.，J Immunol 172，6519-23(2004)；Fontenot，J.D.，Rasmussen，J.P.，Gavin，M.A.& Rudensky，A.Y.，NatImmunol 6，1142-51(2005)；Kohm，A.P.et al.，JImmunol 176，3301-5(2006)；McNeill，A.，Spittle，E.& Backstrom，B.T.，Scand J Immunol 65，63-9(2007))，而另一方面IL-2受体与抗体的交联可导致过早激活(Barnard，A.L.，Igakura，T.，Tanaka，Y.，Taylor，G.P.& Bangham，C.R.，Blood 106，988-95(2005)；vonBonin，A.，Huhn，J.& Fleischer，B.，Immunol Rev 161，43-53(1998))，潜在的并发症在使用未受影响的Treg细胞时可被简单地避免。
3)时间与成本。与标准方法相比，本发明的新方法是有成本效益且快速的。CD49d/CD127可适于所有通用的分离方法。例如，可以仅使用单一MACS柱进行该方法。因此，分离不需要昂贵的设备且比常规的基于MACS的方法更快速及更简便。
4)纯度及GMP相容性。基于流式细胞术的细胞分选仪目前未经优质生产规范(GMP)许可。对于临床试验，供体细胞的分离必须经由磁珠技术来进行。然而，在GMP条件下分离Treg细胞的最初尝试产生的平均纯度低于50％(Hoffmann，P.et al.，Biol Blood Marrow Transplant 12，267-74(2006))。因为MACS纯化基于对CD25+细胞的阳性选择，污染细胞主要是CD4+CD25low效应和记忆细胞，当转移到免疫缺陷患者体内时会造成触发GvHD的固有风险。作为基于MACS的方法，本发明的新方法是GMP相容的。获得＞70％、＞80％、＞90％、＞95％或者甚至＞98％的明显较高纯度的Treg细胞，而几乎没有污染CD4+效应细胞。此外，Treg细胞是不受影响的被分离的，这进一步提高了该流程与GMP的相容性。
因此，本发明的方法提供了简便且有成本效益的分离人Foxp3+ Treg细胞的方式。此外，该方法中的细胞“未受影响的”状态、高纯度及GMP相容性使得该方法可广泛应用于不同情况中。因此这个新方法可用于获取“未受影响的”人Treg细胞用于研究和开发、诊断并且为其在生产免疫治疗药物中的常规应用提供了新的前景。
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Claims (15)
1.从样品中分离人Foxp3+调节性T细胞(Foxp3+Treg细胞)的方法，所述样品含有(i)外周血单个核细胞(PBMC)，(ii)含有淋巴细胞的液体，或者(iii)含有淋巴细胞的组织；所述方法包括步骤：
(a)用抗CD49d抗体以及如下抗体处理所述样品
(i)抗CD25抗体，或者
(ii)抗CD127抗体；及
(b)分离Foxp3+Treg细胞。
2.权利要求1的方法，其中同时进行步骤(a)和(b)。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)包括用抗CD25抗体和抗CD127抗体处理样品。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤(a)另外包括从样品中分离非CD4+T细胞。
5.权利要求4的方法，其中允许特异性耗竭样品中非CD4+T细胞的一或多种抗体用于从样品中分离非CD4+T细胞。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤(a)中使用的至少一种抗体是标记或固定化的。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中步骤(b)通过耗竭样品中的如下细胞来进行：
(i)通过抗CD49d抗体耗竭CD49d+细胞；或者
(ii)通过抗CD127抗体耗竭CD127+细胞；或者
(iii)通过抗CD49d和/或抗CD127抗体耗竭CD49d+CD127+细胞。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中步骤(b)通过使用离心、细胞淘析、磁性分离、荧光激活细胞分选术、免疫分离、粘附、补体溶解或者流式细胞术进行。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中步骤(b)通过使用磁性细胞分离、荧光激活细胞分选术或者基于柱的免疫分离进行。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中抗CD45RO抗体在步骤(a)中用作额外的抗体，且其中分离的Foxp3+Treg细胞是CD45RA+T细胞。
11.权利要求1-9任一项的方法，其中抗CD45RA抗体在步骤(a)中用作额外的抗体，且其中分离的Foxp3+Treg细胞是CD45RO+T细胞。
12.分离人Foxp3+Treg细胞的试剂盒，其包含抗CD49d抗体和抗CD25抗体或者抗CD49d抗体和抗CD127抗体。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述试剂盒包含抗CD49d抗体、抗CD25抗体和抗CD127抗体。
14.抗CD49d抗体组合抗CD25抗体和/或抗CD127抗体、或者权利要求12或13的试剂盒在分离人Foxp3+Treg细胞中的应用。
15.权利要求14的应用，其特征在于通过离心、细胞淘析、磁性分离、荧光激活细胞分选术、免疫分离、粘附、补体溶解或者流式细胞术从Foxp3+Treg细胞分离包括非调节性CD4+T细胞的CD49d+PBMC而实现人Foxp3+Treg细胞的分离。
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