CN102762732B

CN102762732B - 包含突变体spr基因且具有降低的tsp活性的细菌宿主菌株

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Publication number: CN102762732B
Application number: CN201180009682.7A
Authority: CN
Inventors: M·爱丽丝; D·P·汉弗莱斯
Original assignee: UCB Pharma SA
Current assignee: UCB Pharma SA
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: BR112012017425A2; SMT201500145B; GB201000587D0; CA2786335C; PT2524043E; SG182301A1; ES2539931T3; HRP20150659T1; US20150132828A1; CN102762732A; CA2786335A1; PL2524043T3; AU2011206584B2; KR101737152B1; WO2011086136A1; CN105505845A; KR20130030247A; US8969039B2; US9587227B2; JP2013516964A

Abstract

本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的SPR基因，所述突变的spr基因编码在选自D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸处具有突变的s？pr蛋白质，且其中细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。

Description

包含突变体SPR基因且具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株

本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌（E.Coli）。本发明还涉及在此细胞中产生目的蛋白质的方法。

发明背景

通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞的多样属性使得通过质粒进行基因插入。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人胰岛素。

尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括难于产生蛋白酶敏感型蛋白质。蛋白酶在大肠杆菌细胞周质和细胞质中对于转换老旧、受损或错误折叠的蛋白质起重要作用。细菌蛋白质起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常显著降低活性蛋白质的产量。

已经鉴定出大量细菌蛋白酶。在大肠杆菌中蛋白酶包括蛋白酶III（ptr）、DegP、OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP及lon。

Tsp（也称为Prc）为一种60kDa的细胞周质蛋白酶。第一种已知的Tsp底物为青霉素结合蛋白质-3（PBP3）(DeterminationofthecleavagesiteinvolvedinC-terminalprocessingofpenicillin-bindingprotein3ofEscherichiacoli;NagasawaH,SakagamiY,SuzukiA,SuzukiH,HaraH,HirotaY.JBacteriol.1989Nov;171(11):5890-3以及Cloning,mappingandcharacterizationoftheEscherichiacoliTspgenewhichisinvolvedinC-terminalprocessingofpenicillin-bindingprotein3;HaraH,YamamotoY,HigashitaniA,SuzukiH,NishimuraY.JBacteriol.1991Aug;173(15):4799-813)，但是之后发现Tsp也能够裂解噬菌体尾巴蛋白质并因此重命名为尾巴特异性蛋白酶（Tsp）(Silber等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:295-299(1992))。Silber等人(Deletionoftheprc(tsp)geneprovidesevidenceforadditionaltail-specificproteolyticactivityinEscherichiacoliK-12;Silber,K.R.,Sauer,R.T.;MolGenGenet1994242:237-240)描述了一种prc删除菌株（KS1000），其中突变是由以包含Kan^r标志物的片段取代prc基因的片段而产生的。

Tsp（prc）活性降低对降低目的蛋白质的蛋白质水解是可取的。然而，发现缺少蛋白酶prc的细胞在低渗透压下显示出热敏感生长概况。Hara等人分离了耐热性回复突变株，其含有基因外抑制子（spr）突变（Hara等人，MicrobialDrugResistance,2:63-72(1996)）。Spr为18kDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为Tsp以及外膜中参与细胞分裂中细胞壁水解的肽聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-ProtP0AFV4(SPR_ECOLI)。

已经描述了包含突变的spr基因的改良的蛋白酶缺陷细菌菌株。Chen等人描述了携带prc（Tsp）及另一种蛋白酶DegP中不同突变组合的大肠杆菌菌株的构建，是通过扩增基因上游及下游区域并将其一同连接于包含选择标记物及sprW174R突变的载体上产生的。重组抗体片段在大肠埃希氏菌的细胞周质中的高水平积累需要三重突变（ΔDegPΔprcsprW174R）的宿主菌株（ChenC,SnedecorB,NishiharaJC,JolyJC,McFarlandN,AndersenDC,BattersbyJE,ChampionKM.BiotechnolBioeng.2004Mar5;85(5):463-74)。发现ΔDegP,Δprc和sprW174R突变的组合能够提供最高水平的抗体轻链、抗体重链及F(ab’)2-LZ。EP1341899公开了分别在编码蛋白酶DegP及Prc的染色体DegP及prc上有缺陷的大肠杆菌菌株，其还具有突变的spr基因，该基因编码的蛋白质抑制具有prc突变体的菌株表现出来的生长表型。

本发明提供了新型细菌菌株，其携带的备选的spr突变体，为重组蛋白质的生产提供了有利的方式。

发明概述

在本发明的第一方面，提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的spr基因，所述突变的spr基因编码在选自N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的一个或多个氨基酸处有突变的spr蛋白质，且其中所述细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。

在一个实施方式中，除了突变的spr基因以及使Tsp蛋白质活性相比于野生型细胞有所降低所需的修饰外，细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的（isogenic）。

在第二方面，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性并包含编码spr蛋白质的突变的spr基因，其中除了使Tsp蛋白质活性相比于野生型细胞有所降低所需的修饰以及突变的spr基因外，细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的。

本发明的第一和第二方面提供的细胞显示出优势的生长以及蛋白质生产表型。

在第三方面，本发明提供了用于生产目的蛋白质的方法，包括在如上文限定的重组革兰氏阴性细菌细胞中表达目的蛋白质。

附图简述

图1显示了相比于表达抗-TNFαFab’的野生型W3110和MXE001菌株，表达抗-TNFαFab’的MXE008和MXE009的生长概况。

图2显示了相比于野生型W3110和MXE001，在MXE008和MXE009菌株中抗-TNFαFab’的表达情况。

图3显示了相比于表达抗-TNFαFab’的菌株对照W3110和MXE001，表达抗-TNFαFab’的MXE008和MXE009的生长概况。

图4显示了相比于对照W3110和MXE001，大肠杆菌MXE008和MXE009的细胞周质（阴影标记）以及上清（空心非阴影标记）中抗-TNFαFab’的产量。

图5显示了相比于表达抗-TNFαFab’的野生型菌株W3110和MXE001，表达抗-TNFαFab’的MXE0012和MXE017的生长概况。

图6显示了相比于野生型W3110和MXE001，在MXE0012和MXE017中抗-TNFαFab’的表达情况。

图7显示了在生产抗-TNFαFab’的发酵中W3110、MXE001和MXE008的生长概况。

图8显示了在生产抗-TNFαFab’的发酵中W3110、MXE001(Δtsp)和MXE008(ΔtspsprD112A)的细胞周质抗-TNFαFab’积累(实线及标记)以及培养基抗-TNFαFab’积累（虚线及空心标记）。

图9显示了菌株W3110、MXE001、MXE008和MXE012的dsDNA测定的结果。

图10显示了菌株W3110、MXE001、MXE008和MXE012的蛋白质测定的结果。

图11a显示了野生型ptr（蛋白酶III）和敲除突变的ptr（蛋白酶III）的蛋白质及基因序列的5’末端。

图11b显示了野生型Tsp和敲除突变的Tsp的蛋白质及基因序列的5’末端。

图11c显示了野生型DegP及突变的DegP蛋白质及基因序列的区域。

序列简述

SEQIDNO:1是野生型Tsp基因的DNA序列，包括起始密码子上游的6个核苷酸ATGAAC。

SEQIDNO:2是野生型Tsp蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:3是突变的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密码子上游的6个核苷酸ATGAAT。

SEQIDNO:4是野生型蛋白酶III基因的DNA序列。

SEQIDNO:5是野生型蛋白酶III蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:6是突变的敲除蛋白酶III基因的DNA序列

SEQIDNO:7是野生型DegP基因的DNA序列。

SEQIDNO:8是野生型DegP蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:9是突变的DegP基因的DNA序列。

SEQIDNO:10是突变的DegP蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:11是抗-TNF抗体的轻链可变区的氨基酸序列。

SEQIDNO:12是抗-TNF抗体的重链可变区的氨基酸序列。

SEQIDNO:13是抗-TNF抗体的轻链的氨基酸序列。

SEQIDNO:14是抗-TNF抗体的重链的氨基酸序列。

SEQIDNO:15是用于突变的Tsp基因区域的3’寡核苷酸引物的序列，包含AseI限制性位点。

SEQIDNO:16是用于突变的Tsp基因区域的5’寡核苷酸引物的序列，包含AseI限制性位点。

SEQIDNO:17是用于突变的蛋白酶III基因区域的3’寡核苷酸引物的序列，包含AseI限制性位点。

SEQIDNO:18是用于突变的蛋白酶III基因区域的5’寡核苷酸引物的序列，包含AseI限制性位点。

SEQIDNO:19是用于突变的DegP基因区域的5’寡核苷酸引物的序列，包含AseI限制性位点。

SEQIDNO:20是用于突变的DegP基因区域的3’寡核苷酸引物的序列，包含AseI限制性位点。

SEQIDNO:21是野生型spr基因的序列，包括信号序列，即，前26个氨基酸残基。

SEQIDNO:22是非突变的spr基因序列，不包括信号序列。

SEQIDNO:23是突变的OmpT序列的核苷酸序列，包括D210A和H212A突变。

SEQIDNO:24是突变的OmpT序列的氨基酸序列，包括D210A和H212A突变。

SEQIDNO:25是突变敲除的OmpT序列的核苷酸序列。

SEQIDNO:26显示了hTNF40的CDRH1的氨基酸序列。

SEQIDNO:27显示了hTNF40的CDRH2的氨基酸序列，其为杂合CDR，其中C-端六个氨基酸来自人亚群3种系抗体（humansubgroup3）的H2CDR序列，且由此杂合产生的序列中氨基酸变化由下划线标出，如下：WINTYIGEPIYADSVKG。

SEQIDNO:28显示了hTNF40的CDRH3的氨基酸序列。

SEQIDNO:29显示了hTNF40的CDRL1的氨基酸序列。

SEQIDNO:30显示了hTNF40的CDRL2的氨基酸序列。

SEQIDNO:31显示了hTNF40的CDRL3的氨基酸序列。

SEQIDNO:32显示了hTNF40的CDRH2的氨基酸序列。

SEQIDNO:33显示了OmpA寡核苷酸转接子的序列。

SEQIDNO:34显示了编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列1(IGS1)的寡核苷酸盒。

SEQIDNO:35显示了编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列2(IGS2)的寡核苷酸盒。

SEQIDNO:36显示了编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列3(IGS3)的寡核苷酸盒。

SEQIDNO:37显示了编码用于大肠杆菌Fab表达的基因间序列4(IGS4)的寡核苷酸盒。

本发明优选实施方式详述

本发明人提供了适合于表达目的蛋白质的重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的spr基因，且所述细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。

在本发明的第一个方面，对spr的新突变提供了新型菌株，相比于野生型细菌细胞以及携带突变的Tsp基因的细胞，所述新型菌株具有改善的细胞生长表型。

本发明人已经鉴定出新的spr突变，其能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的生长表型。本发明人出乎意料地发现，相比于野生型细胞或包含突变的Tsp基因的细胞，携带新的突变的spr并具有降低Tsp活性的细胞显示出增加的细胞生长速率且细胞存活时间有所增加。具体地，相比于携带突变的Tsp基因的细胞，携带所述新的spr突变并具有降低的Tsp活性的细胞显示出降低的细胞裂解表型。因此，相比于携带突变的Tsp基因的细胞，新菌株减少了细胞中的蛋白质渗漏并延长了细胞周质中蛋白质的积累。

进一步地，与野生型细菌细胞或包含突变的Tsp基因的细胞相比，携带新的突变的spr并具有降低的Tsp活性的细胞显示出目的蛋白质产量的提高。提高的蛋白质产量可以是细胞周质蛋白质产量和/或上清蛋白质产量。在一个实施方式中，由于细胞渗漏减少，携带突变的Tsp基因的细胞相比，本发明的细胞与显示出提高的细胞周质蛋白质产量。重组细菌细胞能够以更快的速率产生目的蛋白质，因此，相比于野生型细菌细胞或包含突变的Tsp基因的细胞，相同量的目的蛋白质可在更短的时间内产生。目的蛋白质更快的生产速率在细胞生长起始阶段意义尤其显著，例如在诱导蛋白质表达后的前5、10、20或30小时。

根据本发明的细胞优选地在细胞周质和/或培养基中表达的目的蛋白质的最大产量为大约1.0g/L、1.5g/L、1.8g/L、2.0g/L、2.4g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L或4.0g/L。

本发明的第一和第二方面提供的细胞相比于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白酶活性，这可以降低目的蛋白质（尤其是那些对Tsp具有蛋白水解敏感性的目的蛋白质）的蛋白水解。因此，相比于野生型细菌细胞，本发明的第一和第二方面提供的细胞可以提供更高产量的完整蛋白质（优选地为目的蛋白质），并提供较低产量的或优选地不产生蛋白质（优选地为目的蛋白质）的蛋白水解片段。

在本发明的第二方面及本发明第一方面的优选实施方式中，细胞只携带引入一种或多种spr突变所需的基因组最小突变以及相比于野生型细胞降低Tsp蛋白质活性所需的修饰。细菌细胞与野生型细菌细胞基因组的差异只有对spr基因的一种或多种突变以及相比于野生型细胞降低Tsp蛋白质活性所需的修饰。细胞不携带任何其他可以对细胞生长和/或表达目的蛋白质能力有不利作用的突变。因此，相比于包含对基因组序列有进一步遗传工程改造突变的细胞，本发明的一种或多种重组宿主细胞展示了改进的蛋白质表达和/或改进的生长特征。相比于包含对细胞基因组的其他破坏的细胞，本发明提供的细胞还更适合于用于产生治疗性蛋白质。

本发明技术人员可容易地使用本领域熟知的方法（包括发酵方法、ELISA及蛋白质GHPLC），测试候选的细胞克隆以确定其是否具有目的蛋白质的所需要产量。合适的发酵方法描述于HumphreysDP等人(1997)。FormationofdimericFabsinE.coli:effectofhingesizeandisotype,presenceofinterchaindisulphidebond,Fab’expressionlevels,tailpiecesequencesandgrowthconditions.J.IMMUNOL.METH.209:193-202;BacklundE.ReeksD.MarklandK.WeirN.BoweringL.LarssonG.FedbatchdesignforperiplasmicproductretentioninEscherichiacoli,JournalArticle.ResearchSupport,Non-U.S.Gov'tJournalofBiotechnology.135(4):358-65,2008Jul31;ChampionKM.NishiharaJC.JolyJC.ArnottD.SimilarityoftheEscherichiacoliproteomeuponcompletionofdifferentbiopharmaceuticalfermentationprocesses.[JournalArticle]Proteomics.1(9):1133-48,2001Sep;以及HornU.StrittmatterW.KrebberA.KnupferU.KujauM.WenderothR.MullerK.MatzkuS.PluckthunA.RiesenbergD.HighvolumetricyieldsoffunctionaldimericminiantibodiesinEscherichiacoli,usinganoptimizedexpressionvectorandhigh-cell-densityfermentationundernon-limitedgrowthconditions,JournalArticle.ResearchSupport,Non-U.S.Gov'tAppliedMicrobiology&Biotechnology.46(5-6):524-32,1996Dec。本领域技术人员还可容易地使用本领域熟知方法，如蛋白质GHPLC、圆二色谱、NMR,X-光晶体成像及表位亲和力测量方法，测试分泌蛋白质以确定蛋白质是否正确折叠。

现在将以更详细的方式描述本发明。除非另有具体陈述，本文描述的所有实施方式指的是本发明的第一、第二及第三个方面。

除非上下文另有说明，术语“蛋白质”和“多肽”在本文交换使用。“肽”意欲指代10个或更少的氨基酸。

除非上下文另有说明，术语“多核苷酸”包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。

如本文所使用的，术语“包含”在本说明书的上下文中应解释为“包括”。

在本发明的上下文中，非突变的细胞或对照细胞指的是与本发明重组革兰氏阴性细胞相同类型的细胞，其中所述细胞未被修饰为携带上文所述的降低的Tsp蛋白质活性及携带突变的spr基因。例如，非突变的细胞可为野生型细胞，并可与本发明细胞在进行修饰引入任何突变之前衍生自相同的宿主细胞群体。

词句“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”及“菌株”可交换使用。

词句“包含突变的Tsp基因的细胞的表型”在本发明上下文中指的是带有突变的Tsp基因的细胞所表现出的表型。一般地，包含突变的Tsp基因的细胞会裂解，尤其是在高细胞密度下。这些细胞的裂解引起任何重组蛋白质渗漏入上清。携带突变的Tsp基因的细胞还可以显示出在低渗透压下的热敏型生长。例如在高温（如40℃或更高）下，在低渗培养基中，细胞显示不出生长速率或生长速率降低，或者细胞死亡。

术语“同基因的”在本发明的上下文中指的是与所述细胞来源的野生型细胞相比，本发明细胞的基因组除了突变的spr基因以及与野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰以外具有几乎相同或相同的基因组序列。在此实施方式中，所述细胞基因组不包含其他非天然发生的或遗传工程改造的突变。在一个实施方式中，考虑到任何可以发生的天然发生的突变，与野生型细胞相比，根据本发明的细胞除了突变的spr基因以及与野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰以外具有几乎相同的基因组序列。在一个实施方式中，与野生型细胞相比，根据本发明的细胞除了突变的spr基因以及与野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰以外具有完全相同的基因组序列。

术语“野生型”在本发明的上下文中指的是可以在自然中发生或可分离自环境而不携带任何遗传工程改造突变的革兰氏阴性细胞菌株。大肠杆菌野生型菌株的一个实例为W3110，如W3110K-12菌株。

任何合适的革兰氏阴性细菌都可用作生产本发明重组细胞的亲本细胞。合适的革兰氏阴性细菌包括鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）、胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwiniacarotovora）、志贺杆菌（Shigella）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）、嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、鲍氏不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）及大肠杆菌。优选地，亲本细胞为大肠杆菌。大肠杆菌的任何合适菌株可用于本发明，但优选地所使用的为野生型W3110菌株，如K-12W3110。

与先前产生用以表达重组蛋白质的蛋白酶缺陷细菌菌株相关的缺点为其包含参与细胞新陈代谢及DNA复制的基因的其他突变，例如，大肠杆菌菌株中的phoA、fhuA、lac、rec、gal、ara、arg、thi和pro。这些突变可以对宿主细胞具有很多有害作用，包括对细胞生长、稳定性、重组蛋白质表达产量及毒性的作用。具有一种或多种这些基因组突变的菌株，特别是具有大量这些突变的菌株可以显示出丧失健康，这使得细菌生长速率降低到不适合工业化蛋白质生产的水平。进一步地，任何以上基因组突变可以以不可预测的有害方式顺式和/或反式影响其他基因并由此改变菌株表型、健康以及蛋白质概况。进一步地，使用严重突变的细胞一般不适合于生产用于商业化的重组蛋白质，尤其是用于治疗的蛋白质，因为这些菌株一般具有缺陷的代谢途径，因此在基本或化学限定的培养基中生长不良或根本不生长。

根据本发明第二方面的细胞除了突变的spr基因以及与野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰以外与野生型细菌细胞是同基因的。根据本发明第一方面的细胞优选地除了突变的spr基因以及野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰以外与野生型细菌细胞也是同基因的。对细胞的基因组只产生能够引入这些突变的最小突变。这些细胞不携带任何其他可以对细胞生长和/或表达目的蛋白质能力有不利作用的突变。因此，相比于包含对基因组序列有其他遗传工程改造突变的细胞，根据本发明的一种或多种重组宿主细胞展示了改进的蛋白质表达和/或改进的生长特征。相比于包含对细胞基因组的其他破坏的细胞，本发明提供的细胞还更适合于用于产生治疗性蛋白质。

在一个优选的实施方式中，除了突变的spr基因以及与野生型细胞相比降低Tsp蛋白质活性所需的修饰以外，所述细胞与野生型大肠杆菌细胞如菌株W3110是同基因的。

本发明的细胞可由于包含编码目的蛋白质的多核苷酸而与野生型细胞有进一步的差异。编码目的蛋白质的多核苷酸序列可以为外源的或内源的。编码目的蛋白质的多核苷酸可包含在转化入细胞和/或整合入宿主细胞基因组的合适的表达载体内。在编码目的蛋白质的多核苷酸插入宿主基因组的实施方式中，由于插入的编码目的蛋白质的多核苷酸，本发明的细胞与野生型细胞也不同。优选地，多核苷酸是在细胞内表达载体中，因此对宿主细胞基因组造成破坏最小。

spr蛋白质为大肠杆菌的膜结合细胞周质蛋白酶。

spr蛋白质的野生型氨基酸序列显示于具有在N-端的信号序列的SEQIDNO:21及不具有26个氨基酸的信号序列的SEQIDNO:22（根据UniProt登记号P0AFV4)。本发明中spr蛋白质序列的氨基酸编号包括信号序列。因此，spr蛋白质的1号氨基酸为显示于SEQIDNO:21中的第一个氨基酸（Met）。

突变的spr基因优选地为细胞的染色体spr基因。

突变的spr基因编码能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白质。携带突变的Tsp基因的细胞可具有良好的细胞生长速率，但是这些细胞的一个限制在于其易于裂解，尤其在高细胞密度下。因此，包含突变的Tsp基因的细胞的表型为易于裂解，尤其在高的细胞密度下。携带突变的Tsp基因的细胞还显示了在低渗透压下的热敏型生长方式。然而，本发明的细胞所携带的spr突变在引入具有降低的Tsp活性的细胞中时，抑制了降低的Tsp表型，因此，（尤其在高细胞密度下）细胞显示出裂解减少。在摇瓶或高细胞密度发酵技术中，本领域技术人员可容易地测量细胞的生长表型。相比于携带Tsp突变体及野生型spr的细胞，从提高的生长速率和/或重组蛋白质生产（尤其是细胞周质中）上可见携带spr突变体及具有降低的Tsp活性的细胞展示出对细胞裂解表型的抑制。

根据本发明第一个方面及第二方面一个优选的实施方式的细胞包含编码spr蛋白质的突变的spr基因，其在选自N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的一个或多个氨基酸处具有突变，优选地在选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的一个或多个氨基酸处具有突变。在此实施方式中，spr蛋白质优选地不具有任何其他的突变。

对一个或多个以上氨基酸的突变可以是对编码所述氨基酸的一个、两个或三个核苷酸的任何合适的错义突变。突变将氨基酸残基变成任何合适的氨基酸，产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的突变的spr蛋白质。错义突变可将氨基酸变为相比于野生型氨基酸不同大小和/或具有不同化学特性的氨基酸。

在一个实施方式中，突变体spr基因编码的spr蛋白质具有一个或多个选自C94A、S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D或G、H145A、G147C和H157A的突变。

在一个实施方式中，突变是对C94、H145和H157构成的催化单分子中的一个、两个或三个氨基酸残基进行的突变（SolutionNMRStructureoftheNlpC/P60DomainofLipoproteinSprfromEscherichiacoliStructuralEvidenceforaNovelCysteinePeptidaseCatalyticTriad,Biochemistry,2008,47,9715-9717）。

因此，突变的spr基因可包含：

●对C94的突变；或

●对H145的突变；或

●对H157的突变；或

●对C94和H145的突变；或

●对C94和H157的突变；或

●对H145和H157的突变；或

●对C94、H145和H157的突变。

在此实施方式中，SPR蛋白质优选地不具有任何其他突变。

C94、H145和H157中的一个、两个或三个可突变为任何合适的氨基酸，产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白质。例如，C94、H145和H157中的一个、两个或三个可突变为小氨基酸如Gly或Ala。因此，spr蛋白质可具有C94A、H145A和H157A突变中的一个、两个或三个。优选地，spr基因包含错义突变H145A，已经发现其产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白质。

对本文的置换突变体的标记由字母+数字+字母构成。第一个字母标记野生型蛋白质中的氨基酸。数字指的是进行氨基酸置换的位置，第二个字母标记用于置换野生型氨基酸的氨基酸。

在一个优选的实施方式中，突变体spr蛋白质包含在选自N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸处的突变，优选地为选自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一个或多个氨基酸处的突变。在此实施方式中，spr蛋白质优选地不具有任何其他突变。因此，突变的spr基因可包含：

●对N31的突变；或

●对R62的突变；或

●对I70的突变；或

●对Q73的突变；或

●对S95的突变；或

●对V98的突变；或

●对Q99的突变；或

●对R100的突变；或

●对L108的突变；或

●对Y115的突变；或

●对D133的突变；或

●对V135的突变；或

●对L136的突变；或

●对G140的突变；或

●对R144的突变；或

●对G147的突变。

在一个实施方式中，突变体spr蛋白质包含对以下氨基酸的多重突变：

●S95和Y115；或

●N31、Q73、R100和G140；或

●Q73、R100和G140；或

●R100和G140；或

●Q73和G140；或

●Q73和R100；或

●R62、Q99和R144；或

●Q99和R144。

氨基酸N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144和G147中的一个或多个可突变为任何合适的氨基酸，产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白质。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140和R144中的一个或多个可突变为小氨基酸如Gly或Ala。

在一个优选的实施方式中，spr蛋白质包含以下突变中的一个或多个：N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D或V135G、L136P、G140C、R144C和G147C。优选地，SPR蛋白质包含以下突变中的一个或多个：S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D或V135G和G147C。在此实施方式中，spr蛋白质优选地不含有任何其他突变。

在一个实施方式中，spr蛋白质具有选自N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D或V135G、L136P、G140C、R144C和G147C的一个突变。在此实施方式中，spr蛋白质优选地不具有任何其他突变。

在一个进一步的实施方式中，spr蛋白质具有多重突变，选自：

●S95F和Y115F；

●N31Y、Q73R、R100G和G140C;

●Q73R、R100G和G140C；

●R100G和G140C；

●Q73R和G140C；

●Q73R和R100G；

●R62C、Q99P和R144C；或

●Q99P和R144C。

优选地，突变体spr基因编码的spr蛋白质具有选自H145A、H157A和D133A的突变。

在本发明的第二方面，可对spr基因产生任何合适的一种或多种突变以产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白质。优选地，spr蛋白质可具有一个或多个以下突变：N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A和W174R。在一个实施方式中，spr蛋白质不包含突变W174R。优选地，spr基因包含一个或多个上文讨论的与本发明第一个方面相关的突变。

根据本发明的细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。词句“相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性”指的是所述细胞的Tsp活性相比于野生型细胞的Tsp活性有所降低。细胞可以任何合适的方式修饰而降低其Tsp活性。

在一个实施方式中，降低的Tsp活性源于对编码Tsp的内源多核苷酸和/或相关调控表达序列的修饰。所述修饰可降低或终止Tsp基因转录和翻译，或可提供表达的Tsp蛋白质相比于野生型Tsp蛋白质具有降低蛋白酶活性。

在一个实施方式中，相关的调控表达序列受到修饰以降低Tsp表达。例如，Tsp基因的启动子可以突变以阻止此基因的表达。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的细胞携带编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。

优选地，染色体Tsp基因受到突变。

如本文所使用的，“Tsp基因”指的是编码蛋白酶Tsp（也称为Prc）的基因，其为一种细胞周质蛋白酶，能够作用于青霉素结合蛋白质-3（PBP3）及噬菌体尾巴蛋白质。野生型Tsp基因的序列显示于SEQIDNO:1，野生型Tsp蛋白质序列显示于SEQIDNO:2。

除非另有说明，提到突变的Tsp基因或编码Tsp的突变的Tsp基因指的是编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变的Tsp基因或者敲除突变的Tsp基因。

在本发明的上下文中，词句“编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变的Tsp基因”指的是相比于野生型非突变的Tsp基因，突变的Tsp基因不具有完全的蛋白酶活性。

优选地，突变的Tsp基因编码的Tsp蛋白质具有野生型非突变Tsp蛋白质的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低、或者5%或更低的蛋白酶活性。更优选地，突变的Tsp基因编码不具有蛋白酶活性的Tsp蛋白质。在此实施方式中，细胞没有染色体Tsp缺陷，即，Tsp基因序列未经删除或突变以阻止任何形式的Tsp蛋白质表达。

任何合适的突变可引入Tsp基因以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白质。自革兰氏阴性细菌表达的Tsp蛋白质的蛋白酶活性可容易地由本领域技术人员通过任何本领域合适的方法进行测试，如描述于Keiler等人（IdentificationofActiveSiteResiduesoftheTspProtease*THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVol.270,No.48,IssueofDecember1,pp.28864–28868,1995KennethC.Keiler和RobertT.Sauer）的方法，其中测试了Tsp的蛋白酶活性。

Keiler等人（见上文）已经报道Tsp的活性位点包含残基S430、D441和K455，且残基G375、G376、E433和T452对维持Tsp的结构很重要。Keiler等人（见上文）报道其发现突变的Tsp基因S430A、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A和T452A不可检测到蛋白酶活性。进一步报道突变的Tsp基因S430C显示出野生型活性的大约5-10%。因此，产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白质的Tsp突变可包含突变，如对残基S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的一个或多个进行错义突变。优选地，产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白质的Tsp突变可包含突变，如对残基S430,D441和K455中的一个或多个进行错义突变。

因此，突变的Tsp基因可包含：

●对S430的突变;或

●对D441的突变;或

●对K455的突变;或

●对S430和D441的突变;或

●对S430和K455的突变;或

●对D441和K455的突变;或

●对S430、D441和K455的突变。

S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的一个或多个可突变为任何合适的氨基酸，产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白质。合适的突变的实例为S430A、S430C、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A和T452A。突变的Tsp基因可包含对活性位点残基的一个、两个或三个突变，例如基因可包含：

●S430A或S430C；和/或

●D441A；和/或

●K455A或K455H或K455R。

优选地，Tsp基因包含点突变S430A或S430C。

在本发明上下文中，词句“敲除突变的Tsp基因”指的是所述基因包含一种或多种突变，这阻止由野生型基因编码的Tsp基因的表达，提供了的Tsp蛋白质的细胞缺陷。敲除基因可部分或全部地转录，但不翻译为编码的蛋白质。敲除突变的Tsp基因可以任何合适的方式，例如通过删除、插入、点突变、错义、无义及移码突变中一种或多种方式进行突变，使得蛋白质不表达。例如，基因可通过将外源DNA序列如抗生素抗性标记物插入基因编码序列而被敲除。

在一个优选的实施方式中，Tsp基因不是通过将外源DNA序列如抗生素抗性标记物插入基因编码序列而突变的。在此实施方式中，Tsp基因可包含对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游、基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子，由此阻止Tsp蛋白质表达。对起始密码子的突变可为起始密码子核苷酸中一个、两个或所有三个核苷酸的错义突变。备选地或另外地，起始密码子可通过插入或删除移码突变进行突变。Tsp基因在编码序列的5'末端包含两个ATG密码子，其中两个ATG密码子之一或全部可通过错义突变而进行突变。Tsp基因可在第二个ATG密码子（3号密码子）处突变为TCG，如图11b所示。Tsp基因可备选地或另外地包含位于基因起始密码子下游、基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子。优选地，敲除突变的Tsp基因包含对起始密码子的错义突变以及一个或多个插入的终止密码子。在优选的实施方式中，Tsp基因可突变以删除第五个密码子中的“T”而形成移码，在11和16号密码子处产生终止密码子，如图11b所示。在优选的实施方式中，Tsp还可突变为插入AseI限制性位点而在21号密码子处产生第三个框内终止密码子，如图11b所示。

在一个优选的实施方式中，敲除突变的Tsp基因具有SEQIDNO:3的DNA序列，其包括起始密码子上游的6个核苷酸ATGAAT。SEQIDNO:3的敲除突变Tsp序列中所作出的突变显示于图11b。在一个实施方式中，突变的Tsp基因具有SEQIDNO:3的7-2048号核苷酸的DNA序列。

在一个实施方式中，重组革兰氏阴性细菌细胞进一步包含编码DsbC的重组多核苷酸。编码DsbC的重组多核苷酸可存在于转化入细胞和/或整合入宿主细胞基因组的合适的表达载体上。在其中编码DsbC的重组多核苷酸插入宿主基因组的实施方式中，由于插入的编码DsbC的重组多核苷酸，本发明的细胞也与野生型细胞不同。优选地，编码DsbC的重组多核苷酸是在细胞内表达载体中，因此对宿主细胞基因组造成破坏最小。

如本文所使用的，“重组多肽”指的是使用重组DNA技术构建或产生的蛋白质。编码DsbC的多核苷酸序列可与细菌细胞中发现的编码DsbC的内源序列同一。备选地，编码DsbC的重组多核苷酸序列为野生型DsbC序列的突变形式，例如，具有移除的限制性位点，如EcoRI位点，和/或具有编码his标签的序列。

DsbC是一种发现于大肠杆菌细胞周质中的原核蛋白质，其催化大肠杆菌中二硫键的形成。DsbC的氨基酸序列长度为236（包括信号肽），分子量为25.6KDa（UniProtNo.P0AEG6）。DsbC于1994年首次发现（Missiakas等人TheEscherichiacolidsbC(xprA)geneencodesaperiplasmicproteininvolvedindisulfidebondformation,TheEMBOJournalvol13,no8,p2013-2020,1994以及Shevchik等人CharacterizationofDsbC,aperiplasmicproteinofErwiniachrysanthemiandEscherichiacoliwithdisulfideisomeraseactivity,TheEMBOJounralvol13,no8,p2007-2012,1994）。

在本发明一个优选的实施方式中，重组革兰氏阴性细菌细胞进一步包含突变的DegP基因和/或突变的ptr基因和/或突变的OmpT基因，所述突变的DegP基因编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质，其中突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白质或为敲除突变的ptr基因，其中突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或为敲除突变的OmpT基因。

在一个实施方式中，本发明提供重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含：

a)突变的spr基因；

b)编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因；以及

c)编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变的DegP基因，和/或突变的OmpT基因，其中突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或为敲除突变的OmpT基因。

优选地，在此实施方式中，除了以上突变之外，所述细胞基因组与野生型细菌细胞是同基因的。

a.突变的spr基因；

b.编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因；以及

c.突变的ptr基因和/或突变的OmpT基因，其中突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白质或为敲除突变的ptr基因，其中突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或为敲除突变的OmpT基因。

在一个实施方式中，本发明提供细胞，其包含：

a.突变的spr基因；

b.编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因；

c.编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变DegP基因；

d.突变的ptr基因，其中突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白质或为敲除突变的ptr基因；以及

e.任选地，突变的OmpT基因，其中突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或为敲除突变的OmpT基因。

在本发明一个实施方式中，细胞携带突变的DegP基因。如本文所使用的，“DegP”指的是编码DegP蛋白质（也称为HtrA）的基因，其具有作为分子伴侣和蛋白酶的双重功能（Familiesofserinepeptidases；RawlingsND,BarrettAJ.MethodsEnzymol.1994;244:19-61)。非突变的DegP基因的序列显示于SEQIDNO:7，非突变的DegP氨基酸序列显示于SEQIDNO:8。

在低温下，DegP起分子伴侣的作用，在高温下，DegP偏向于起蛋白酶的作用（ATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell,Volume97,Issue3,Pages339–347.SpiessC,BeilA,EhrmannM以及TheproteolyticactivityoftheHtrA(DegP)proteinfromEscherichiacoliatlowtemperatures,Skorko-GlonekJ等人Microbiology2008,154,3649-3658)。

在细胞包含DegP突变的实施方式中，细胞中的DegP突变提供了突变的DegP基因，其编码具有分子伴侣活性但不具有完全蛋白酶活性的DegP蛋白质。

词句“具有分子伴侣活性”在本发明的上下文中指的是与野生型非突变的DegP蛋白质相比，突变的DegP蛋白质具有相同或几乎相同的分子伴侣活性。优选地，突变的DegP基因编码的DegP蛋白质具有野生型非突变的DegP蛋白质的50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高或者95%的分子伴侣活性。更优选地，与野生型DegP相比，突变的DegP基因编码的DegP蛋白质具有相同的分子伴侣活性。

词句“具有降低的蛋白酶活性”在本发明的上下文中指的是与野生型非突变的DegP蛋白质相比，突变的DegP蛋白质不具有完全的蛋白酶活性。优选地，突变的DegP基因编码的DegP蛋白质具有野生型非突变的DegP蛋白质50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。更优选地，突变的DegP基因编码的DegP蛋白质不具有蛋白酶活性。所述细胞不是染色体DegP缺陷的，即，DegP基因序列未经删除或突变以阻止任何形式的DegP蛋白质的表达。

任何合适的突变可引入DegP基因以产生具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的蛋白质。表达自革兰氏阴性细菌的DegP蛋白质的蛋白酶和分子伴侣活性可由本领域技术人员通过任何合适的方法进行测试，如描述于Spiess等人的方法，其中对DegP的蛋白酶和分子伴侣活性的测试在DegP的天然底物MalS上进行（ATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell,Volume97,Issue3,Pages339–347.SpiessC,BeilA,EhrmannM）；以及在TheproteolyticactivityoftheHtrA(DegP)proteinfromEscherichiacoliatlowtemperatures,Skorko-GlonekJ等人Microbiology2008,154,3649-3658中描述的方法。

DegP为丝氨酸蛋白酶，其活性中心由His105、Asp135和Ser210的氨基酸残基组成的催化三分子构成(Familiesofserinepeptidases,MethodsEnzymol.,1994,244:19-61RawlingsNandBarrettA)。产生具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP突变可包含的突变如对His105、Asp135和Ser210中一个、两个或三个的错义突变。

因此，突变的DegP基因可包含：

●对His105的突变；或

●对Asp135的突变；或

●对Ser210的突变；或

●对His105和Asp135的突变；或

●对His105和Ser210的突变；或

●对Asp135和Ser210的突变；或

●对His105、Asp135和Ser210的突变。

His105,Asp135和Ser210中的一个、两个或三个可突变为任何合适的氨基酸，产生具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的蛋白质。例如，His105,Asp135和Ser210中的一个、两个或三个可突变为小氨基酸如Gly或Ala。其他合适的突变是将His105,Asp135和Ser210中的一个、两个或三个变为具有相反特性的氨基酸，如Asp135突变为Lys或Arg，极性的His105突变为非极性氨基酸如Gly、Ala、Val或Leu，而小分子亲水性Ser210突变为大分子或疏水性残基如Val,Leu,Phe或Tyr。优选地，DegP基因包含点突变S210A，如图11c中显示，发现其产生了具有分子伴侣活性但不具有蛋白酶活性的蛋白质（ATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell,Volume97,Issue3,Pages339–347.SpiessC,BeilA,EhrmannM）。

DegP具有两个PDZ结构域，PDZ1(260-358号残基)和PDZ2(359-448号残基)，其调节蛋白质-蛋白质相互作用（ATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell,Volume97,Issue3,Pages339–347.SpiessC,BeilA,EhrmannM）。在本发明的一个实施方式中，将degP基因突变以删除PDZ1结构域和/或PDZ2结构域。PDZ1和PDZ2的删除导致相比于野生型DegP蛋白质，DegP蛋白质的蛋白酶活性完全丧失，且分子伴侣活性降低，而删除PDZ1或PDZ2之一导致相比于野生型DegP蛋白质，具有5%的蛋白酶活性和类似的分子伴侣活性（ATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell,Volume97,Issue3,Pages339–347.SpiessC,BeilA,EhrmannM）。

突变的DegP基因还可包含沉默的非天然发生的限制性位点，如AseI，以助于鉴定和筛选方法，例如，如图11c所示。

SEQIDNO:9中提供了突变的DegP基因的优选序列，其包含点突变S210A及AseI限制性标记物位点，所编码的蛋白质序列显示于SEQIDNO:10。SEQIDNO:9的突变的DegP序列中所作出的突变显示于图11c。

在本发明的实施方式中，其中细胞包含突变的DegP基因，其编码的DegP蛋白质具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性，相对于其中DegP基因突变为敲除DegP而阻止DegP表达（如染色体缺陷DegP）的突变细胞，本发明提供的一种或多种细胞可以提供产自所述细胞正确折叠蛋白质的提高的产量。在包含敲除突变的DegP基因而阻止DegP表达的细胞中，DegP的分子伴侣活性完全丧失，而根据本发明的细胞中，DegP的分子伴侣活性得到保留，同时却丧失了全部的蛋白酶活性。在这些实施方式中，根据本发明的一种或多种细胞具有降低的蛋白酶活性而阻止蛋白质的蛋白水解作用，同时却保留了分子伴侣活性以使蛋白质在宿主细胞中得以正确的折叠和运输。

本领域技术人员能够使用本领域已知方法容易地测试分泌的蛋白质以确定蛋白质是否正确折叠，所述方法如蛋白质GHPLC、圆二色谱、NMR、X-光晶体成像和表位亲和测量方法。

在这些实施方式中，相比于携带突变敲除DegP基因而阻止DegP表达的细胞，根据本发明的一种或多种细胞具有改善的细胞生长。不意欲受到任何理论的约束，由于保持分子伴侣活性的DegP蛋白酶增加细胞处理所有需要分子伴侣活性的蛋白质的能力从而显示出细胞生长改善。因此，相比于携带DegP敲除突变的细胞，在本发明的一种或多种细胞中，产生对细胞的生长和繁殖必需的正确折叠蛋白质有所增加，由此改善调控生长的细胞途径。进一步地，已知的DegP蛋白酶缺陷菌株一般为温度敏感型，一般在超过大约28℃的温度下不生长。然而，根据本发明的细胞是非温度敏感型，可在28℃或更高的温度下生长，包括大约30℃-大约37℃的温度，这些温度一般用于细菌生产蛋白质的工业规模生产。

在本发明一个实施方式中，细胞携带突变的ptr基因。如本文所使用的，“ptr基因”指的是编码蛋白酶III的基因，其为降解高分子量蛋白质的蛋白酶。非突变的ptr基因的序列显示于SEQIDNO:4，非突变蛋白酶III蛋白质的序列显示于SEQIDNO:5。

除非另有说明，提到突变的ptr基因或编码蛋白酶III的突变的ptr基因时，指的是编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III的突变的ptr基因或敲除突变的ptr基因。

词句“编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III的突变的ptr基因”在本发明的上下文中指的是相比于野生型非突变的ptr基因，突变的ptr基因不具有完全的蛋白酶活性。

优选地，突变的ptr基因编码的蛋白酶III具有野生型非突变蛋白酶III蛋白质的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。更优选地，突变的ptr基因编码的蛋白酶III蛋白质不具有蛋白酶活性。在此实施方式中，细胞在染色体ptr上没有缺陷，即ptr基因序列未经删除或突变而阻止任何形式蛋白酶III蛋白质的表达。

任何合适的突变可引入ptr基因以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III。表达自革兰氏阴性细菌的蛋白酶III蛋白质的蛋白酶活性可容易地由本领域技术人员通过任何本领域合适的方法进行测试。

词句“敲除突变的ptr基因”在本发明的上下文中指的是所述基因包含一个或多个突变，由此导致此基因编码的蛋白质不表达，造成细胞中由所述敲除突变的基因编码的蛋白质缺陷。敲除的基因可部分或全部地转录，但不翻译为编码的蛋白质。敲除突变的ptr基因可以以任何合适的方式，例如通过删除、插入、点突变、错义、无义及移码突变中一种或多种方式进行突变，使得蛋白质不表达。例如，基因可通过将外源DNA序列如抗生素抗性标记物插入基因编码序列而被敲除。

在一个优选的实施方式中，基因不是通过将外源DNA序列如抗生素抗性标记物插入基因编码序列而突变的。优选地，蛋白酶III基因包含对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游、基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子，由此阻止蛋白酶III蛋白质的表达。

对靶标敲除基因起始密码子进行突变引起起始密码子功能的丧失，并由此确保靶标基因在编码序列的起始不含有合适的起始密码子。对起始密码子的突变可为起始密码子核苷酸中一个、两个或三个核苷酸的错义突变。备选地或另外地，起始密码子可通过插入或删除移码突变进行突变。

在一个优选的实施方式中，ptr基因突变使得ATG起始密码子变为ATT，如图11a。

敲除突变的ptr基因可备选地或另外地包含位于基因起始密码子下游、基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子。优选地，敲除突变的ptr基因包含对起始密码子的错义突变以及一个或多个插入的终止密码子。

所述一个或多个插入的终止密码子优选地为框内终止密码子。然而，所述一个或多个插入的终止密码子可备选地或另外地为框外密码子。当框外起始密码子通过插入或删除移码突变转变为框内起始密码子时，需要一个或多个框外终止密码子以终止翻译。可通过任何合适的突变引入所述一个或多个终止密码子，所述突变包括无义点突变和移码突变。优选地，可通过移码突变和/或插入突变引入所述一个或多个终止密码子，优选地通过以包含终止密码子的序列置换基因序列的一段而实现。例如，可插入AseI限制性位点，其包含终止密码子TAA。

在一个优选的实施方式中，将ptr基因突变以通过插入AseI限制性位点而插入框内终止密码子，如图11a所示。在一个优选的实施方式中，敲除突变的ptr基因具有SEQIDNO:6的DNA序列。在SEQIDNO:6所示的敲除突变的ptr基因序列中所作出的突变显示于图11a。

上文描述的敲除突变具有优势，因为其对靶标敲除基因位点上游或下游的染色体DNA造成最小的破坏或无破坏，且不需要插入和保留外源DNA，如抗生素抗性标记物，这些可以影响细胞用于表达目的蛋白质，尤其是治疗性蛋白质的合适度。因此，相比于通过将外源DNA插入基因编码序列而敲除蛋白酶基因的细胞，根据本发明的一种或多种细胞可以显示出改善的生长特征和/或蛋白质表达。

在一个实施方式中，根据本发明的细胞携带突变的OmpT基因。如本文所使用的，“OmpT基因”指的是编码蛋白酶OmpT（外膜蛋白酶T）的基因，其为外膜蛋白酶。野生型非突变的OmpT基因的序列为SWISS-PROTP09169。

除非另有说明，提到突变的OmpT基因或编码OmpT的突变的OmpT基因时，指的是编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质的突变的OmpT基因或敲除突变的OmpT基因，

词句“编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质的突变的OmpT基因”在本发明的上下文中指的是相比于野生型非突变的OmpT基因，突变的OmpT基因不具有完全的蛋白酶活性。突变的OmpT基因可以编码的OmpT蛋白质具有野生型非突变OmpT蛋白质的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。突变的OmpT基因可以编码不具有蛋白酶活性的OmpT蛋白质。在此实施方式中，细胞在染色体OmpT上没有缺陷，即OmpT基因序列未经删除或突变而阻止任何形式的OmpT蛋白质的表达。

任何合适的突变可引入OmpT基因以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白质。表达自革兰氏阴性细菌的OmpT蛋白质的蛋白酶活性可容易地由本领域技术人员通过任何本领域合适的方法进行测试，如描述于Kramer等人（IdentificationofessentialacidicresiduesofoutermembraneproteaseOmpTsupportsanovelactivesite,FEBSLetters505(2001)426-430)和Dekker等人(SubstrateSpecitificityoftheIntegralMembraneProteaseOmpTDeterminedbySpatiallyAddressedPeptideLibraries,Biochemistry2001,40,1694-1701）的方法。

Kramer等人（IdentificationofactivesiteserineandhistidineresiduesinEscherichiacolioutermembraneproteaseOmpTFEBSLetters2000468,220-224）已经报道了OmpT，公开了由丙氨酸置换丝氨酸、组氨酸和酸性残基导致活性降低：对于Glu27、Asp97、Asp208或His101活性降低～10倍，对于Ser99活性降低～500倍，对于Asp83、Asp85、Asp210或His212活性降低～10000倍。Vandeputte-Rutten等人（CrystalStructureoftheOuterMembraneProteaseOmpTfromEscherichiacolisuggestsanovelcatalyticsite,TheEMBOJournal2001,Vol20No185033-5039）提出具有活性中心，包含Asp83-Asp85对以及His212-Asp210对。进一步地，Kramer等人（LipopolysaccharideregionsinvolvedintheactivationofEscherichiacolioutermembraneproteaseOmpT,Eur.J.Biochem.FEBS2002,269,1746-1752）公开了L4环中的D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K/K217G、K217T和R218L突变，这些都导致酶活性部分或几乎全部丧失。

因此，产生具有降低的蛋白酶活性的OmpT突变可以包含的突变如对E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中一个或多个残基的错义突变。

E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中一个或多个可突变为任何合适的氨基酸以产生具有降低的蛋白酶活性的蛋白质。例如，E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中的一个或多个可突变为丙氨酸。合适的突变的实例为E27A、D43A、D83A、D85A、D97A、S99A、H101AE111A、E136A、E193A、D206A、D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K、K217G、K217T、R218L和E250A。在一个实施方式中，突变的OmpT基因包含D210A和H212A突变。包含D210A和H212A突变的合适的突变的OmpT序列显示于SEQIDNO:23。

词句“敲除突变的OmpT基因”在本发明的上下文中指的是所述基因包含一种或多种突变由此导致此基因编码的蛋白质不表达，造成细胞中由所述敲除突变基因编码的蛋白质缺陷。敲除的基因可部分或全部地转录，但不翻译为编码的蛋白质。敲除突变的OmpT基因可以任何合适的方式，例如通过删除、插入、点突变、错义、无义及移码突变中一种或多种方式进行突变，使得蛋白质不表达。例如，基因可通过将外源DNA序列如抗生素抗性标记物插入基因编码序列而被敲除。

在一个实施方式中，OmpT基因包含对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游、基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子，由此阻止OmpT蛋白质的表达。对起始密码子的突变可为起始密码子核苷酸中一个、两个或三个核苷酸的错义突变。合适的突变敲除OmpT序列显示于SEQIDNO:24。备选地或另外地，起始密码子可通过插入或删除移码突变进行突变。

在一个实施方式中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不携带有敲除突变的OmpT基因，如染色体ompT缺陷。

在一个实施方式中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不携带有敲除突变的degP基因，如染色体degP缺陷。在一个实施方式中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不携带突变的degP基因。

在一个实施方式中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不携带敲除突变的ptr基因，如染色体ptr缺陷。

包括敲除突变在内的许多遗传工程改造突变涉及使用抗生素抗性标记物，这样能够选择和鉴定成功突变的细胞。然而，如上文讨论的，使用抗生素抗性标记物有大量的不利之处。

本发明的一个其他的实施方式克服了使用抗生素抗性标记物的上述不利之处，其中突变的Tsp基因、突变的spr基因及可选地突变的DegP基因和/或突变的ptr基因和/或突变的OmpT基因突变为包含一个或多个限制性标记物位点。限制性位点通过遗传工程改造而进入基因，其为非天然发生的。限制性标记物位点是有利的，因为其能够使得对包含所需的染色体突变的正确修饰的细胞进行筛选和鉴定。经修饰携带一个或多个所述突变蛋白酶基因的细胞可通过对来自细胞裂解物的基因组DNA进行PCR而进行分析，其中所用的寡核苷酸对设计为扩增包含非天然发生的限制性标记物位点的基因组DNA区域。随后将扩增的DNA与能够在非天然发生限制性标记物位点消化DNA的合适的限制性酶孵育之前和之后通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。用限制性酶孵育后产生的DNA片段证实了细胞已经成功地修饰为携带所述一种或多种突变的基因。

在细胞携带具有SEQIDNO:6的DNA序列的敲除突变的ptr基因的实施方式中，SEQIDNO:17和SEQIDNO:18中所示的寡核苷酸引物序列可用于从转化细胞的基因组DNA中扩增包含非天然发生的AseI限制性位点的DNA。扩增的基因组DNA然后可与AseI限制性酶一同孵育并通过凝胶电泳进行分析以证实基因组DNA中有突变的ptr基因存在。

在细胞包含具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:3的7-2048号核苷酸的DNA序列的敲除突变的Tsp基因的实施方式中，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16中所示的寡核苷酸引物序列可用于从转化细胞的基因组DNA扩增包含非天然发生的AseI限制性位点的DNA区域。扩增的基因组DNA然后可与AseI限制性酶一同孵育并通过凝胶电泳进行分析以证实基因组DNA中有突变的Tsp基因存在。

在细胞包含具有SEQIDNO:9的DNA序列的突变的DegP基因的实施方式中，SEQIDNO:19和SEQIDNO:20中所示的寡核苷酸引物序列可用于从转化细胞的基因组DNA扩增包含非天然发生的AseI限制性位点的DNA区域。扩增的基因组DNA然后可与AseI限制性酶一同孵育并通过凝胶电泳进行分析以证实基因组DNA中有突变的DegP基因存在。

一个或多个限制性位点可通过任何合适的突变而引入，所述突变包括删除、插入、点突变、错义、无义和移码突变中的一种或多种。限制性位点可通过对起始密码子的突变和/或引入一个或多个终止密码子的突变而引入，如上文所描述的。此实施方式是有利的，因为限制性标记物位点是所引入的敲除突变的直接且独特的标记物。

可插入包含框内终止密码子的限制性标记物位点，如AseI限制性位点。这一点尤其有利，因为插入的限制性位点同时起到限制性标记物位点以及终止密码子的作用，以阻止基因编码序列的完全转录。例如，在通过引入AseI位点向ptr基因引入终止密码子的实施方式中，这还制造出限制性位点，如图11a所示。例如在通过引入AseI位点向Tsp基因的21号密码子引入终止密码子的实施方式中，这还制造出一个限制性位点，如图11b所示。

可通过突变起始密码子和任选地一个或多个其他点突变，将限制性标记物位点插入。在此实施方式中，限制性标记物位点优选地为EcoRI限制性位点。这一点有其有利，因为对起始密码子的突变还制造出限制性标记物位点。例如，在一个实施方式中，ptr基因的起始密码子变为ATT，这制造出EcoRI标记物位点，如图11a所示。例如，在一个实施方式中，Tsp基因的起始密码子（3号密码子）由ATG变为TCG，如图1b所示，2号密码子由AAC变为AAT的进一步的点突变以及3号密码子ATG变为TCG的突变产生了EcoRI限制性标记物位点，如图11b所示。

在细胞携带突变的OmpT基因的本发明的实施方式中，所述一个或多个限制性位点可通过任何合适的突变引入，所述突变包括删除、插入、点突变、错义、无义和移码突变中的一种或多种。例如，在OmpT基因包含D210A和H212A突变的实施方式中，这些突变引入沉默的HindIII限制性位点，其可用作选择性标记物。

在DegP基因或spr基因中，标记物限制性位点可使用沉默密码子改变而引入。例如，AseI位点可用作沉默限制性标记物位点，其中TAA终止密码子在框外，如图11c所示的突变的DegP基因。

在本发明的实施方式中，其中ptr基因和/或Tsp基因突变为编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III和/或Tsp，可使用沉默密码子改变引入一个或多个标记物限制性位点。

根据本发明的重组革兰氏阴性细菌细胞可通过任何合适的方式产生。本领域技术人员了解可用于使用突变的基因序列置换染色体基因序列的合适的技术。可采用合适的载体，其能通过同源重组整合入宿主染色体。

合适的基因置换的方法描述于，例如，Hamilton等人（NewMethodforGeneratingDeletionsandGeneReplacementsinEscherichiacoli,HamiltonC.M.等人,JournalofBacteriologySept.1989,Vol.171,No.9p4617-4622）、Skorupski等人(Positiveselectionvectorsforallelicexchange,SkorupskiK和TaylorR.K.,Gene,1996,169,47-52）、Kiel等人（AgeneralmethodfortheconstructionofEscherichiacolimutantsbyhomologousrecombinationandplasmidsegregation,KielJ.A.K.W.等人MolGenGenet1987,207:294-301）、Blomfield等人（AllelicexchangeinEscherichiacoliusingtheBacillussubtilissacBgeneandatemperaturesensitivepSC101replicon,BlomfieldI.C.等人,MolecularMicrobiology1991,5(6),1447-1457）以及Ried等人（AnnptI-sacB-sacRcartridgeforconstructingdirected,unmarkedmutationsinGram-negativebacteriabymarkerexchange-evictionmutagenesis,RiedJ.L.andCollmerA.,Gene57(1987)239-246）。能使同源重组/置换发生的合适质粒为pKO3质粒（Link等人，1997,JournalofBacteriology,179,6228-6237）。

成功突变的菌株可使用本领域熟知的方法进行鉴定，包括菌落PCRDNA测序以及菌落PCR限制性酶切作图。

在其中细胞包含两种或更多种突变的染色体基因的实施方式中，突变的基因可在相同或不同载体上引入革兰氏阴性细菌。

在一个实施方式中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不携带敲除突变的OmpT基因，如染色体ompT缺陷。

根据本发明的细胞可以进一步包含编码目的蛋白质的多核苷酸序列。编码目的蛋白质的多核苷酸序列可以为外源或内源的。编码目的蛋白质的多核苷酸序列可整合入宿主染色体或可非整合的存在于载体中，通常为质粒。

在一个实施方式中，根据本发明的细胞表达目的蛋白质。“目的蛋白质”在本发明的上下文中意欲指代用于表达的多肽，通常为重组多肽。然而，目的蛋白质可以为表达自宿主细胞中内源基因的内源蛋白质。

如本文所使用的，“重组多肽”指的是使用重组DNA技术构建或产生的蛋白质。目的蛋白质可以为表达自外源载体的、与内源蛋白质同一的外源序列或其突变形式（例如，其具有减弱的生物活性）或其片段。备选地，目的蛋白质可为并非宿主细胞正常表达的异源蛋白质。

目的蛋白质可以为任何合适的蛋白质，包括治疗性、预防性或诊断性蛋白质。

在一个实施方式中，目的蛋白质可用于治疗包括炎性疾病及障碍、免疫疾病及障碍、纤维化障碍以及癌症在内的疾病或障碍。

术语“炎性疾病”或“障碍”以及“免疫疾病或障碍”包括类风湿关节炎、牛皮癣关节炎、斯蒂尔病（still'sdisease）、MuckleWells病、牛皮癣、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、SLE(系统性红斑狼疮)、哮喘、过敏性关节炎、特应性皮炎、多发性硬化、脉管炎、I型糖尿病、器官移植以及移植物抗宿主病。

术语“纤维化障碍”包括特发性肺纤维化（IPF）、系统性硬化（或硬皮病）、肾纤维化、糖尿病肾病、IgA肾病、高血压、晚期肾病、腹膜纤维化（持续不卧床腹膜透析）、肝硬化、老年性黄斑退化症（ARMD）、视网膜病、心反应性纤维化、瘢痕、瘢痕瘤（keloid）、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉架搭桥术、关节成形术以及白内障手术。

术语“癌”包括产生自上皮的恶性新生生长，其见于皮肤，或更通常地见于身体器官内膜（lining），例如：乳腺、卵巢、前列腺、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠。癌倾向于浸润进入临近组织并扩散（转移）到远处器官，例如：至骨、肝脏、肺或脑。

所述蛋白质可以为蛋白水解敏感型多肽，即，易于裂解、对裂解易感，或在原生状态或在分泌过程中被一种或多种革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）蛋白酶裂解。在一个实施方式中，目的蛋白质对选自DegP、蛋白酶III和Tsp的蛋白酶具有蛋白水解敏感性。在一个实施方式中，目的蛋白质对蛋白酶Tsp具有蛋白水解敏感性。在一个实施方式中，目的蛋白质对蛋白酶DegP和蛋白酶III具有蛋白水解敏感性。在一个实施方式中，目的蛋白质对蛋白酶DegP和Tsp具有蛋白质水解敏感性。在一个实施方式中，目的蛋白质对蛋白酶Tsp和蛋白酶III具有蛋白质水解敏感性。在一个实施方式中，目的蛋白质对蛋白酶DegP、蛋白酶III和Tsp具有蛋白质水解敏感性。

优选地，蛋白质为真核多肽。

由根据本发明的细胞表达的目的蛋白质可以是例如为免疫原，包含两种异源蛋白质的融合蛋白质或抗体。作为目的蛋白质的抗体包括单克隆、多价、多特异性、人源化、全长人抗体或嵌合抗体。所述抗体可来自任何物种，但其优选地衍生自单克隆抗体、人抗体或人源化片段。抗体可衍生自免疫球蛋白分子的任何种型（例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚型，可获自任何物种包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼(llama)、山羊或人。抗体片段的各个部分可获自超过一种物种，例如，抗体片段可以是嵌合的。在一个实施例中，恒定区来自一个物种而可变区来自另一物种。

抗体可以为具有全长重链和轻链或其片段，例如VH、VL、VHH、Fab、修饰的Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv片段、Fab-Fv的完整的抗体分子,或双重特异性抗体如Fab-dAb，描述于PCT/GB2008/003331。

抗体可特异于任何靶标抗原。抗原可以为细胞相关的蛋白质，如细胞表面蛋白质，其存在于细胞上如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞；或其可为可溶性蛋白质。目的抗原也可为任何医疗相关蛋白质如在疾病或感染中上调的那些蛋白质，例如受体和/或其对应配体。细胞表面蛋白的具体实例包括粘附分子，例如整合素如β1整合素（如VLA-4）、E-选择素、P-选择素或L-选择素、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134(OX40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、CSF1或CSF1-受体、DPCR1、DPCR1、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、nectin-样蛋白2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、胚癌抗原(CEA),人乳脂球蛋白(HMFG1和2)、I型MHC及II型MHC抗原、KDR和VEGF，恰当的时候还包括其受体。

可溶性抗原包括白介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17，如IL17A和/或IL17F，病毒抗原如呼吸道合胞体病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白如IgE，干扰素如α-干扰素、β-干扰素或γ-干扰素，肿瘤坏死因子TNF（之前称为肿瘤坏死因子-α），肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子如G-CSF或GM-CSF，以及血小板衍生生长因子如PDGF-α和PDGF-β，恰当的时候还包括其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒如流感病毒、EBV、HepA、B和C，生化武器试剂，放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛毒液及毒素。

在一个实施方式中，抗体可用于功能性地改变目的抗原的活性。例如，抗体可直接或间接地中和、拮抗或抵消所述抗原的活性。

本发明还提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的Tsp基因、编码突变spr的突变体spr基因，以及编码特异于TNF的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列，其中突变的Tsp基因编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质或为敲除突变的Tsp基因。

在一个优选的实施方式中，由根据本发明的细胞表达的目的蛋白质为抗-TNF抗体，更优选地为抗-TNFFab’，如WO01/094585中所描述的(其内容并入本文作为参考)。

在一个实施方式中，抗体具有针对人TNFα的特异性，其包含的重链中可变结构域包含的CDR具有SEQIDNO:26所示的CDRH1序列，SEQIDNO:27或SEQIDNO:32所示的CDRH2序列或SEQIDNO:28所示的CDRH3序列。

在一个实施方式中，抗体包含的轻链中的可变结构域包含的CDR具有SEQIDNO:29所示的CDRL1序列，SEQIDNO:30所示的CDRL2序列或SEQIDNO:31所示的CDRL3序列。

上文提到的SEQIDNO:26及28-32给出的CDR衍生自小鼠单克隆抗体hTNF40。然而，SEQIDNO:27由杂合CDR构成。所述杂合CDR包括来自小鼠单克隆抗体hTNF40的重链CDR2的部分(SEQIDNO:32)以及来自人3组种系区域V序列的重链CDR2的部分。

在一个实施方式中，抗体包含重链和轻链，其重链中可变结构域包含的CDR具有SEQIDNO:26所示的CDRH1序列，SEQIDNO:27或SEQIDNO:32所示的CDRH2序列，或者SEQIDNO:28所示的CDRH3序列；其轻链中可变结构域包含的CDR具有SEQIDNO:29所示的CDRL1序列，SEQIDNO:30所示的CDRL2序列或者SEQIDNO:31所示的CDRL3序列。

在一个实施方式中，抗体包含SEQIDNO:26所示的CDRH1，SEQIDNO:27或SEQIDNO:32所示的CDRH2，SEQIDNO:28所示的CDRH3，SEQIDNO:29所示的CDRL1，SEQIDNO:30所示的CDRL2以及SEQIDNO:31所示的CDRL3。优选地，抗体包含SEQIDNO:27所示的CDRH2。

抗-TNF抗体优选地为植入CDR的抗体分子。在一个优选的实施方式中，可变结构域包含人受体框架区及非人供体CDR。

优选地，抗体分子具有针对人TNF（之前称为TNFα)的特异性，其中轻链包含SEQIDNO:11的轻链可变区，其中重链包含SEQIDNO:12的重链可变区。

抗-TNF抗体优选地为Fab或Fab’片段.

优选地，具有针对人TNF的特异性的抗体分子是Fab’，并且具有的轻链序列包含或由SEQIDNO:13组成，重链序列包含或由SEQIDNO:14组成。

在表达后，抗体片段可进行进一步加工，例如通过缀合至另外的实体，如效应子分子。

例如，如本文所使用的术语效应子分子包括抗肿瘤试剂、药物、毒素（如细菌或植物来源的酶活性毒素和其片段，例如蓖麻毒素及其片段）、生物学活性蛋白质例如酶、其他的抗体或抗体片段、合成或天然发生的多聚体、核酸及其片段（如DNA、RNA及其片段）、放射性核素（尤其是放射性碘素、放射性同位素）、螯合金属、纳米颗粒、及报告子基团如荧光化合物或可由NMR或ESR光谱检测到的化合物。效应子分子可由任何合适的方法连接于抗体或其片段，例如抗体片段可经过修饰连接于至少一种效应子分子，如WO05/003171或WO05/003170(其内容并入本文作为参考)所描述的。WO05/003171或WO05/003170也描述了合适的效应子分子。

在一个实施方式中，如果有需要，抗体或其片段如Fab是PEG化的，以产生具有所需特性（例如与完全抗体类似）的产物。例如，抗体可以为PEG化的抗-TNF-αFab’，如WO01/094585中所描述的，优选地其在重链C末端的一个半胱氨酸残基上连接有赖氨酰-顺丁烯二酰亚胺-衍生基团，其中赖氨酸残基的两个氨基基团中每个都共价连接有具有大约20,000Da的分子量的甲氧基聚（乙二醇），这样甲氧基聚（乙二醇）残基的总平均分子量为大约40,000Da，更优选地，所述赖氨酰-顺丁烯二酰亚胺-衍生基团为[1-[[[2-[[3-(2,5-二氧-1-吡咯烷基)-1-氧丙基]氨基]乙基]氨基]-羧基]-1,5-戊烷二基]二(亚胺羰基)。

细胞还可包含编码一种或多种其他目的蛋白质的其他多核苷酸序列。

在一个实施方式中，选择一种或多种在野生型中已知与目的重组蛋白质在纯化中共纯化的大肠杆菌宿主蛋白质进行遗传修饰,如描述于Humphreys等人“EngineeringofEscherichiacolitoimprovethepurificationofperiplasmicFab’fragments:changingthepIofthechromosomallyencodedPhoS/PstSprotein”,ProteinExpressionandPurification37(2004)109-118和WO04/035792（其内容并入本文作为参考）。使用这些修饰的宿主蛋白质改善了目的蛋白质（尤其是抗体）的纯化过程，是通过改变所选的大肠杆菌蛋白质的物理特性使之不再与重组抗体共纯化而在大肠杆菌中生产。优选地，受到改变的大肠杆菌蛋白质选自一种或多种磷酸结合蛋白质（PhoS/PstS）、二肽结合蛋白质(DppA)、麦芽糖结合蛋白质（MBP）和硫氧还蛋白质。

在一个实施方式中，污染性宿主蛋白质的物理特性通过向C端或N端添加氨基酸标签得到改变。在一个优选的实施方式中，改变的物理属性为等电点，氨基酸标签为连接于C末端的多天冬氨酸标签。在一个实施方式中，通过添加所示标签得到改变的大肠杆菌蛋白质为二肽结合蛋白质（DppA）、麦芽糖结合蛋白质（MBP）、硫氧还蛋白和磷酸结合蛋白质（PhoS/PstS）。在一个特定实施方式中，大肠杆菌磷酸结合蛋白质（PhoS/PstS）的pI通过向添加C端包含6个天冬氨酸的多天冬氨酸标签（polyD）由7.2减少至5.1。

还优选地是对污染性大肠杆菌蛋白质的特定残基进行修饰以改变其物理特性，不管是单独修饰还是与N或C末端添加标签相结合。这些改变可包括插入或删除以改变蛋白质大小，或氨基酸置换以改变pI或疏水性。在一个实施方式中，这些残基位于蛋白质表面。在一个优选的实施方式中，改变了PhoS蛋白质表面的残基以降低蛋白质的pI。优选地，所提到的残基对于磷酸结合（Bass,US5,304,472）很重要，因此为了维持功能性PhoS蛋白质要尽量避开。优选地，靶向的是那些伸出蛋白质表面很远或在碱性残基大基团之内或附近的赖氨酸残基。在一个实施方式中，PhoS蛋白质具有连接于C末端的六聚多天冬氨酸标签，而分子的相反末端上的表面残基用于置换。优选地，所选的赖氨酸残基置换为谷氨酸或天冬氨酸以形成比将中性残基变为酸性残基更大的pI电势变化。本文对于置换突变体的标记由字母+数字+字母构成。第一个字母标记野生型蛋白质中的氨基酸。数字指的是做出氨基酸置换的氨基酸位置，第二个字母标记用于置换野生型氨基酸的氨基酸。在本发明优选的PhoS突变中，275、107、109、110、262、265、266、309、313号赖氨酸残基(K)以单一或组合突变的形式置换为谷氨酸（E）或谷氨酰胺（Q），另外，318号赖氨酸（K）可以单一或组合突变的形式置换为天冬氨酸（D）。优选地，单一突变为K262E、K265E和K266E。优选地，组合突变为K265/266E和K110/265/266E。更优选地，所有突变都与连接于C端的多天冬氨酸（polyD）标签相组合，优选地还与K318D置换相组合。在一个优选的实施方式中，这些突变导致pI降低至少2个单位。优选地，本发明的突变将PhoS的pI从7.2降低至大约4-大约5.5。在本发明的一个实施方式中，使用突变polyDK318D、polyDK265/266E和polyDK110/265/266E分别将大肠杆菌PhoS蛋白质的pI从7.2降低至大约4.9、大约4.8以及大约4.5。

编码目的蛋白质的多核苷酸可以以与另一种多肽融合的形式表达，另一种多肽优选地为信号序列或其他在成熟多肽的N端有特异性剪切位点的多肽。所选的异源信号序列应当为可由宿主细胞识别并加工的序列。对于不能识别和加工原生或真核多肽信号序列的原核宿主细胞，信号序列由原核信号序列置换。合适的信号序列包括OmpA、PhoA、LamB、PelB、DsbA和DsbC。

构建包含一种或多种上文列出的组分的合适的载体采用了标准的连接技术。对分离的质粒或DNA片段进行剪切、加尾并再次连接为产生所需质粒要求的形式。

在一个实施方式中，本发明采用了表达盒，以携带编码目的蛋白质的多核苷酸，其一般包含编码一种或多种目的蛋白质的一种或多种蛋白质编码序列及一种或多种调控表达序列。所述一种或多种调控表达序列可包含启动子。所述一种或多种调控表达序列还可包含3’非翻译区如终止序列。合适的启动子在下文详细讨论。

在一个实施方式中，根据本发明的细胞包含载体如质粒。载体优选地包含一个或多个如上文所限定的表达盒。

在目的蛋白质为包含重链和轻链的抗体的实施方式中，可以用两种载体转染细胞系，第一种载体编码轻链多肽，第二种载体编码重链多肽。备选地，可使用单一载体，此载体包括编码轻链和重链多肽的序列。

用于本发明的载体可通过将如上文限定的一种或多种表达盒插入合适的载体而产生。备选地，用于指导编码目的蛋白质的多核苷酸序列表达的调控表达序列可包含于载体中，因此，完整地构建载体只需要多核苷酸的编码区域。

可用来将根据本发明的多核苷酸转化入宿主细胞的载体的实例包括：

●质粒，如pBR322或pACYC184和/或

●病毒载体如细菌噬菌体

●转座遗传元件如转座子

有很多可用的表达载体形式。这些载体通常包含DNA复制的质粒起点，由多克隆位点（表达盒）分隔开的抗生素选择性标记物、启动子以和及转录终止子，以及编码核糖体结合位点的DNA序列。

本发明采用的启动子可直接与相关的多核苷酸相连，或备选地可位于恰当的位置，例如位于载体中，使得当相关多核苷酸插入时，相关的启动子可对其起作用。在一个实施方式中，启动子位于其作用的多核苷酸的编码部分之前，例如，相关的启动子在多核苷酸的各个编码部分之前。如本文所使用的，“在……之前”意为启动子位于相对编码多核苷酸部分的5引物端。

启动子可以为宿主细胞内源或外源的。合适的启动子包括Lac、tac、trp、PhoA、Ipp、Arab、Tet和T7。

一种或多种所采用的启动子可以为可诱导启动子。

用于细菌系统的表达单位通常还包含Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其可操作地连接于编码目的多肽的DNA。

在其中的多核苷酸序列包含用于两种或更多目的蛋白质（例如抗体轻链和抗体重链）的两种或更多编码序列的本发明的实施方式中，多核苷酸序列可包含一个或多个内核糖体插入位点(IRES)序列，其使得能够在mRNA的中间起始翻译。IRES序列可位于编码多核苷酸序列之间，以增强mRNA分别翻译而产生多种编码的多肽序列。

表达载体优选地还包含用于产生抗体或其抗原结合片段的双顺反子信息，如WO03/048208或WO2007/039714（其内容并入本文作为参考）中所描述。优选地，上游的顺反子包含编码抗体轻链的DNA，下游顺反子包括编码对应的重链的DNA，双顺反子基因间序列(IGS)优选地包含选自IGS1(SEQIDNO:34)、IGS2(SEQIDNO:35)、IGS3(SEQIDNO:36)和IGS4(SEQIDNO:37)的序列。

终止子可以是宿主细胞内源或外源的。合适的终止子为rrnB。

进一步的合适的转录调控子包括启动子和终止子，蛋白质靶向方法可见于“StrategiesforAchievingHigh-LevelExpressionofGenesinEscherichiacoli”SavvasC.Makrides,MicrobiologicalReviews,Sept1996,p512-538。

抗体分子可分泌自细胞或通过合适的信号序列进入细胞周质。备选地，抗体分子可在细胞的细胞质内积累。优选地，抗体分子进入细胞周质。

只要相关方面能适用于这些实施方式，则本文描述的本发明的实施方式关于所述多核苷酸方面对本发明备选实施方式同等适用，例如载体、表达盒和/或包含其中所采用的组分的宿主细胞。

根据本发明的第三方面，本发明提供了用于生产目的重组蛋白质的方法，包括在如上文本发明的第一或第二方面所描述的革兰氏阴性细菌细胞中表达目的重组蛋白质。

本发明的方法中优选采用的革兰氏阴性细菌细胞及目的蛋白质已在上文详细描述。

当编码目的蛋白质的多核苷酸是外源时，多核苷酸可使用任何本领域已知的合适方式并入宿主细胞。一般地，多核苷酸作为转化入细胞的表达载体的部分而并入。因此，在一方面，根据本发明的细胞包含含有编码目的蛋白质的多核苷酸的表达盒。

多核苷酸序列可使用标准技术转化入细胞，如使用氯化铷、PEG或电穿孔方法。

根据本发明的方法还可采用选择系统以促进对成功转化有编码目的蛋白质的多核苷酸的稳定细胞进行选择。选择系统一般采用编码选择性标记物的多核苷酸共转化。在一个实施方式中，每种转化入细胞的多核苷酸进一步包含编码一种或多种选择性标记物的多核苷酸序列。因此，转化编码目的蛋白质的多核苷酸以及编码标记物的一种或多种多核苷酸可同时发生，然后采用选择系统以选择产生所需的蛋白质的细胞。

能够表达所述一种或多种标记物的细胞能够在特定人工设置的条件下存活/生长/扩增，例如在添加毒素或抗生素条件下，因为其中并入的多肽/基因或选择系统的多肽组分提供了某些特性（例如，抗生素抗性）。不能表达所述一种或多种标记物的那些细胞则不能在这些人工设置的条件下存活/生长/扩增。可根据需要选择更严格或不那么严格的的人工设置条件。

本发明可采用任何合适的选择系统。一般地，选择系统可基于包括在载体中的一种或多种提供对已知抗生素抗性的基因，例如四环素、氯霉素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。选择在相关抗生素存在下生长的细胞，因为其表达提供对抗生素抗性的基因以及所需要的蛋白质。

在一个实施方式中，根据本发明的方法进一步包括将转化细胞在培养基中培养的步骤，由此表达目的蛋白质。

在本发明中可使用可诱导表达系统或组成型启动子以表达目的蛋白质。合适的可诱导表达系统以及组成型启动子在本领域熟知。

可使用任何适合的培养基培养转化的细胞。可为具体的选择系统采用恰当的培养基，例如培养基可以包含抗生素以使只有已经成功转化的细胞能够在培养基中生长。

根据需要，可对获自培养基的细胞进行进一步的筛选和/或纯化。根据需要，此方法可进一步包括一个或多个提取及纯化目的蛋白质的步骤。

可从菌株中回收多肽，包括从细胞质、细胞周质或上清中。

用于纯化蛋白质的具体方法取决于蛋白质类型。合适的方法包括在免疫亲和或离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；疏水相互作用色谱；硅色谱；离子交换树脂色谱如S-SEPHAROSE和DEAE；层析聚焦；硫酸铵沉淀；以及凝胶过滤。

可通过常规抗体纯化步骤，合适地将抗体与培养基和/或细胞质提取物和/或细胞周质提取物分离，例如，通过蛋白质A-琼脂糖凝胶、蛋白质G色谱，蛋白质L色谱，嗜硫的、混合形式的树脂，His-标签，FLAG标签，羟磷灰石色谱，凝胶电泳，透析，亲和色谱，硫酸铵、乙醇或PEG分级/沉淀，离子交换膜，扩张的床吸附色谱(EBA)或模拟移动床色谱。

所述方法还可以包括进一步的步骤，测量目的蛋白质表达的量以及选择具有高表达水平的目的蛋白质的细胞。

此方法还可包括一个或多个其他下游加工步骤，如对目的蛋白质如抗体或抗体片段进行PEG化。

本文所描述的一个或多个方法步骤可在合适的容器如生物反应器中组合进行。

实施例

实施例1－产生细胞菌株MXE001(ΔTsp)

通过如下方法产生MXE001菌株：

将Tsp盒以SalI、NotI限制性片段的形式移至进行了类似的限制性酶切的pKO3质粒内。pKO3质粒使用pSC101的温度敏感型突变体的复制起点（RepA）以及氯霉素标记物以加强和选择染色体整合事件。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对生长于蔗糖上的大肠杆菌是致死的，因此（与氯霉素标记物及pSC101起点一同）用于加强并选择去整合以及质粒消除。此方法理论在之前有所描述(Hamilton等人，1989,JournalofBacteriology,171,4617-4622以及Blomfield等人，1991,MolecularMicrobiology,5,1447-1457)。除了插入的基因之外，pKO3系统将所有选择性标记物从宿主基因组移除。

构建了以下质粒。

pMXE191：包含如SEQIDNO:3所示的敲除突变的Tsp基因，其包含EcoRI和AseI限制性标记物。

然后将质粒转化入电感受态大肠杆菌W3110细胞，其使用MethodsinMolecularBiology,vol.47,Nickoloff，J.A.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ,105(1995)中Miller,E.M.和Nickoloff，J.A.,“Escherichiacolielectrotransformation”的方法进行制备。

第1天将40μl的大肠杆菌细胞与（10pg）1μl的pKO3DNA混合于冰冷的BioRad0.2cm电穿孔小杯，然后以2500V、25μF、200Ω进行电穿孔。立即加入1000μl的2xPY，细胞在培养箱中30℃下、250rpm摇1小时进行复苏。将细胞进行1/10的系列稀释在2xPY中，然后将100μl的等分试样铺于30℃和43℃下预热的、含有20μg/ml氯霉素的2xPY琼脂平板。将平板在30℃和43℃下孵育过夜。

第2天在30℃下生长的菌落数量给出电穿孔效率的估算值，而在43℃下存活生长的菌落代表潜在的整合事件。挑取43℃平板上的单一菌落并重悬于10ml的2xPY中。将100μl的悬液铺于含有5%(w/v)蔗糖并预热到30℃的2xPY琼脂平板上以产生单菌落。将平板在30℃孵育过夜。

第3天此时的菌落代表了潜在的自发去整合及质粒消除的事件。如果去整合和消除事件在生长早期发生，则所述克隆实体的大部分是纯系的（clonal）。挑取单一菌落并将其复制物铺于含有20μg/ml氯霉素或5%(w/v)蔗糖的2xPY琼脂平板。将平板在30℃下孵育过夜。

第4天在蔗糖上生长且在氯霉素中死亡的菌落代表了潜在的染色体置换和质粒消除事件。挑取这些菌落并通过使用突变特异性寡核苷酸的PCR进行筛选。将产生具有正确大小阳性PCR条带的菌落划线至含有5%(w/v)蔗糖的2xPY琼脂平板上并将平板在30℃孵育过夜产生单一菌落。

第5天使用PCR阳性、氯霉素敏感型以及蔗糖抵抗型大肠杆菌的单菌落制作甘油贮备株，制作化学感受态细胞并用作PCR模板用于使用5’和3’两侧的寡核苷酸的PCR反应，以产生PCR产物用于使用Taq聚合酶的直接的DNA测序。

通过对包含非天然发生AseI限制性位点的Tsp基因区域（如图1a、1b、1c所示）使用寡核苷酸引物进行PCR扩增，以测试细胞菌株MXE001以确认基因组DNA是否成功修饰为携带突变的Tsp基因。随后将扩增的DNA区域与限制性酶AseI孵育，然后通过琼脂糖凝胶电泳分析孵育之前和孵育之后DNA所扩增的区域以确认非天然发生的AseI限制性位点是否存在于突变的基因中。此方法按如下步骤进行：

使用PCR及以下寡核苷酸对从MXE001和W3110的大肠杆菌细胞裂解物的制备的基因组DNA进行扩增:

6284Tsp3’5’-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3’(SEQIDNO:15)

6283Tsp5’5’-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3’(SEQIDNO:16)

通过将单克隆细胞在20ul1xPCR缓冲液中于95℃下加热10分钟制备裂解物。使混合物冷却至室温，然后在13,200rpm下离心10分钟。移除上清并贴上“细胞裂解物”的标签。

使用Tsp寡核苷酸对扩增各菌株。

使用标准PCR步骤扩增DNA。

PCR循环。

反应完成时，将25ul移至新离心管用AseI进行消化。向25ul的PCR反应物中加入19ul的H2O、5ul缓冲液3（NEB）、1ul的AseI（NEB），混合，在37℃下孵育2小时。

向余下的PCR反应物中加入5ul上样缓冲液（x6），取出20ul上样于0.8%TAE200ml琼脂糖凝胶（Invitrogen）加溴化乙锭（5ul的10mg/ml储备液）上，并于100伏电泳1小时。最后一个泳道上样10ul的分子量标记物（PerfectDNAmarker0.1-12Kb,Novagen）。

在AseI消化完成时，加入10ul上样缓冲液（x6），取20ul上样于0.8%TAE琼脂糖凝胶（Invitrogen）加溴化乙锭（5ul的10mg/ml储备液）上并于100伏下电泳1小时。最后一个泳道加入了10ul的分子量标记物（PerfectDNAmarker0.1-12Kb,Novagen）。两块胶都使用UV透照仪进行观察。

扩增的基因组片段显示Tsp的正确条带大小，2.8kb。以AseI消化后确认了在Tsp缺陷菌株MXE001中存在有引入的AseI限制性位点，而在W3110对照中没有。

MXE001:使用Tsp引物组扩增的基因组DNA，并将产生的DNA用AseI消化，产生2.2和0.6Kb的条带。

W3110PCR扩增的DNA无法由AseI限制性酶进行消化。

实施例2－产生spr突变体

使用互补测定法产生并选择spr突变。

使用随机诱变多样性PCR试剂盒将spr基因突变，该试剂盒在每1000bp引入1-2个突变。将突变的sprPCRDNA克隆入表达CDP870Fab’及spr突变体的可诱导表达载体[pTTOCDP870]。然后将此连接产物电转化至使用Miller,E.M.和Nickoloff，J.A.,“Escherichiacolielectrotransformation,”在MethodsinMolecularBiology,vol.47,Nickoloff，J.A.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ,105(1995)中的方法制备的大肠杆菌菌株MXE001(ΔTsp)。使用以下的操作流程：将40ul的电感受态MXE001、2.5ul的连接产物（100pg的DNA）加入0.2cm的电穿孔小杯，使用BioRadGenepulserXcell在2500V、25μF、200Ω的条件下进行电转化。电转化后，加入1ml的SOC（Invitrogen）（预热至37℃）并对细胞轻柔摇动，使之在37℃下复苏1小时。

将细胞铺于低渗琼脂糖（5g/L酵母提取物、2.5g/L蛋白胨、15g/L琼脂（皆为Difco）并于40℃孵育。将形成菌落的细胞在43℃下重新铺于HLB以确认MXE001菌株重新获得了在高温低渗条件下生长的能力。从所选的克隆制备质粒DNA并对其测序以鉴定spr突变。

使用此方法分离出与ΔTsp表型互补的spr蛋白质的八个单一突变、一个双突变以及两个多重突变，如下：

1.V98E

2.D133A

3.V135D

4.V135G

5.G147C

6.S95F和Y115F

7.I70T

8.N31T、Q73R、R100G、G140C

9.R62C、Q99P、R144C

10.L108S

11.L136P

实施例3－产生携带spr突变的突变体大肠杆菌细胞菌株

使用实施例2中鉴定的1-5号个体突变以及三个催化三分子突变（C94A,H145A,H157A）和W174R产生新菌株，使用野生型W3110大肠杆菌菌株（基因型：F-LAM-IN（rrnD-rrnE）1rph1（ATCC号27325））产生spr突变菌株或使用来自实施例1的MXE001菌株产生ΔTsp/突变spr组合突变菌株。

以下突变体大肠杆菌细胞菌株是使用基因置换载体系统产生的，使用的是pKO3同源重组/置换质粒（Link等人，1997,JournalofBacteriology,179,6228-6237），如实施例1中用于产生MXE001的方法。

表1.

突变体大肠杆菌细胞菌株	基因型	Spr载体
			MXE001	ΔTsp	-
MXE008	ΔTsp、spr D133A	pMXE339、pK03spr D 133A(-SalI)
			MXE009	ΔTsp、spr H157A	pMXE345、pK03spr H157A(-SalI)
MXE010	spr G147C	pMXE338、pK03spr G147C(-SalI)
			MXE011	spr C94A	pMXE343、pK03spr C94A(-SaII)
MXE012	spr H145A	pMXE344、pK03spr H145A(-SalI)
			MXE013	spr W174R	pMXE346、pK03spr W174R(-SalI)
MXE014	ΔTsp、spr V135D	pMXE340、pK03spr V135D(-SalI)
			MXE015	ΔTsp、spr V98E	pMXE342、pK03spr V98E(-SalI)
MXE016	ΔTsp、spr C94A	pMXE343、pK03spr C94A(-SalI)
			MXE017	ΔTsp、spr H145A	pMXE344、pK03spr H145A(-SalI)
MXE018	ΔTsp、spr V135G	pMXE341、pK03spr V135G(-SalI)

突变体spr整合盒以SalI、NotI限制性片段形式移至进行了类似限制性酶切的pKO3质粒。

所述质粒使用pSC101的温度敏感型突变体的复制起点(RepA)以及氯霉素标记物以加强并选择染色体整合事件。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对生长于蔗糖上的大肠杆菌是致死的，因此（与氯霉素标记物及pSC101起点一同）用于加强和选择去整合以及质粒消除事件。此方法理论在之前有所描述(Hamilton等人，1989,JournalofBacteriology,171,4617-4622andBlomfield等人，1991,MolecularMicrobiology,5,1447-1457)。除了插入的基因之外，pKO3系统将所有选择性标记物从宿主基因组移除。

构建了下文列出的pKO3载体，其包含突变的spr基因，包括spr序列内移除了用于克隆鉴定的SalI限制性位点的沉默突变。

pMXE336、pKO3sprS95F(-SalI)

pMXE337、pKO3sprY115F(-SalI)

pMXE338、pKO3sprG147C(-SalI)

pMXE339、pKO3sprD133A(-SalI)

pMXE340、pKO3sprV135D(-SalI)

pMXE341、pKO3sprV135G(-SalI)

pMXE342、pKO3sprV98E(-SalI)

pMXE343、pKO3sprC94A(-SalI)

pMXE344、pKO3sprH145A(-SalI)

pMXE345、pKO3sprH157A(-SalI)

pMXE346、pKO3sprW174R(-SalI)

然后使用MethodsinMolecularBiology,vol.47,Nickoloff，J.A.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ,105(1995)中Miller,E.M.和Nickoloff，J.A.，“Escherichiacolielectrotransformation”的方法将这些质粒转化入化学感受态大肠杆菌W3110细胞中，或转化入来自实施例1的MXE001菌株以产生ΔTsp/突变spr组合突变菌株，如表1所示。

第1天将40μl的电感受态大肠杆菌细胞或MXE001细胞与（10pg）1μl的pKO3DNA混合于冰冷的BioRad0.2cm电穿孔小杯，然后以2500V、25μF、200Ω进行电穿孔。立即加入1000μl的2xPY，细胞在培养箱中30℃下、250rpm摇1小时进行复苏。将细胞进行1/10的系列稀释在2xPY中，然后将100μl的等分试样铺于30℃和43℃下预热的含有20μg/ml氯霉素的2xPY琼脂平板。将平板在30℃和43℃下孵育过夜。

第2天在30℃下生长的菌落数量给出电穿孔效率的估算值，而在43℃下存活生长的菌落代表潜在的整合事件。挑取43℃平板上的单一菌落并重悬于10ml的2xPY。将100μl的悬液铺于含有5%(w/v)蔗糖并预热到30℃的2xPY琼脂平板上以产生单克隆。将平板在30℃孵育过夜。

第3天此时的菌落代表了潜在的自发去整合及质粒消除的事件。如果去整合和消除事件在生长早期发生，则所述克隆实体的大部分是纯系的。挑取单一菌落并将其复制物铺于含有20μg/ml氯霉素或5%(w/v)蔗糖的2xPY琼脂平板。将平板在30℃下孵育过夜。

第4天在蔗糖上生长且在氯霉素中死亡的菌落代表了潜在的染色体置换和质粒消除事件。挑取这些菌落并以进行PCR筛选且进行限制性消化检测SalI位点的丧失情况。将产生具有正确大小阳性PCR条带并抵抗SalI消化的菌落划线至含有5%（w/v）蔗糖的2xPY琼脂平板上并将平板在30℃孵育过夜产生单一菌落。

第5天使用PCR阳性、氯霉素敏感型以及蔗糖抵抗型大肠杆菌的单菌落制作甘油贮藏株，制作化学感受态细胞并用作PCR模板用于使用5’和3’两侧的寡核苷酸的PCR反应，以产生PCR产物用于使用Taq聚合酶的直接的DNA测序，来验证正确的突变。

实施例4－spr突变体菌株中抗-TNFFab’的表达

用质粒pMXE117(pTTOCDP870IGS2)转化实施例3中提供的spr突变体菌株MXE008、MXE009、MXE012及MXE017以及实施例1中提供的MXE001菌株，该质粒为CDP870Fab’（一种具有如SEQIDNO:13所示的轻链序列及如SEQIDNO:14所示的重链序列的抗-TNFFab’）表达载体，是使用见于Sambrook等人1989,Molecularcloning:alaboratorymanual.CSHLpress,N.Y的常规限制性克隆方法理论构建的。质粒pMXE117（pTTOCDP870或40.4IGS17）包含以下特征：强启动子tac及lac操纵子序列。Fab轻链和重链基因转录为单个双顺反子信息。编码来自大肠杆菌OmpA蛋白质的信号肽（其引导多肽易位进入大肠杆菌细胞周质）的DNA基因与轻链和重链基因序列各自的5'末端融合。使用双重转录终止子rrnBt1t2终止转录。lacIq基因编码组成型表达的LacI抑制子蛋白质。这样，tac启动子的转录一直受到抑制直到加入异乳糖或IPTG而诱导去抑制。所使用的复制起点为p15A，这维持了低的拷贝数量。质粒包含四环素抗性基因以用于抗生素筛选。

使用ChungC.T等人Transformationandstorageofbacterialcellsinthesamesolution.PNAS86:2172-2175(1989)中的方法对菌株进行转化。

实施例5－用摇瓶培养在突变的大肠杆菌菌株中表达抗-TNFα Fab’

在摇瓶实验中测试spr突变体菌株MXE008、MXE009、MXE012和MXE017等菌株以比较其相对于W3110及MXE001的生长和抗-TNFαFab’的表达。

所使用的摇瓶实验操作流程如下进行：

5ml摇瓶实验

挑取单菌落接入5ml含有10ug/ml四环素的LB中并在30℃下以250rpm摇动生长过夜。

用过夜培养物接种至100ml含有四环素的培养基中至0.1OD₆₀₀。(即，对于4的OD，100/4x01=100ml中加入2.5mls）

使用此主培养物为每个所需的时间点设置3x5ml的培养管。取1个参考培养物作为测量OD的样品。

在30℃下以250rpm摇动培养物，起初通过观察检测生长概况，然后取参考培养物样品获得0.5OD₆₀₀的培养物(通常大约2小时)。一旦培养物达到超过0.5OD时，将IPTG加入各培养管至浓度为200uM(0.04M取25ul)。

在所需的时间点例如1小时、2小时、诱导后，取出培养管并置于冰上。

在以13,200rpm离心5分钟后，用200ul的细胞周质提取缓冲液(100mMTris.Cl/10mMEDTApH7.4)重悬细胞沉淀。将细胞周质提取物在30℃下以250rpm摇动过夜。第二天，将提取物在13,200rpm下离心10分钟，弃去上清并保存于-20℃，标记为“细胞周质提取物”。弃去用过的细胞沉淀。

ELISA定量。

在4℃下用PBS中2μgml-1的AB141（兔抗人CH1，UCB）将96孔ELISA平板包被过夜。在以300ul的样品/缀合物缓冲液（PBS、BSA0.2%（w/v）、Tween200.1%（v/v））洗涤3次后，在平板上用100μl的样品/缀合物缓冲液对样品和标准品进行1/2的系列稀释，将平板于室温下以250r.p.m摇动1小时。以300ul的洗涤缓冲液（PBS,Tween200.1%（v/v））洗涤3次后，以样品/缀合物缓冲液进行1/1000的稀释，加入100μl的展示抗体6062（缀合的兔抗人κHRP，TheBindingSite,Birmingham,U.K.）。然后将平板于室温下以250r.p.m摇动1小时。以300ul的洗涤缓冲液洗涤3次后，加入100μl的TMB底物（TMB溶液（Calbiochem）:dH2O的50:50混合物)并使用自动平板读数仪记录A₆₃₀。细胞周质提取物中Fab’的浓度通过与纯化的合适同种型Fab’标准品比较而计算。

图1显示相比于野生型W3110和MXE001，MXE008和MXE009的生长得到改善。

图2显示相比于野生型W3110和MXE001，来自MXE008和MXE009菌株的Fab’的表达得到改善。

图5显示相比于野生型W3110和MXE001，MXE0012和MXE017的生长得到改善。

图6显示相比于野生型W3110和MXE001，MXE0012和MXE017的Fab’的表达得到改善。

实施例6－使用高密度发酵的spr突变的大肠杆菌菌株的生长及突变大肠杆菌菌株中Fab’的表达

以质粒pMXE117转化菌株MXE008,MXE009,MXE001及野生型W3110细胞，在发酵实验中进行测试以比较其生长和抗-TNFαFab’的表达。

生长培养基

发酵生长培养基基于SM6E培养基（描述于Humphreys等人，2002,ProteinExpressionandPurification,26,309-320），添加了3.86g/lNaH₂PO₄.H₂O及112g/l的甘油。

接种。接种培养物生长于相同的培养基，其中补充了10μg/ml的四环素。培养物在30℃下搅拌孵育约22小时。

发酵。用接种培养物接种入发酵罐（总体积2.5升）达到0.3-0.5OD₆₀₀。在生长期将温度维持在30℃，到诱导前降低至25℃。通过不断变化搅拌和气流，使溶解氧浓度控制在超过30%的空气饱和度。通过以15%(v/v)NH₄OH和10%(v/v)浓度的H₂SO₄自动滴定使培养物的pH控制在7.0。通过添加10%(v/v)StruktolJ673溶液(Schill和Seilacher)控制泡沫产生。在发酵不同阶段添加不同的添加物。当生物质浓度达到大约40OD₆₀₀时，添加镁盐及NaH₂PO₄.H₂O。在诱导期之前和之内进一步添加NaH₂PO₄.H₂O以保证磷酸盐过量。当发酵开始存在的甘油耗尽后(大约75OD₆₀₀)，连续进料80%(w/w)的甘油。在发酵中所述相同时间点以170μM进行IPTG进料。IPTG进料的开始被认为是诱导的开始。一般地，发酵以甘油进料速率（范围为0.5-2.5ml/h）进行64-120小时。

生物质浓度和生长速率的测量。生物质浓度是通过测量600nm处培养物的光学密度而确定的。

细胞周质提取。通过离心从培养物样品中收集细胞。保留上清级分（于-20°C）用于进一步分析。细胞沉淀级分以原始培养物体积重悬于提取缓冲液（100mMTris-HCl,10mMEDTA;pH7.4）。在60°C下孵育约16小时后，离心提取物使之澄清，保留上清部分（于-20°C）用于分析。

Fab’定量。细胞周质提取物及培养物上清中的Fab’浓度通过Fab’装联ELISA（其在Humphreys等人，2002,ProteinExpressionandPurification,26,309-320中有所描述）以及使用蛋白质Ghplc进行测定。将分析物(大约为中性pH、30℃，经0.2um过滤）以2ml/min加样于HiTrap蛋白质-GHP1ml柱子(GE-Healthcare或同等产品)，用20mM磷酸、50mMNaClpH7.4洗涤柱子，然后注入50mMGlycine/HClpH2.7洗脱Fab’。通过在Agilent1100或1200HPLC系统上的A280而测量洗脱的Fab’，并通过对照已知浓度的纯化Fab’蛋白质的标准曲线进行定量。

图3显示了MXE008和MXE009相比于对照W3110和MXE001的生长概况，显示对于MXE001，MXE008和MXE009在起初~26小时内其生长概况基本相同，都高于W3110。在~26小时后，MXE001的生长速率由于细胞裂解而下降。然而，spr突变体细胞菌株MXE008和MXE009持续显示出良好的生长速率，在26小时后仍无裂解。

图4显示了相比于对照W3110和MXE001，来自大肠杆菌菌株MXE008和MXE009的细胞周质（阴影标记）以及上清（空心非阴影标记）的总Fab’产量。MXE008和MXE009菌株相比于MXE001和W3110显示了更高的细胞周质Fab’表达。进一步地，MXE001以及MXE008和MXE009相比于MXE001显示了较低的上清Fab’水平，这显示出相比于MXE001，MXE008和MXE009的细胞裂解降低。.

图7显示了在生产Fab’的发酵过程中MXE001和MXE008的生长概况。数据表明在生物质积累过程中，Δtspspr突变体菌株MXE008相对Δtsp菌株MXE001在起始生长速率上有少量增加，而在最后~20小时的发酵中，相对于MXE001菌株，MXE008的存活情况有非常显著的增加。

图8显示了在生产Fab’的发酵过程中W3110、MXE001(Δtsp)和MXE008(ΔtspsprD112A)的细胞周质Fab’积累（实线和实心标记）以及培养基Fab’积累（虚线和空心标记）。数据表明相对于MXE001菌株，MXE008菌株的起始细胞周质Fab’积累有少量增加，这一点在Fab’积累期的后半程变得更突出。对MXE001中的Δtsp突变加上MXE008中的spr突变几乎消解了ΔtspMXE001菌株中观察到的“渗漏”表型。此种改良的表现使得MXE008菌株相对于MXE001菌株有了更高的细胞周质产出，且相对于MXE001菌株，MXE008渗漏入培养基的Fab’积累降低。

实施例7－确定菌株中DNA渗漏情况及总蛋白量

dsDNA测定:

使用Quant-ITPicogreendsDNA测定试剂盒（Invitrogen，Ref:P11496）确定W3110、MXE001、MXE008和MXE012菌株渗漏入上清的双链DNA。将所提供的DNA标准品稀释到1-1000ng/mL的范围，制作标准曲线。将样品稀释于TE缓冲液，以使荧光读数处于此方法的线性范围之内（500-1000倍）。在96-孔板中，将100μL的稀释的样品或标准品与100μL的Picogreen反应剂混合，将平板在室温下避光孵育5分钟。使用485nm激发滤片以及535nm的发射滤片对荧光数进行0.1s的测量。结果示于图9。

蛋白质测定：

使用CoomassiePlusBradford测定试剂盒（Pierce，Ref:23236）测定W3110、MXE001、MXE008和MXE012菌株中总蛋白质的浓度。通过将牛血清白蛋白标准品稀释至25-1000μg/mL的范围制作标准曲线。将样品稀释于水中以使光学密度处于此方法的线性范围（5-10倍）内，将33μL的样品或标准品与1mL考马斯反应剂混合。室温下孵育10分钟后，在分光光度计上读出OD_595nm值，使用考马斯反应剂作为空白对照。总蛋白质的浓度根据标准曲线进行计算。结果显示于图10。

对于优选的实施方式本发明具体地对其进行了显示和描述，但是本领域技术人员应当理解的是可作出形式及细节上的多种变化而不偏离附随的权利要求所限定的本发明的范围。

Claims

1.用于表达目的蛋白质的重组大肠杆菌细胞，其包含突变体spr基因，所述突变体spr基因编码具有以下突变之一的spr蛋白质UniProtKB/Swiss-ProtP0AFV4：H145A；H157A；D133A；且其中细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性，所述Tsp是尾巴特异性蛋白酶。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述突变体spr基因编码的spr蛋白质具有突变S95F和Y115F。

3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述细胞进一步包含一种或多种以下突变的基因：

a.编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变的DegP基因；

b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白质或为敲除突变的ptr基因；以及

c.突变的OmpT基因，其中所述突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或为敲除突变的OmpT基因。

4.根据权利要求1或2的细胞，其中所述细胞包含突变的Tsp基因，其编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质或为敲除突变的Tsp基因。

5.根据权利要求4的细胞，其中除了突变的spr基因以及突变的Tsp基因以外，所述细胞基因组与野生型细菌细胞是同基因的。

6.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞具有敲除突变的Tsp基因，其包含对基因起始密码子的突变和/或一个或多个位于基因起始密码子下游、基因终止密码子上游的终止密码子。

7.根据权利要求6的细胞，其中敲除突变的Tsp基因包含对基因起始密码子的错义突变产生的限制性标记物位点以及可选地包括一个或多个其他点突变。

8.根据权利要求7的细胞，其中敲除突变的Tsp基因包含SEQIDNO:3。

9.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞包含编码目的蛋白质的多核苷酸序列。

10.根据权利要求9的细胞，其中所述目的蛋白质为抗体或其抗原结合片段。

11.根据权利要求10的细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段对TNF具有特异性。

12.用于生产目的蛋白质的方法，包括于培养基中在有效表达目的蛋白质的条件下，培养权利要求1-11中任何一项限定的细胞，以及从所述细胞的细胞周质和/或培养基中回收目的蛋白质。

13.根据权利要求12的方法，其中所述方法进一步包括从细胞中回收目的蛋白质。

14.根据权利要求13的方法，其中目的蛋白质回收自细胞周质和/或培养物上清。

15.根据权利要求12－14中任一项的方法，其中所述目的蛋白质是目的重组蛋白质。