CN102757937A - 一种培养神经元的含酚红无血清培养体系以及酚红新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养神经元的含酚红无血清培养体系，所述的无血清培养体系中的酚红大于21.5微摩尔，小于等于30微摩尔。本发明还提供了酚红在制备预防、治疗海马神经元异常放电性疾病药物中的应用。本发明阐明了培养海马神经元（及其任何类型培养神经元）中，雌激素受体的激活对维持其正常生理功能是必需的；在含酚红无血清培养体系中，酚红的最佳浓度是28微摩尔（μM），而非现有商业提供的无血清培养体系中无规则的15或45微摩尔（μM）。

Description

一种培养神经元的含酚红无血清培养体系以及酚红新用途

技术领域

本发明涉及一种无血清培养体系的技术领域，具体地说，是关于一种培养神经元的含酚红无血清培养体系以及酚红新用途。

背景技术

随着神经生物学的进展以及对神经系统功能及其机制研究的需求，已经由经典的大体（整体）动物的研究，发展到多层次的包括离体组织（脑片）以及细胞（培养神经元）立体研究模式。作为一种相对简单的神经元研究体系，应用体外培养神经元的研究模式已被广泛应用。但是，为了很好的研究神经元的功能特性，体外神经元培养中应尽量保持其功能状态的正常生理特征――接近在整体状态下的生理特征。整体动物电生理研究海马神经元电活动时发现，海马神经元在正常静息状态下其动作电位绝大多数以单个动作电位的形式发放，或有少数的连续两个动作电位的发放。但在正常情况下，未发现其动作电位呈现一种成簇样爆发式发放（bursting），其被认为与神经元的病理状态相关，如癫痫式大发放。因此，在体外培养海马神经元中，应通过完善其培养体系而使培养海马神经元具有自发单个动作电位的发放，而不应存在动作电位的成簇样发放。本发明发现当采用无血清培养方式，使用商业购买的培养基进行体外海马神经元培养过程中，培养神经元中有大量神经元呈现类癫痫样大发放的异常放电状态 － 既成簇样爆发式发放（bursting）。而这种异常动作电位的发放对神经元的功能及其胞内生理环境都会带来异样改变，既非生理状态。本发明进一步发现在含有酚红的无血清培养体系中，培养海马神经元的类癫痫样大发放的异常放电状态显著减少或消失，而此种作用是通过酚红的类雌激素特性，作用于培养神经元的雌激素受体上实现的。体外培养海马神经元对其培养环境中的酸碱度也异常敏感，而酚红作为一种对酸碱度敏感的化合物，离体海马神经元培养体系中作为pH指示剂被广泛的添加，以显示神经元培养环境中的酸碱度变化。酚红与雌激素具有相类似的组织结构，在最近的研究中也已发现酚红具有类雌激素样活性。而雌激素作为一种重要的性激素，不仅对神经元的生长发育具有重要的作用，其对成熟神经元的电活动也有影响，可以改变神经元的兴奋性。神经元的电活动是神经元功能的重要指标，当神经元出现异常放电，是其功能异常的表示。

中国专利文献CN：101245335公开了一种无血清植物蛋白肽通用细胞培养基，所述的培养基含有酚红。中国专利文献CN：101418330公开了适于NSO细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基，所述的培养基含有酚红。但是关于培养神经元的含酚红无血清培养体系目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种培养神经元的含酚红无血清培养体系。

本发明的再一目的是，提供一种酚红新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种培养神经元的含酚红无血清培养体系，所述的无血清培养体系中的酚红大于 21.5微摩尔，小于等于30微摩尔。

所述的神经元为海马神经元。

所述的酚红为28-30微摩尔。

所述的酚红为28微摩尔。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

酚红在制备预防、治疗海马神经元异常放电性疾病药物中的应用。

所述的疾病是癫痫病。

所述的酚红剂量为大于 21.5微摩尔，小于等于30微摩尔。

所述的酚红为28-30微摩尔。

本发明是通过阐明酚红在神经元培养体系中除了其pH改变指示剂的功能外，还具有调节培养神经元动作电位发放功能的作用的特性，通过优化酚红在离体神经元培养体系中的浓度，为离体神经元培养提供最佳的培养环境，从而使培养神经元能维持最佳的生理状态与功能。

 本实验主要涉及酚红的类雌激素样活性作用，其在培养体系中通过模拟雌激素活性作用，从而影响培养海马神经元的功能性电活动，其不同的浓度与培养海马神经元的异常电活动直接相关。

体外培养的海马神经元，其正常状态下可以出现单个的动作电位，但当其出现PDS---也即当神经元膜电位去极化达到10mV以上且持续300ms以上，并有连续5个动作电位的发放，在持续记录10－20min的时间内，有2个以上的PDS的出现，我们认为此培养海马神经元呈现一种异常的癫痫样放电。这种异常放电与正常生理状态不同而与病理状态（如癫痫状态下）类似，因此是一种异常状态，而在离体神经元培养过程中应与避免。

本发明发现，在同样的培养环境下，采用无血清培养模式，当给予无酚红与有酚红的培养基进行海马神经元的培养时，无酚红培养基培养的海马神经元具有异常放电的海马神经元占大多数（>84%），且其非PDS样放电频率也明显增加。考虑到酚红具有类雌激素样活性的作用，而雌激素本身对神经元的电活动具有调节作用，因此，我们认为酚红也可能具有调节培养海马神经元电活动的作用。在随后的实验中，我们给与不同浓度的酚红与海马神经元共培养，然后使用膜片钳电生理技术，记录海马神经元电活动情况。在实验过程中，我们在培养基中分别加入10、30、60、100、200μM的酚红后发现酚红对培养海马神经元的PDS样异常电活动呈现一种剂量相关性的U-形调节作用。在所应用的酚红剂量中，30μM达到了最佳的对神经元异常放电的抑制作用，且神经元放电的频率以及持续时间也较对照商业购买含21.5μM酚红培养基的低。30μM酚红对培养海马神经元异常放电的抑制可以被雌激素受体拮抗剂所抑制说明酚红是通过作用与雌激素受体起作用的。进一步的数理计算得到酚红对神经元异常放电的抑制作用最佳浓度在28μM，比本研究对照购买的商业化培养基所含酚红（21.5μM）要高。因此，本发明首先阐述了酚红在培养基中，其不仅仅是作为一种pH指示剂，且其不同的剂量浓度对神经元的正常动作电位的发放功能具有剂量相关的调节作用；其次，本发明发现商业购买的培养基中所含的酚红浓度并非是维持培养神经元功能的最佳浓度，而28μM的酚红将对培养神经元正常动作电位的维持具有最佳作用。 

本发明优点在于：

1、第一次提出酚红不仅仅是一种细胞培养体系中的pH指示剂，其模拟雌激素样作用可对培养海马神经元异常放电起到抑制作用；

2、由于目前商业出售的含酚红细胞培养基中，由于未考虑酚红的类雌激素作用而并非添加最佳酚红浓度，本发明将通过改变其酚红添加浓度从现有的无规则的（15或45μM）至28μM的酚红，从而在不改变其作为pH指示剂的作用下，使其对维持体外培养海马神经元生理功能至最佳状态。本发明的延伸作用是使酚红添加浓度为28μM的培养基应用至所有的神经元培养体系中，并进一步延伸到所有的细胞培养体系中，因此极具商业价值。

3、本发明对酚红发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域。

4、本发明的酚红安全无毒,药理作用强,预示着很好的药用前景。

5、酚红对海马神经元异常放电的抑制作用是通过雌激素受体产生的。

附图说明

图1 正常含酚红培养基与无酚红培养基对神经元异常放电影响。

图2 酚红对培养海马神经元异常放电剂量依赖性U-shape调节作用，其中图中a为给与不同浓度的酚红与海马神经元共同孵育（10、30、60、100、200μM）14天，记录神经元自发放电情况；图中b为不同浓度的酚红与海马神经元共同孵育，记录神经元自发放电次数；图中c为通过数理模拟曲线统计得出酚红对培养神经元异常放电作用的IC50。

图3 正常酚红与最佳酚红浓度对培养海马神经元异常放电影响。

图4 酚红作用可被雌激素受体拮抗剂阻断。

图5 雌激素对培养海马神经元异常放电剂量依赖性U-shape调节作用。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、实验材料和方法

（一）实验材料和仪器设备

水合氯醛：国药集团，上海

酚红（phenol red）：Sigma，美国

B27 ：Invitrogen，美国

DMEM without phenol red:  Gibco, 美国

Neurobasal with phenol red: Gibco, 美国

Neurobasal without  phenol red: Gibco, 美国

GlutaMax ：Invitrogen ， 美国

ICI 182780 : Sigma，美国

Axopatch 700B 放大器: Axon, 美国

Axon Digidata 1440A 数据采集系统：Axon, 美国

PClamp 10.3 数据采集分析软件： Axon, 美国

（二）海马神经元的培养

取孕17-19的SD大鼠，10%水合氯醛(0.15ml/100g)麻醉母鼠后，V字型剪开腹部，取出胚胎，迅速将取出的大鼠胚胎放入冰冷的解剖液里，并在冰上操作将胚胎海马分离。然后将分离的海马在37℃环境下用胰蛋白酶消化15-20分钟，用含血清的培养基D12F终止酶反应，D12F清洗酶溶液3-4次（1000rpm, 1min,小心吸取上清，勿接触组织块），最后一次清洗时用移液管或1ml移液枪加入10ml左右D12F，并轻轻吹打至悬浮液中无组织块，自然沉降2-3min。小心吸取上清液至另一干净15ml离心管中（注意：管底可剩余部分悬液，以防吸入大块组织），以D12F清洗两遍（1000rpm, 8min），弃去上清，加入2ml D12F培养液重悬，小心吸打，避免伤害细胞。最后进行细胞计数，并根据实验的需求种植相应密度的细胞：细胞用于记录其自发放电活动。次日以及3天后，1/2换液。大约6天后，检查胶质细胞是否铺满玻片，若铺满则用含Ara-C培养基换液，48小时后用NB27换液去除Ara-C。此后，每隔3天1/2换液，每次换液需提前把NB27放进培养箱孵育（约2小时），每次换液同时加入所需浓度的酚红或雌激素。

(三)培养海马神经元经不同浓度酚红共同孵育14天后，膜片钳记录神经元电活动

培养细胞使用Leica公司的倒置相差显微镜，通过肉眼直接在显微镜下对细胞进行显微操作。所有实验均采用Axonpatch 700B膜片钳放大器，Digital 1440A数据采集卡采集数据，记录电极使用Sutter公司的毛坯电极，由P97微电极拉制仪拉制而成，充灌好电极内液后阻抗为2-6MΩ。实验前先选取胞体清亮，折光性好的锥体形健康细胞。在电极入水之前，先给予一定的正压，防止入水后电极尖端被堵，接近选定细胞后撤走正压使电极与细胞形成高阻封接（>1 GΩ），同时给予-70 mV的钳制电压，利于细胞的封接，待高阻封接稳定之后再次给予适当的负压，将细胞吸破，形成全细胞记录状态。记录细胞自发电位时，在电流钳模式下，将细胞膜电位钳制在-70mV左右，连续记录至少10分钟以上为有效记录数据。神经元发生异常电活动被定义为：在10分钟的记录时间内发生至少二个及以上的持续时间在300毫秒（ms）以上的、兴奋性去极化电位（EPSP）达到10mV以上的、且在此去极化电位上至少有5个动作电位发放的电活动（图1）。实验后对记录的神经元中发生异常放电的比例，发生异常放电的神经元中的异常放电的特性（频率、时程等）进行数理分析统计。

二、实验结果

（一）酚红对培养神经元异常自发动作电位的抑制作用

（1）无酚红与含酚红培养基培养海马神经元对神经元自发动作电位的影响

体外培养海马神经元，在相同的培养环境下，分别使用含酚红的培养基与不含酚红的培养基（Neurobasal，Gibco）共同培养，14天培养海马神经元成熟后，分别使用膜片钳电生理检测神经元自发放电情况。研究结果显示：在无酚红的培养模式下，培养的海马神经元有异常放电的比例占大多数，达到所记录神经元的显著的84％16/19），显著高于含酚红商业培养基培养的海马神经元比例21％（5/24）(p<0.01)（见图1）。

（2）酚红对培养海马神经元异常放电呈剂量相关性U-shape 调节作用

我们在研究中发现了酚红对培养海马神经元异常放电具有调节作用，那么，酚红的这种作用与其浓度是否相关，以及如何相关有待研究。在随后的研究中，我们给与不同浓度的酚红与海马神经元共同孵育（10、30、60、100、200μM）14天，记录神经元自发放电。研究结果发现，酚红对于培养海马神经元的异常放电呈现剂量依赖性的U-shape 样调节作用。30μM的酚红浓度为达到最强抑制效率，而10以及60、100、200μM的酚红的抑制效率都低于30μM的酚红（图2）。通过数理模拟曲线统计得出酚红对培养神经元异常放电作用的IC50（0-30μM间）为14μM，EC50（30-200μM间）为45μΜ，而其计算获得的最佳抑制浓度为28μM。

（3）商业购买培养基所含酚红与无酚红培养基添加30μM酚红的比较

在本研究中商业购买的培养基（Neurobasal，Gibco），其所含酚红浓度为21.5μM。我们认为其所包含的酚红只是作为一种pH指示剂添加，而忽略了其对培养细胞功能性上的作用。而本发明的研究发现，酚红对于培养海马神经元的异常放电具有剂量依赖性的调节作用，因此，商业化培养基在添加酚红是未考虑该因素。那么其所添加的酚红浓度未必是合适的，因此，其培养基中所包含的酚红浓度可能需要调整。我们比较了21.5μM与30μM浓度的作用结果，研究发现，30μM的酚红浓度更加适合维持体外培养海马神经元正常生理功能：不仅30μM的酚红培养海马神经元异常放电比例较21.5μM酚红培养的神经元要低（P<0.01）；且统计发现其仍有异常放电的神经元中，30μM培养环境下异常放电神经元（n＝2），其异常放电频率（0.008Hz）以及异常放电持续时间（0.067±0.227s）较21.5M培养环境下（n=5）的异常放电频率(0.031±0.008Hz)及持续时间(1.242±0.353s)要显著降低（图3）。

（二）机制研究：

（1）雌激素受体拮抗剂ICI 182780阻断酚红对培养神经元异常放电的抑制作用

   为了进一步明确酚红对培养神经元异常放电的抑制作用机制是否是通过其类雌激素样作用产生的，我们将30μM的酚红与非特异性雌激素受体拮抗剂ICI 182780(100nM)共同孵育，发现其对培养海马神经元异常放电的抑制作用被阻断。30μM的酚红培养条件下，神经元异常放电比例为10％（2/21），而与拮抗剂共同孵育后，其神经元异常放电比例为80％(12/15) (P<0.001)（见图4）。因此我们认为酚红这种对培养海马神经元异常放电的抑制作用是通过雌激素受体产生的。

（2）雌激素对培养海马神经元异常放电呈剂量依赖性U-shape 调节作用

 我们的进一步机制研究发现雌激素对培养海马神经元异常放电也具有调节作用。在不同浓度的17β-雌二醇雌激素（0.1, 0.3，1ng/ml）与海马神经元共同孵育14天后，记录神经元自发放电。研究结果发现，雌激素对培养海马神经元的异常放电也具有剂量依赖性的U-shape 样调节作用（见图5），与酚红作用相一致，进一步说明酚红是与雌激素的作用相同。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种培养神经元的含酚红无血清培养体系，其特征在于，所述的无血清培养体系中的酚红大于 21.5微摩尔，小于等于30微摩尔。

2.根据权利要求1所述的含酚红无血清培养体系，其特征在于，所述的神经元为海马神经元。

3.根据权利要求1所述的含酚红无血清培养体系，其特征在于，所述的酚红为28-30微摩尔。

4.根据权利要求3所述的含酚红无血清培养体系，其特征在于，所述的酚红为28微摩尔。

5.酚红在制备预防、治疗海马神经元异常放电性疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疾病是癫痫病。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的酚红剂量为大于 21.5微摩尔，小于等于30微摩尔。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的酚红为28-30微摩尔。

Images