CN102747143B - 获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用，属于生物种质分析领域。该获得叶用莴苣的聚类分析图的引物组合，包括(1)E39/M58(2)E40/M55(3)E41/M56(4)E50/M78(5)E75/M65(7)E75/M66(8)E75/M64(9)E76/M64(10)E78/M65(11)E75/M63中的任一组。基于PCR技术的分子标记法AFLP，应用所述专用引物获得的叶用莴苣聚类分析图谱也属于本发明的保护范围。本发明获得的叶用莴苣聚类分析图谱多态性高、可靠稳定性强，将在叶用莴苣亲缘关系鉴定，不同品种杂交，以及不同地域间品种引种等领域中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用。
背景技术
目前，我国国家蔬菜种质资源库收集和保存叶用莴苣种质资源200余份，但目前生产上使用的栽培品种多数引自国外。叶用莴苣是一种低投入、高收益、营养价值丰富的速生蔬菜，近年来栽培面积迅速扩大，逐渐成为人们食用的首选绿叶蔬菜之一。但是，我国叶用莴苣的栽培品种主要靠引进国外已有品种，具有自主知识产权的品种和类型很有限，并且在品种资源搜集、鉴定上几乎是空白。因此，需要多角度、多方法开展种质资源的创新工作，开发出品质优良的叶用莴苣新品种，来满足当前生产的需要。种质资源是蔬菜遗传育种和品种改良的基本材料，种质资源的鉴定和筛选是培育和改良优异品种的一项基础工作。由于不同地区之间频繁引种，使得品种名称十分混乱，同物异名和同名异物的现象非常普遍。所以，鉴定叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系中的有效性，能为叶用莴苣种质资源的收集、保存、利用提供理论依据。
现阶段，对于蔬菜的种质资源鉴定，大多用的基于PCR技术的DNA标记技术，可综合为三大类：
一是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP（Restriction Fragment LengthPolymorphism）及VNTR（Variable number tandem repeat）；
二是以PCR为基础的标记技术，如RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions）、STS（Sequence TaggedSite）、SSR（Simple Sequence Repeat）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）、DAF（DNA Amplified Fingerprinting）及ERPAR（Ex-tended Random Primer AmplifiedRegions）等；
三是酶切和PCR相结合的标记技术，主要有AFLP（Amplified ragment LengthPolymorphism）和CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）。此外，还有一类新近发展起来的基于单个核苷酸多态性的DNA标记，即SNP（Simple NucleotidePolymorphism）。随着逆转座子研究，一项基于反转录转座子的植物分子标记技术-RTN技术得到了很大的发展，主要有SSAP（Sequence-l Variation Polymorphism）、RIAP（Inverse Retrotransposon Amplified Polymorphism）、RBIP（Retrotransposonbased Insertion Polymorphism）等5种。选择何种方法对叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系进行鉴定是急需解决的问题。
发明内容
本发明实施方式提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用，可以解决目前不能对叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系进行有效鉴定的问题。
解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明实施方式提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的引物组合，其为以下引物组合中的任一组：
E39/M58、E40/M55、E41/M56、E50/M78、E75/M65、E75/M66、E75/M64、E76/M64、E78/M65或E75/M63。
本发明实施方式还提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法，该方法包括：
以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用上述的引物进行PCR扩增得到扩增产物；
将上述步骤得到的所述扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染显色法显示DNA条带；
选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图。
本发明实施方式进一步提供一种上述的引物组合在获得叶用莴苣的聚类分析图中的应用。
本发明实施方式又提供一种叶用莴苣的聚类分析图，利用上述的方法获得。
从上述提供的技术方案中可以看出，本发明实施方式中，利用确定的引物组合，可以通过AFLP的方法，获得叶用莴苣的聚类分析图，多态性高、稳定性强、可重复性好、样品适应性广，将在叶用莴苣亲缘关系鉴定，不同品种杂交，以及不同地域间品种引种等领域中发挥重要作用，能为叶用莴苣种质资源的收集、保存、利用提供理论依据，可以有效鉴定叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
本发明实施例提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的引物组合，其为以下引物组合中的任一组：
(1)E39/M58
(2)E40/M55
(3)E41/M56
(4)E50/M78
(5)E75/M65
(7)E75/M66
(8)E75/M64
(9)E76/M64
(10)E78/M65
(11)E75/M63。
实施例2
本实施例还提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法，该方法包括：
以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用上述权利要求1所述的引物进行PCR扩增得到扩增产物；
将上述步骤得到的所述扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染显色法显示DNA条带；
选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图。
上述方法的选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图步骤，具体可通过以下方式实现：
（1）根据扩增带的强弱及清晰度确定遗传变异的带，淘汰假象带；
（2）在电泳图谱中进行比较，确定单态带和多态带；
（3）选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“1”和“0”分别记录条带的有无，在同一迁移距离上有带赋值为“1”，无带赋值为“0”；将整个分子标记图转化为0/1矩阵输入POPGENE1.32软件进行分析；计算个体间的Nei相似系数（Nei&Li，1979），其公式为Sc=2Nab/(Na+Nb+Nab)，其中，Na表示样品A特有的带数；Nb表示样品B特有的带数；Nab表示样品A和样品B共有的带数。用NTSYSpc2.10软件进行UPGMA聚类分析，生成聚类分析图。
本实施例提供一种上述引物组合在获得叶用莴苣的聚类分析图中的应用。
下面结合具体获取过程对上述方法作进一步说明：
本实施例利用上述引物组合通过AFLP分子标记方式对叶用莴苣的73个品种进行聚类分析获得聚类分析图的方法，具体操作流程为：制备模板DNA→利用引物组合进行DNA扩增→电泳→银染显色→统计分析结果。具体方法和过程如下：
（1）使用改良的CTAB法提取的叶用莴苣基因组DNA，提取的基因组DNA经核酸蛋白测定仪（Eppendorf Biophotometer）测定OD260/OD280值在1.7～1.9范围内；将DNA提取液稀释成100ng/μl，取3μl DNA样品加入1μl上样缓冲液（loading buffer）稀释液，在1%的琼脂糖凝胶上检测，稳压4V/cm，电泳45分钟；电泳结果显示，DNA主带清晰，无降解现象，RNA去除干净，可以作为模板DNA；
（2）AFLP引物的设计和筛选
在AFLP分子标记方式操作中，不同引物组合对某一特定基因组的扩增效率是不同的，引物扩增效率的高低由它产生的多态性条带数决定。本实验对34对引物组合进行分别进行扩增，从中筛选出了11对谱带分布均匀，条带丰富，多态性较高且谱带质量较好的引物组合，可用于提供样品种质资源遗传多样性研究，这十一对引物如下：
引物组合1：E39/M58:；GACTGCGTACCAATTC ATG/GATGAGTCCTGAGTAA CGT
引物组合2:E40/M55;GACTGCGTACCAATTC AGC/GATGAGTCCTGAGTAA CGA
引物组合3:E41/M56;GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGC
引物组合4:E41/M57;GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGG
引物组合5:E50/M78;GACTGCGTACCAATTC CAT/GATGAGTCCTGAGTAA GTT
引物组合6:E75/M65;GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAG
引物组合7:E75/M63;GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAA
引物组合8:E75/M66;GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA CGA
引物组合9:E75/M64;GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAC
引物组合10:E76/M64;GACTGCGTACCAATTC GTC/GATGAGTCCTGAGTAA GAC
引物组合11：E78/M65;GACTGCGTACCAATTC GTT/GATGAGTCCTGAGTAA GAG
（3）利用上述（2）的任一组引物组合对DNA进行扩增
首先按如下PCR扩增程序进行预扩增：94℃预变性3分钟→（94℃变性30秒→50℃复性30秒→72℃延伸1分钟）扩增30个循环→72℃延伸10分钟→4℃。然后，取5μL稀释后的预扩增产物，加入表3-4的混合体系中，最后补ddH2O至20μL，按如下PCR扩增程序进行选择性扩增：95℃预变性5分钟→（95℃变性35秒→65℃复性35秒（每循环降低0.7℃）→72℃延伸1分钟）2个循环→（94℃变性30秒→56℃复性30秒→72℃延伸1分钟）23个循环→72℃延伸10分钟→4℃。表1为AFLP扩增统计结果：
表1为AFLP扩增统计结果
从上述表1可以看出，在多态性方面，引物对E41/M56、E75/M65、E41/M57的多态性最高，均达到100.00%（见表1），其他引物组合的多态性也比较高。引物多态性条带最多的引物组合是E39/M58，有85条多态性条带，最少的是E76/M64，只有33条。在反映多样性指标的Shannon信息指数方面，不同引物组合之间存在一定的差异。11组AFLP引物组合Shannon信息（即译为香农-威纳指数）指数平均值为0.2740，其中引物组合E41/M57的Shannon信息值最大，为0.3228，最小的是引物组合E76/M64，为0.2326。
（4）获取叶用莴苣的聚类分析图
根据扩增带的强弱，以及清晰度确定遗传变异的带，淘汰假象带。在电泳图谱中进行比较，确定单态带和多态带。选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“1”和“0”分别记录条带的有无，在同一迁移距离上有带赋值“1”，无带赋值“0”。将整个分子标记图转化为0/1矩阵输入POPGENE1.32软件进行分析；计算个体间的Nei相似系数（Nei&Li，1979），其公式为Sc=2Nab/(Na+Nb+Nab)，其中，Na表示样品A特有的带数；Nb表示样品B特有的带数；Nab表示样品A和样品B共有的带数。用NTSYSpc2.10软件进行UPGMA聚类分析，生成聚类分析图。
实施例3
本实施例为对叶用莴苣的聚类分析图的分析与应用的说明，具体如下：
根据11对引物的扩增结果，用NTsys-pc2.10e软件进行处理，采用UpGMA法进行聚类分析图。
当相似系数为0.460时，73份叶用莴苣供试品种聚为一大组群，当相似系数为0.590时，73份材料可以明显的分为两个组群，一个组群包含了4份材料（记作A），另一组群包含了69份材料（记作B）。
当相似性系数为0.832时A组群被分为三个亚组。说明它们的群体内相似度很高。分在一S22和W72两个散叶莴苣分到一个小组，J40、W63两个接球莴苣各单独为一，J40为秋日，是紫色心，绿色外叶品种，。
当相关系数为0.660时，B组群中被分为两个亚组，第一个亚组只有J13(记作a)；另一个亚组包括68份材料(记作b)。
当相关系数为0.951时，b组群被分为9个亚组。亚组Ⅰ包含11份材料，全部是散叶莴苣，其中有S3、S12、S65三个品种为紫叶莴苣，大部分来自福建、浙江；亚组Ⅱ只有J5品种，来自云南的结球莴苣；亚组Ⅲ包含了9份材料，全部是散叶莴苣，除了S11外，其余都是紫叶莴苣，大部分品种来自北京、河北。亚组Ⅳ包含8份材料，在相关系数为0.955时，分为两个小组群，一个组群包含3份散叶莴苣，另一组群包括5份结球莴苣，大部分品种引自英国、美国；亚组Ⅴ包括3份材料，分别是S1、S61、S62，都是紫色散叶莴苣，都来自国内；亚组Ⅵ包括3份材料，分别是S50、S53、W55，均为散叶莴苣，S50和W55聚为一类，与紫叶莴苣S53分离；亚组Ⅶ只有W47品种，为绿叶结球莴苣，引自美国；亚组Ⅷ包括32份材料，在相关系数为0.958时，又可分为三个小组群，第一组群包括5份材料，均为散叶莴苣，W56遗传距离最远，S8和W52相似系数高达0.993，说明两者有极为相似的遗传背景，可以证明两者为同一品种；第二组群只有W20，为绿叶结球莴苣，引自美国；第三小组包括26份材料，均为绿叶结球莴苣，大多数材料的相似系数范围在0.965-0.993之间，说明亲缘关系很近，并且很难在他们之间划分出明显的类群，其中，J43和W78遗传相似系数为1，说明两者遗传背景完全相同，为同一品种，W49和W57、J45和W60、W33和W53、J20和J21四对品种的相似系数都高达0.993，说明各对的遗传背景极为相似，可以证明各对都是同一品种。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (3)
1.一种获得叶用莴苣的聚类分析图的引物组合，包括以下11组引物：
引物组合1：E39/M58；GACTGCGTACCAATTC ATG/GATGAGTCCTGAGTAA CGT：
引物组合2:E40/M55；GACTGCGTACCAATTC AGC/GATGAGTCCTGAGTAA CGA：
引物组合3:E41/M56；GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGC：
引物组合4:E41/M57；GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGG：
引物组合5:E50/M78；GACTGCGTACCAATTC CAT/GATGAGTCCTGAGTAA GTT：
引物组合6:E75/M65；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAG：
引物组合7:E75/M63；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAA：
引物组合8:E75/M66；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA CGA：
引物组合9:E75/M64；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAC：
引物组合10:E76/M64；GACTGCGTACCAATTC GTC/GATGAGTCCTGAGTAA GAC：
引物组合11：E78/M65；GACTGCGTACCAATTC GTT/GATGAGTCCTGAGTAA GAG。
2.一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法，该方法包括：
以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用上述权利要求1所述的引物进行PCR扩增得到扩增产物；
将上述步骤得到的所述扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染显色法显示DNA条带；
选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图。
3.一种权利要求1所述的引物组合在获得叶用莴苣的聚类分析图中的应用。
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