CN102746377B - 一种结核杆菌蛋白抗原的表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结核杆菌蛋白抗原的表位肽及其应用。本发明提供的多肽，是具有如下氨基酸残基序列之一的多肽：(a)由序列表中序列5；(b)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由(a)衍生的多肽。本发明的实验证明，本发明发现的结核抗原表位TP1，可能的γδT细胞识别的结核表位，为开发新型结核疫苗或佐剂成分提供新的思路。

Description

一种结核杆菌蛋白抗原的表位肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核杆菌蛋白抗原的表位肽及其应用。

背景技术

γδT细胞由于在抗结核免疫中发挥重要的作用引起越来越多的关注，磷酸抗原被认为是γδT细胞识别的主要抗原，但磷酸抗原活化的γδT细胞缺乏对结核杆菌有效的免疫保护。相比而言，结核杆菌的蛋白抗原有着更有效的免疫保护作用。一直以来，研究者采取不同的方法获取γδT细胞识别的结核杆菌的蛋白抗原，早期的方法是通过不同的方式处理结核杆菌，通过质谱分析活化γδT细胞的蛋白成分，粗略地鉴定出活化γδT细胞的结核蛋白抗原成分集中在10-14KD的范围内。但应用此种方法并没有得到特定的结核抗原成分。Alderson的课题组以结核病人的抗血清和结核杆菌反应性的CD4⁺T淋巴细胞为探针，通过筛选结核杆菌的基因表达文库中发现了与之发生特异性结合的抗原表位，为获得有效的结核亚单位疫苗奠定了基础。但到目前为止，以γδT淋巴细胞为探针钓取抗原表位的研究未见报道。

由于分离得到的结核病人外周血γδT细胞在体外存活时间较短，如果没有其他细胞因子和抗γδTCR抗体的刺激作用仅能存活2周左右，不能满足筛选文库的需要，因此如能够在体外建立结核特异性γδT细胞系，作为钓取抗原表位的探针，将能够满足筛选γδT细胞识别的结核杆菌抗原表位的需要。缺陷型T淋巴瘤细胞系J.RT3-T3.5细胞恰恰能够满足这种需要，此种细胞系不表达有功能的TCR，但可接受外源的TCR链，形成有功能的均一化的γδTCR转染细胞系。此种细胞系在外源抗原的刺激下，活化表达IL-2。

因此，根据转染细胞系IL-2的分泌情况，可以  判断γδT细胞对相应抗原的识别及在γδTCR识别抗原的过程中，关键的识别位点(Xi XY，et al.2009.J.Bio.Chem.284：27449-27455.Xi XY，et al.2010.International Immunology 22：299-306.)。但以γδTCR转染细胞系为探针，筛选文库的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种多肽及其应用，可以用来作为结核杆菌蛋白抗原的候选表位肽。

本发明提供的多肽，是具有如下氨基酸残基序列之一的多肽：

(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由(a)衍生的多肽。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码所述多肽的基因也是本发明保护的范围。

所述基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1)序列表中序列6所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的多肽的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能的多肽的DNA分子。

含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

所述多肽或所述基因或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备促进γδT细胞分泌IL-2的促进剂中的应用也是本发明保护的范围。

所述多肽在制备促进γδT细胞的增值的促进剂中的应用也是本发明保护的范围。

所述多肽在制备结核杆菌疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

所述多肽在制备抗结核杆菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

所述产品为药物。

本发明的实验证明，本发明建立了一种筛选γδT细胞识别的结核蛋白抗原的新策略，以体外建立结核反应性γδTCR转染细胞系为探针在噬菌体随机文库中钓取γδTCR识别的结核抗原表位，功能验证的结果显示表位TP1是可能的γδT细胞识别的结核表位，为开发新型结核疫苗或佐剂成分提供新的思路。

附图说明

图1为构建结核特异性和非特异性γδTCR转染细胞

图2为以转染细胞为探针，筛选噬菌体十二肽库的操作流程

图3为优势表位肽TP1与结核特异性γδTCR转染细胞的结合能力鉴定

图4为优势表位肽TP1与结核病人外周血中γδT细胞的结合能力鉴定

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中实验均重复三次，结果取平均值。

实施例1、γδT细胞识别的结核杆菌的抗原表位的获得

1、构建结核特异性和非特异性γδTCR转染细胞系

取结核病人肝素抗凝新鲜静脉血(由北京胸科医院获得，患者知情。)5毫升，加入等体积RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog：SH30809)轻轻混匀，将上述混合液缓慢加至预先已加入等体积淋巴细胞分离液的试管中，避免破坏界面，500×g离心20分钟；取试管中白色界面层于另一试管中，加入等体积RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog：SH30809)清洗二次。离心后加入Trizol，静置5分钟，加入200μl氯仿，剧烈振动后于室温(25℃)放置3分钟，12,000×g，4℃离心15分钟。小心吸取上层水相，转移至一新离心管，加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10分钟。12,000×g，4℃离心15分钟，弃上清，加入1ml 75％的乙醇，振荡，7,500×g，4℃离心5分钟，弃上清。室温干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水。取RNA样品12μl加入Oligo(dT)₁₅(500μg/ml)1μl，70℃加热变性5分钟，取出后立即置于冰上，待冷却后依次加入5×Buffer 5μl、dNTP(10mM)5μl、RNA酶抑制剂1μl，MMLV逆转录酶1μl，总体积为25μl，42℃孵育60分钟进行逆转录反应合成外周血PBMC的cDNA第一链。

根据结核反应性γδT细胞的CDR3区序列，设计合成γ9和δ2链上段搭桥引物和下段搭桥引物，具体序列见表1。

表1健康人及结核病人优势γ9/δ2链的CDR3序列

以外周血PBMC的cDNA第一链为模板，分别以5’-CGGGGTACCATGCTGTCACTGCTCCACAC-3’，5’-TTTTTTTGCCCAACTCCCACTCCCACAAGGCACAGTAGTA-3’和5’-CTCGAGTCATCATGATTTCTCTCCAT-3’，GGAGTGGGAGTTGGGCAAAAAAATCAAGGTATTTGGTCCCGGAA-3’为引物，得到391bp和586bp的片段，为非特异性γ9链的上段产物和非特异性γ9链的下段产物。

以外周血PBMC的cDNA第一链为模板，分别以5’-CGGGGTACCATGCTGTCACTGCTCCACAC-3’，5’-TTTTTTTGCC CAACTCCCACTCGCTTATTA CCAAGGCACA GTAGTA-3’和5’-CTCGAGTCATCATGATTTCTCTCCAT-3，5’-GGAGGTAATAAGCGAGTTGGGCAAAAAAATCAAGGTATTTGGTCCCGGAA-3’为引物，得到397bp和592bp的片段，为特异性γ9链的上段产物和特异性γ9链的下段产物。

以外周血PBMC的cDNA第一链为模板，分别以5’-CGGGGTACCATGCAGAGGATCTCCTCCCTC-3’，5’-ATCGGTTTCCCCTGTTACGT AGCTCCCTAC TGTGTCACAG GCACAGTAGT AAGACCCTTC-3’，和5’-GCCTGTGACACA GTAGGGAGCT ACGTAAGCAC AGGGGAAACCGAT-3.’，5’-CCGCTCGAGTTAC AAGAAAAATAACTTGGCAGTC-3’为引物，得到387bp和564bp的片段，为非特异性δ2链的上段产物和非特异性δ2链的下段产物。

以外周血PBMC的cDNA第一链为模板，分别以5’-CGGGGTACCATGCAGAGGATCTCCTCCCTC-3’，5’-GCTGACGAGGGTGTCACAGGCACAGTAGTAAG-3’和5’-CCGCTCGAGTTACAAGAAAAATAACTTGGCAGTC-3’，5’-ACCCTCGTCAGCACCGATAAACTCATCTTTGG-3’为引物，得到372bp和549bp的片段，为特异性δ2链的上段产物和特异性δ2链的下段产物。

以上PCR反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟，最后一个循环结束后72℃延伸10分钟。DNA琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，用PCR产物切胶回收试剂盒回收目的片段。

以特异性γ9链的上段产物和特异性γ9链的下段产物做模板，以5’-CGGGGTACCATGCTGTCACTGCTCCACAC-3’和，5’-CTCGAGTCATCATGATTTCTCTCCAT-3’为引物，以搭桥PCR方法扩增得到约900bp片段，即为特异性γ9链cDNA全长，经过测序，其核苷酸序列为序列表中的序列1。

以非特异性γ9链的上段产物和非特异性γ9链的下段产物做模板，以5’-CGGGGTACCATGCTGTCACTGCTCCACAC-3’和，5’-CTCGAGTCATCATGATTTCTCTCCAT-3’为引物搭桥PCR方法扩增得到约900bp片段，即为非特异性γ9链cDNA全长，经过测序，其核苷酸序列为序列表中的序列2。

以特异性δ2链的上段产物和特异性δ2链的下段产物做模板，5’-CGGGGTACCATGCAGAGGATCTCCTCCCTC-3’和5’-CCGCTCGAGTTACAAGAAAAATAACTTGGCAGTC-3’为引物搭桥PCR方法，扩增得到约861bp片段，即为特异性δ2链cDNA全长，经过测序，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

以非特异性δ2链的上段产物和非特异性δ2链的下段产物做模板，5’-CGGGGTACCATGCAGAGGATCTCCTCCCTC-3’和5’-CCGCTCGAGTTACAAGAAAAATAACTTGGCAGTC-3’为引物搭桥PCR方法，扩增得到约876bp片段，即为非特异性δ2链cDNA全长，经过测序，其核苷酸序列为序列表中的序列4。

PCR反应条件同前。全长扩增后用PCR产物切胶回收试剂盒回收。

以上扩增结果如图1A所示，A图为搭桥PCR法构建结核特异性和非特异性全长γ9和δ2链。第1泳道为结核非特异性TCRγ9链上段PCR产物，第2泳道为结核非特异性TCRγ9链下段PCR产物，第3泳道为结核非特异性TCRγ9链全长PCR产物，第4泳道为结核非特异性TCRδ2链上段PCR产物，第5泳道为结核非特异性TCRδ2链下段PCR产物，第6泳道为结核非特异性TCRδ2链全长PCR产物；第7泳道为结核特异性TCRγ9链上段PCR产物，第8泳道为结核特异性TCRγ9链下段PCR产物，第9泳道为结核特异性TCRγ9链全长PCR产物，第10泳道为结核特异性TCRδ2链上段PCR产物，第11泳道为结核特异性TCRδ2链下段PCR产物，第12泳道为结核特异性TCRδ2链全长PCR产物。

分别将上述回收的特异γ9链、非特异γ9链、特异δ2链和非特异δ2链cDNA全长经Kpn I和Xho I双酶切后，分别与经过同样酶切的pREP7(Morita C T，Lee HK，Wang H etal.Structural features of nonpeptide prenyl prophosphates that determine their antigenicityfor humanγδT cells[J].J Immunol，2001；167：36-41.公众可从中国医学科学院病原生物学研究所获得。)和pREP9(Morita CT，Lee HK，Wang H et al.Structural features ofnonpeptide prenyl prophosphates that determine their antigenicity for humanγδ T cells[J].JImmunol，2001；167：36-41.公众可从中国医学科学院病原生物学研究所获得。)连接，构建成重组质粒pREP7-γ9(SP)、pREP7-γ9(non-SP)、pREP9-δ2(SP)和pREP9-δ2(non-SP)。转化大肠杆菌DH5α。挑取单个菌落，用小量质粒制备试剂盒提质粒，酶切鉴定，送诺赛公司测序。

结果为重组质粒pREP7-γ9(SP)中含有序列表中的序列1，且pREP7-γ9(SP)为将序列表中的序列1插入pREP7载体的Kpn I和Xho I酶切位点间得到的载体。将含有pREP7-γ9(SP)的重组菌命名为DH5α/pREP7-γ9(SP)。

重组质粒pREP7-γ9(non-SP)中含有序列表中的序列2，且pREP7-γ9(non-SP)为将序列表中的序列2插入pREP7载体的Kpn I和Xho I酶切位点间得到的载体。将含有pREP7-γ9(non-SP)的重组菌命名为DH5α/pREP7-γ9(non-SP)。

重组质粒pREP9-δ2(SP)中含有序列表中的序列3，且pREP9-δ2(SP)为将序列表中的序列3插入pREP9载体的Kpn I和Xho I酶切位点间得到的载体。将含有pREP9-δ2(SP)的重组菌命名为DH5α/pREP9-δ2(SP)。

重组质粒pREP9-δ2(non-SP)中含有序列表中的序列4，且pREP9-δ2(non-SP)为将序列表中的序列4插入pREP9载体的Kpn I和Xho I酶切位点间得到的载体。将含有pREP9-δ2(non-SP)的重组菌命名为DH5α/pREP9-δ2(non-SP)。

序列1-4均可人工合成。

质粒小量试剂盒提取DH5α/pREP7-γ9(SP)、DH5α/pREP7-γ9(non-SP)、DH5α/pREP9-δ2(SP)和DH5α/pREP9-δ2(non-SP)的质粒，Nanodrop仪器检测提取质粒的浓度和纯度，结果为pREP7-γ9(SP)、pREP7-γ9(non-SP)、pREP9-δ2(SP)和pREP9-δ2(non-SP)浓度和纯度分别为1.5μg/μl，1.8μg/μl，2.0μg/μl，1.6μg/μl。

收集1.2×10⁷J.RT3-T3.5细胞(ATCC，TIB 153)，离心洗涤后弃上清液，加入300μl的RPMI-1640完全培养基(Hyclone公司，Catalog：SH30809)及20μg pREP7-γ9(SP)质粒和20μg pREP9-δ2(SP)质粒，室温(25℃)孵育10分钟后，移入电转杯中并置入电转仪，电转参数为250V，975μF。电转完毕后，室温(25℃)放置10分钟，再移入含新霉素和匀霉素的RPMI-1640完全培养基(Hyclone公司，Catalog：SH30809)进行筛选培养。四周后，收集转染结核特异性γ9/δ2TCR链细胞。

采用同样的方法将pREP7-γ9(non-SP)和pREP9-δ2(non-SP)转入J.RT3-T3.5细胞，收集转染结核非特异性γ9/δ2TCR链细胞。

计数1×10⁵个转染结核特异性和非特异性γ9/δ2TCR链细胞，用PBS(Hyclone，SH30256.01B)洗2次后，加入5μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗αβ-TCR抗体和5μl藻红蛋白(PE)标记的抗γδTCR抗体，4℃染色1小时后，PBS(Hyclone，SH30256.01B)洗细胞2次后，流式细胞仪检测表达结核非特异性γ9/δ2TCR或结核特异性γ9/δ2TCR的细胞，将阳性细胞分选后继续培养，使其纯度达到90％。

具体结果如图1B所示，1为转染结核非特异性γ9/δ2TCR链后，经过四周筛选，36％的转染细胞表达γδTCR。2为转染结核特异性γ9/δ2TCR链后，经过四周筛选，38％的转染细胞表达γδTCR。3为流式分选后，88％的转染细胞表达结核非特异性γ9/δ2TCR。4为流式分选后，90％的转染细胞表达结核特异性γ9/δ2TCR。

将结核特异性γδTCR转染细胞和结核非特异性γδTCR转染细胞对其识别结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv总蛋白的功能进行了验证，具体如下：离心收集培养四周的200ml结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv(Zhao et al.Screening and analysisof in vivo induced genes of Mycobacterium tuberculosis.Zhonghua Yi Xue Za Zhi.200888(3)：189-93.公众可从中国医学科学院病原生物学研究所获得。)菌体，加入1ml蛋白裂解液，冰上放置30分钟，12000×g离心30分钟后转移上清至新的1.5ml离心管，得到H37Rv总蛋白，Nanodrop仪器检测提取H37Rv总蛋白的浓度和纯度。将40μgH37Rv总蛋白包被在24孔板中，37℃放置过夜，PBS(Hyclone，SH30256.01B)洗去未结合的蛋白，向24孔板中分别加入1×10⁵个结核特异性γδTCR转染细胞，结核非特异性γδTCR转染细胞和空白对照(加入RPMI-1640完全培养基)。37℃培养24小时，收集上清检测其分泌IL-2的情况。按照试剂盒的说明书(欣博盛公司)，向包被好抗IL-2抗体的96孔板中加入倍比稀释的IL-2的标准品和待测样品及空白对照，37℃孵育90分钟，洗板3次后，加入生物素化的IL-2检测抗体，37℃孵育60分钟。洗板3次后，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，37℃孵育20分钟。洗板3次后，加入显色剂四甲基联苯胺，室温(25℃)避光孵育15分钟，加入终止液，检测OD450nm的吸光度值。根据标准品的浓度，计算待测样品的IL-2分泌量。

结果如图1C所示，其中结核特异性γδTCR转染细胞(TB特异性)的IL-2的表达量为321pg/ml，结核非特异性γδTCR转染细胞(TB非特异性)的IL-2的表达量为84pg/ml，空白对照(对照)的IL-2的表达量为33pg/ml。此数值为三次实验的平均值。

结果证明，成功构建了结核特异性γδTCR转染细胞系，命名为tester细胞；成功构建了非特异性γδTCR转染细胞系，命名为driver细胞。

2.筛选噬菌体十二肽库

以结核特异性γδTCR细胞tester细胞，结核非特异性γδTCR细胞driver细胞为探针，筛选噬菌体十二肽库的操作流程，如图2A所示。

分别离心收集上述获得的结核特异性γδTCR转染细胞tester细胞，结核非特异γδTCR转染细胞driver细胞，RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog：SH30809)洗细胞两次后，细胞重悬于RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog：SH30809)中，于37℃孵育1小时。分别离心收集细胞，将细胞重悬于封闭液中，37℃孵育1小时。向driver细胞封闭液中加入20μl噬菌体库原液(BioLabs，Catalog：#E8110S)(约3×10¹¹的噬菌体)，37℃孵育1小时。800×g离心5分钟沉淀driver细胞，将上清液小心加入到tester细胞的封闭液中，37℃孵育1小时。TBST(TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mM NaCl))+0.1％Tween-20)洗细胞3遍。最后细胞重悬于TBS(50mMTris.HCl，pH 7.4and 150mM NaCl)中，取部分TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mM NaCl)测定噬菌体滴度。

具体如下：首先挑取大肠杆菌ER2738原始菌种，在LB-四环素平板上进行划线接种培养，于37℃培养过夜。挑取大肠杆菌ER2738单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，于37℃摇床上振荡培养过夜，备用。用TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mMNaCl)对噬菌体进行1∶10梯度稀释。将摇好的菌液按200μl/管进行分装，每管加入一个稀释浓度的噬菌体10μl，室温(25℃)孵育5分钟。于37℃温箱中，预热LB/IPTG/X-gal平板，备用。同时，用微波炉熔化顶层胶琼脂糖，分装于试管中，每管3ml，噬菌体的一个稀释度对应使用一个培养试管。将各个浓度的噬菌体与细菌的混合物分别加入含有顶层琼脂糖胶的试管中，快速振荡混匀，立即将各管内混合物倾入装有预热的LB/IPTG/X-gal平板中，轻轻旋动平皿以使顶层胶及细菌分布均匀。操作动作要快，以便在顶层胶凝固之前使其均匀分布于整个琼脂平板。盖上平皿，于室温放置5分钟，使琼脂凝固，翻转后于37℃培养。由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZα基因，当铺在含IPTG和X-gal的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑。8～12小时后，对蓝色噬斑数大约为100的平板进行噬斑计数。计算滴度：蓝斑数×稀释倍数＝10μl噬菌体原液的滴度。其余进行扩增，将ER2738过夜培养物200μl和20ml LB培养基加入灭菌的250ml烧瓶中，将待扩增的噬菌体加入到上述烧瓶中，于37℃持续振摇培养4.5小时。将培养物转移到50ml离心管中，于4℃，12,000×g离心10分钟。将上清液转入另一离心管中，于4℃，12,000×g再次离心10分钟。取离心管上部80％的上清液，转入新的离心管中，并加入1/6体积的PEG/NaCl。4℃过夜。于4℃，12,000×g离心15分钟，弃上清，再次离心30秒，用微量进样器移去残余液体。用1ml TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mM NaCl)重悬沉淀物，并将其转移至微量离心管中，于4℃，12,000×g离心5分钟，使混杂的少量细菌沉淀。将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次沉淀噬菌体，冰浴1小时。4℃，12,000×g离心10分钟，去上清，离心30秒，用微量进样器移去残余液体。将沉淀重悬于200μl TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mMNaCl)中，即为扩增的纯化好的噬菌体。用上述方法对其进行滴度测定，用于下一轮筛选。分别进行几轮筛选，以便进一步富集噬菌体表位。筛选过程只是将噬菌体库改为上一轮筛选扩增后的噬菌体悬液，量以滴度为准，即每次加入量尽量接近10¹¹以上。另外洗液TBST第二轮改用0.2％的Tween浓度，第三轮改用0.3％的Tween浓度，第四轮改为0.4％的Tween浓度。与driver细胞的作用时间依次为75分钟，90分钟和115分钟，而与tester细胞的作用时间依次为45分钟，30分钟和15分钟。最后一轮筛选的噬菌体不用扩增，直接用于蓝斑挑克隆。于干净的三角瓶中加入15ml新鲜的LB培养基，再加入150μl过夜菌液，混匀。将上述混匀液分装入试管，每管1ml。打开最后一轮筛选噬菌体的克隆板用枪头将大小合适，独立的蓝色单噬菌斑挑起，小心放入中试管中，37℃摇菌4.5小时。将菌液转入1.5ml EP管，4℃12,000×g离心10分钟。吸取500μl上清液于一新管，加入100μl PEG/NaCl，4℃沉淀噬菌体2小时。4℃12,000×g离心10分钟。吸净上清液，沉淀用100μl TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mMNaCl)重悬，即为纯化的单克隆噬菌体。

ELISA检测筛选到的噬菌体与转染细胞的结合情况，具体如下：收集tester细胞，TBS(50mM Tris.HCl，pH 7.4and 150mM NaCl)溶液洗两次后，以1×10⁴个/每孔细胞数用4％的多聚甲醛固定于ELISA反应板上，室温放置30分钟。用0.1％TBST洗3遍。加入300μl含2％BSA或含5％脱脂奶粉的PBS(Hyclone，SH30256.01B)，封闭条件均为37℃2小时。用0.1％TBST洗3遍。每孔分别加入1×10⁸个噬菌体，设空白对照组，37℃反应2小时。用TBST洗3遍。加入HRP标记的抗M13单克隆抗体(TBST，1∶5000稀释)，37℃反应1小时。用TBST洗3遍。加入底物显色液显色20分钟，用2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，测定波长450nm，参比波长630nm。

所获阳性克隆的噬菌体与转染细胞之间的反应，结果如图2B所示，与tester细胞结合大于diver细胞的2倍的噬菌体克隆被认为是阳性纯化的单克隆噬菌体。阳性克隆用箭头标注。

取阳性纯化的单克隆噬菌体进行PCR反应(引物序列由试剂盒提供5′-TTATTCGCAATTCCTTTAGTG-3′和5′-GCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′)，结果如图2C所示，1-9分别为9个代表的独立克隆，扩增150-180bp的片段即为含十二肽插入片段。

将上述含十二肽插入片段进行测序，结果为出现频率较高的表位肽为TP1。

人工合成序列表中的序列5，即为表位肽TP1，并使一半的表位肽TP1的N端进行生物素化的标记，分别得到表位肽TP1和生物素化的表位肽TP1，该表位肽的编码基因为序列表中的序列6。

实施例2、表位肽TP1的功能鉴定

1、候选表位肽刺激结核特异性γδTCR转染细胞分泌IL-2的检测

向24孔塑料培养板孔内分别加入500μl内含10μg、20μg和40μg候选表位肽TP1(由实施例1得到的表位肽TP1)的RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog：SH30809)进行包被，37℃孵育2小时。弃包被液，用RPMI-1640培养液(Hyclone公司，Catalog：SH30809)洗3次。分别将1×10⁶个/ml的tester细胞、1×10⁶个/ml的driver细胞加到洗涤好的24孔培养板中。24小时，收集含10μg TP1的tester细胞上清液、含20μg TP1的tester细胞上清液、含40μg TP1的tester细胞上清液、含10μgTP1的driver细胞上清液、含20μg TP1的driver细胞上清液、含40μg TP1的driver细胞上清液、含10μg TP1的阻断后的tester细胞上清液、含20μg TP1的阻断后的tester细胞上清液、含40μg TP1的阻断后的tester细胞上清液，ELISA方法检测(如前述)IL-2的表达情况。

结果如图3A所示，其中阻断的tester细胞是指将tester细胞预先与γδTCR阻断型抗体(Ebioscience，16-9959)共孵育2小时后，得到的细胞。

含10μg、20μg、40μg TP1的tester细胞的IL-2的表达量分别为385pg/ml，425pg/ml，554pg/ml；

含10μg、20μg、40μg TP1的driver细胞的IL-2的表达量分别为115pg/ml，220pg/ml，344pg/ml；

含10μg、20μg、40μg TP1的block细胞的IL-2的表达量分别为110pg/ml，180pg/ml，241pg/ml；

将tester细胞取1ml(约1×10⁶cells/ml)，3000×g离心5分钟，弃上清，用含PBS(Hyclone，SH30256.01B)洗液洗3次，离心同上，加入10μl含1μg/μl由实施例1得到的生物素化的表位肽TP1溶液(溶质是生物素化的表位肽，溶剂是PBS(Hyclone，SH30256.01B)，4℃孵育1小时，洗液离心洗涤三次后，加入2μl FITC标记的链亲和素(ebioscience，11-4317)，4℃避光孵育30分钟后，洗液离心洗涤三次，用500μl PBS(Hyclone，SH30256.01B)重悬后，根据FITC的荧光强度，流式细胞仪检测tester细胞与生物素化的表位肽TP1的结合百分比。以生物素化的对照肽(氨基酸序列为ADAATRSSKMPK)为对照。TP1肽阻断是指将tester细胞预先与γδTCR阻断型抗体(Ebioscience，16-9959)共孵育2小时后，再与生物素化的表位肽TP1结合得到的结合百分比。

结果如图3B所示，对照肽、TP1肽和TP1肽阻断与tester细胞的结合比率分别为3％，32％和12％。

可以看出，表位肽TP1与转染细胞的结合最为显著，同时TP1与结核特异性γδTCR转染细胞的结合能够被γδTCR抗体(Ebioscience，16-9959)所阻断。说明表位肽TP1与转染细胞的结合是特异性的，可以促进与之特异结合的结核特异性γδTCR转染细胞分泌IL-2。

2、表位肽TP1与结核病人外周血中γδT细胞的结合情况

分别收集结核病人和正常人的外周血单个核细胞(来自北京胸科医院)，以pan-γδTCR抗体(Immunotech，Immu515)，分别扩增γδT细胞。将固相化的4μgpan-γδTCR抗体包被在24孔板中，37℃孵育2小时后，加入1×10⁷个外周血单个核细胞，同时加入200U/ml的IL-2(BD公司，554603)，每三天更换培养液和新的细胞因子。扩增时间为4周。4周后，用5μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗αβ-TCR抗体(BD，347773)和5μl藻红蛋白(PE)标记的抗γδTCR抗体(BD，555717)检测结核病人和正常人的γδT细胞的纯度为80％。分别取1ml上述获得的结核病人和正常人γδT细胞(约1×10⁶cells/ml)，3000×g离心5分钟，弃上清，用含1％BSA的PBS(Hyclone，SH30256.01B)洗液洗3次，离心同上，加入10μl含1μg/μl由实施例1得到的生物素化的表位肽TP1溶液(溶质是生物素化的表位肽，溶剂是PBS(Hyclone，SH30256.01B)，4℃孵育1小时，洗液离心洗涤三次后，加入2μl FITC标记的链亲和素(ebioscience11-4317)，4℃避光孵育30分钟后，洗液离心洗涤三次，用500μl PBS(Hyclone，SH30256.01B)重悬后，流式细胞仪分析生物素化的表位肽与结核病人和正常人γδT细胞的结合比率。

结果如图4A所示，为流式细胞仪检测TP1与结核病人外周血中γδT细胞的结合情况，其中，对照为同型对照(采用同型抗体)，可以看出，TP1与正常人(健康人对照)外周血中γδT细胞的结合率为5％，TP1与结核病人外周血中的γδT细胞的结合率为33％。

此外，为了证明TP1能否跟天然存在的γδT细胞结合，将40μg对照肽(ADAATRSSKMPK)和40μg由实施例1得到的生物素化的表位肽TP1分别包被在24孔板中，分别加入1×10⁶个结核病人和正常人的外周血单个核细胞，进行扩增(扩增条件同前)，2周后收集细胞，用PBS洗液(Hyclone，SH30256.01B)洗3次，加入2μl含FITC-αβTCR(BD，347773)和PE-γδTCR(BD，555717)抗体，4℃避光孵育1小时，洗液离心洗涤三次后，用500μl PBS(Hyclone，SH30256.01B)重悬后，流式检测TP1诱导结核病人外周血中γδT细胞的活化情况。

结果如图4B所示，为TP1诱导结核病人外周血中γδT细胞的活化情况。1为对照肽诱导正常人外周血中γδT细胞的增值比例，为2％，2为对照肽诱导结核病人外周血中γδT细胞的增值比例，为5％，3为TP1诱导正常人外周血中γδT细胞的增值比例，为6％，4为TP1诱导结核病人外周血中γδT细胞的增值比例，为18％。

说明TP1能够诱导结核病人外周血中γδT细胞的增值。

Claims (10)

1.一种多肽，是由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的多肽。 

2.编码权利要求1所述多肽的基因。 

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中序列6所示的DNA分子。 

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。 

5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。 

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。 

7.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组菌在制备促进γδT细胞分泌IL-2的促进剂中的应用。 

8.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组菌在制备促进γδT细胞的增殖的促进剂中的应用。 

9.权利要求1所述多肽、权利要求2或3所述基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组菌在制备抗结核杆菌产品中的应用。 

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。 

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