CN102741696A - 阿尔茨海默病外周细胞中pkc同工酶加工的异常改变 - Google Patents

阿尔茨海默病外周细胞中pkc同工酶加工的异常改变 Download PDF

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Abstract

本发明提供通过用PKC同工酶指数从非AD病症中诊断AD的方法，所述指数通过缺失和存在β-淀粉样肽及任选存在PKC激活剂时确定测试对象的外周细胞中不同PKC同工酶之比的比例来获得。

Description

阿尔茨海默病外周细胞中PKC同工酶加工的异常改变
本申请要求2009年10月2日提交的美国临时申请系列号61/248,361的优先权，其公开通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及诊断阿尔茨海默病或确认对象是否存在阿尔茨海默病的方法。本发明还涉及筛选可用于开发治疗或预防阿尔茨海默病的治疗剂的先导化合物的方法。本发明还涉及用稳定或磷酸化的PKC同工酶水平构建的算法比来检测某些PKC同工酶加工的变化从而诊断对象中阿尔茨海默病的方法。本文所述方法用于诊断阿尔茨海默病、监控阿尔茨海默病发展并用于鉴定先导化合物的筛选方法。本发明还涉及选择对阿尔茨海默病的治疗响应提高的患者的方法。
发明背景
β-淀粉样蛋白(Aβ)是神经炎性斑的主要组分，其与神经原纤维团一起为阿尔茨海默病(AD)的生理标记。Katzman，N Eng J Med.1986；314：964-973；Bush等，Pharmacol Ther.1992；56：97-117。淀粉样前体蛋白(APP)的突变形式促使不同脑区域中Aβ的过度释放，造成其在神经炎块中的积累。Wallace，Biochim Biophys Acta.1994；1227：183-187。在包括成纤维细胞在内的许多来自AD组织的细胞类型中，已证明涉及钙稳态、离子通道渗透性、环化AMP和磷酸肌醇代谢物的信号转导系统中发生变化。还显示Aβ的生成改变。此外，Aβ自身能影响相同转导系统。
蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶的最大基因家族之一。Liu和Heckman，CellularSignalling.1998；10(8)：529-42。数种PKC同工酶在脑中表达，包括PKC-α、PKC-β1，、PKC-βII、PKC-δ、PKC-ε和PKC-γ。PKC主要是胞浆蛋白质，但刺激后其移位到膜上。
已表明PKC参与大量有关AD的生化过程。PKC活化在学习能力和记忆提高中起关键作用，且已表明PKC激活剂提高记忆和学习能力。Sun和Alkon，Eur JPharmacol.2005；512：43-51；Alkon等，Proc Natl Acad Sci USA.2005；102：16432-16437。还显示PKC活化诱导大鼠海马区的突触发生，这表明神经变性病症期间可能发生PKC介导的抗凋亡和突触发生。Sun和Alkon，Proc NatlAcad Sci USA.2008；105(36)：13620-13625。PKC激活剂苔藓抑素-1的缺血/低氧后治疗有效地恢复突触发生、神经营养活性以及空间学习和记忆中缺血诱导的缺陷。Sun和Alkon，Proc Natl Acad Sci USA.2008。该效应伴随有突触蛋白树突棘素(spiniophilin)和突触小泡蛋白的水平上升和突触形态的结构改变。Hongpaisan和Alkon，Proc Natl Acad Sci USA.2007；104：19571-19576。用于长期联想记忆的苔藓抑素诱导的突触发生也受到PKC活化的调节。Hongpaisan和Alkon，PNAS 2007。PKC还活化神经营养蛋白生产。神经营养蛋白，具体是脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)是受损神经元和突触起始修复和再生长的关键生长因子。一些PKC同工酶，具体是PKC-ε和PKC-α的活化能保护免受神经损伤，其最可能是通过上调神经营养蛋白的生成而实现。Weinreb等，The FASEB Journal.2004；18：1471-1473)。还报道PKC激活剂诱导酪氨酸羟化酶的表达并诱导神经元存活和神经突长出。Du和Iacovitti，J Neurochem.1997；68：564-69；Hongpaisan和Alkon，PNAS 2007；Lallemend等，J Cell Sci.2005；118：4511-25。
PKC基因家族目前由11种基因组成，它们分成以下4个亚组：1)经典PKC-α、-β1、-β2(β1和β2是同一基因的选择性剪接形式)和-γ，2)新的PKC-δ、-ε、-η和-θ；3)非典型的PKC-ξ、-λ、-η和-ι；和4)PKC-μ。PKC-μ类似于非典型的PKC同工酶，但不同之处是具有推定的跨膜域。Blohe等，Cancer Metast.Rev.1994；13：411；Ilug等，Biochem J.1993；291：329；Kikkawa等，Ann.Rev.Biochem.1989；58：31。-α、-β1、-β2和-γ同工酶是Ca2+、磷脂和二酰甘油依赖性的，它们代表PKC的经典同种型，而其他同工酶能被磷脂和二酰甘油激活，但不依赖Ca2+。所有同工酶均包括5个可变区(V1-V5)，且α、β和γ同工酶含有高度保守的四个(C1-C4)结构域。除PKC-α、-β和-γ-外，所有同工酶均缺少C2结构域，且-λ、-η和同工酶也缺少二酰甘油结合的C1中两个富含半胱氨酸锌指结构域中的九个。C1结构域也含有所有同工酶中高度保守的假底物序列，它通过阻断底物结合位点产生该酶的无活性构象而起到自身调节功能。House等，Science.1987；238：1726。
由于这些结构特征，认为各种PKC同工酶在响应生理刺激的信号转导中具有高度特化的功能。各种PKC同工酶对刺激的响应已在AD中研究。例如，AD患者中PKC主要下游底物Erk1/2的PKC-α/ε-介导的磷酸化水平降低。Khan和Alkon，Proc Natl Acad Sci USA.2006；103：13203-13207。此外，对正常成纤维细胞的Aβ应用降低PKC活性，因为Aβ直接下调PKC α/ε。已提出PKC激活剂，尤其是对PKCα/ε特异的那些能抵消Aβ的效应，从而逆转或阻止Aβ诱导的改变。
还证实了PKC调控APP过程。已显示PKC激活剂能显著增加细胞分泌的非淀粉样可溶性APP(sAPP)的相对含量。PKC活化还逆转异常的MAP激酶磷酸化和AD成纤维细胞中Aβ水平的伴随升高。参见美国专利申请公开号US-2007-0082366。此外，发现一种有效的PKC激活剂苔藓抑素降低含人AD基因的转基因小鼠脑中的Aβ(1-42)水平。
相反，还表明Aβ肽相较非AD成纤维细胞差异性影响AD成纤维细胞中的PKC同工酶。Favit等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；1998.95：5562-67。用纳摩尔浓度的Aβ(1-40)处理非AD(AC)成纤维细胞使PKC-α下降75％，其在AD成纤维细胞中已下降，但不是PKC-γ的免疫反应性。相反，在AD成纤维细胞中，Aβ(1-40)引起PKC-γ下降70％而非PKC-α的免疫反应性。用PKC激活剂处理恢复了AC细胞中的PKC-α信号，但其没有逆转对AD细胞中PKC-γ的影响。用蛋白合成抑制剂处理没有抑制AD细胞中Aβ(1-40)的效应但抑制PKC激活剂处理的AC细胞中的效应，表明正常细胞而非AD细胞中PKC的激活通过蛋白从头合成发挥保护作用。
本发明提供研究外周细胞中Aβ诱导的变化对各种PKC同工酶水平的影响的方法。测量水平稳定状态和/或磷酸化的PKC同工酶以及Aβ诱导的变化可用于诊断AD、监控AD发展或非AD状态到AD的发展、并用于发现治疗AD疗法的筛选方法。
发明概述
本发明涉及确定或证实对象中是否存在阿尔茨海默病的方法。在一个实施方式中，本方法包括i)确定有和没有Aβ肽时候选对象的细胞中第一PKC同工酶的稳定状态蛋白水平，生成第一比例；ii)确定有和没有Aβ肽时第二PKC同工酶的稳定状态蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二PKC同工酶是否受Aβ肽调节未知；iii)通过将所述第一比例除以第二比例生成PKC同工酶指数。
在一个实施方式中，所述Aβ肽是Aβ(1-42)，尽管可用任何Aβ肽。
在另一实施方式中，所述第一PKC同工酶是PKC-α、和/或PKC-ε且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
在一个具体实施方式中，稳定状态的PKC同工酶水平的差分处理，即PKC同工酶指数，按照下述公式确定：
在另一实施方式中，所测对象的PKC-α指数与来自非AD对照对象的细胞的PKC-α指数作比较。在一个具体实施方式中，对照对象的细胞为相同细胞类型，且来自年龄匹配的非AD对照对象(AC)。
在一个实施方式中，来自所测对象的细胞的PKC-α指数低于来自对照对象(AC)的细胞的PKC-α指数表明有AD。
在另一具体实施方式中，若PKC-α指数值大于约1.0，则诊断对象患有AD。
在另一具体实施方式中，稳定状态的PKC同工酶水平的差分处理用根据下述公式的比例确定：
Figure BPA00001563867200042
在另一实施方式中，所测对象的PKC-ε指数与来自非AD对照对象的细胞的PKC-ε指数作比较。在一个具体实施方式中，对照对象的细胞为相同细胞类型，且来自年龄匹配的非AD对照对象(AC)。
在一个实施方式中，来自所测对象的细胞的PKC-ε指数低于来自对照对象(AC)的细胞的PKC-ε指数表明有AD。
在另一具体实施方式中，若PKC-ε指数值大于约1.0，则诊断对象患有AD。
在另一具体实施方式中，本发明包括i)确定有和没有Aβ肽时候选对象的细胞中第一磷酸化PKC同工酶的蛋白水平，生成第一比例；ii)确定有和没有Aβ肽时第二磷酸化PKC同工酶的蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二PKC同工酶是否受Aβ肽调节未知；iii)通过将所述第一比例除以第二比例生成磷酸化PKC同工酶指数。
在一个具体实施方式中，磷酸化PKC同工酶的差分处理，即磷酸化PKC(p-PKC)同工酶指数，按照下述公式确定：
Figure BPA00001563867200051
在另一实施方式中，所测对象的p-PKC-α指数与来自非AD对照对象的细胞的p-PKC-α指数作比较。在一个具体实施方式中，对照对象的细胞为相同细胞类型，且来自年龄匹配的非AD对照对象(AC)。
在一个实施方式中，来自所测对象的细胞的p-PKC-α指数低于来自对照对象(AC)的细胞的p-PKC-α指数表明有AD。
在另一具体实施方式中，若p-PKC-α指数值大于约1.0，则诊断对象患有AD。
在另一具体实施方式中，磷酸化PKC同工酶的差分处理用根据下述公式的比例确定：
Figure BPA00001563867200052
在另一实施方式中，所测对象的p-PKC-ε指数与来自非AD对照对象的细胞的p-PKC-ε指数作比较。在一个具体实施方式中，对照对象的细胞为相同细胞类型，且来自年龄匹配的非AD对照对象(AC)。
在一个实施方式中，来自所测对象的细胞的p-PKC-ε指数低于来自对照对象(AC)的细胞的p-PKC-ε指数表明有AD。
在另一具体实施方式中，若p-PKC-ε指数值大于约1.0，则诊断对象患有AD。
在另一具体实施方式中，对象细胞在缺失和存在Aβ时接触浓度足以诱导所述第一和/或第二PKC同工酶磷酸化的PKC激活剂，并根据上述公式1、2、3和/或4确定PKC指数。
在另一实施方式中，上述公式确定的指数与非AD对照对象中细胞的指数作比较。在一个具体实施方式中，所述细胞为相同细胞类型，且来自年龄匹配的非AD对照对象(AC)。
在另一具体实施方式中，本发明提供用上述方法监控从AD前状态如轻度认知功能障碍(MCI)、或从所述疾病的早期如AD早期到AD的发展。在该实施方式中，本发明的方法以时序间隔重复，且PKC指数随着时间的降低表明非AD向AD的发展，或从早期到晚期的AD发展。
本发明的某些实施方式中，用于诊断试验的细胞是外周细胞。在一些实施方式中，所述细胞是皮肤细胞、皮肤成纤维细胞、血液细胞或口腔颊粘膜细胞。
在具体实施方式中，所述细胞是皮肤成纤维细胞。
在另一实施方式中，本发明提供鉴定用于治疗AD的先导化合物的方法，所述方法包括：将分离自诊断有AD的对象的细胞与检测化合物接触，然后确定对下述的影响，i)按照公式1的PKC-α指数；ii)按照公式2的PKC-ε指数；iii)按照公式3的p-PKC-α指数；和/或iv)按照公式4的p-PKC-ε指数，其中存在所测化合物时所述PKC指数(或指数的组合)相较不存在所测化合物时测量的相同指数而增加。
在另一实施方式中，本发明提供含用于检测或诊断AD的试剂或仪器的药盒。在一些实施方式中，所述药盒包含一种或多种Aβ肽如Aβ(1-40)和/或Aβ(1-42)；对稳定状态和磷酸化PKC同工酶特异的抗体；在免疫试验中用作对照的PKC同工酶的一种或多种蛋白样品；进行免疫试验和含评价结果的标准的说明。
在其他实施方式中，所述药盒还可包含进行一种或多种活检如皮肤打孔活检所需的仪器、缓冲液和储存容器。
附图说明
图1：图1显示AD细胞和年龄匹配的对照细胞(AC)之间的PKC-α指数(公式1)比较。
发明详述
本发明某些方面涉及在取自对象的已鉴定用于测试和诊断的人细胞中诊断阿尔茨海默病的方法。所述诊断基于此发现：取自对象的外周细胞中稳定状态或磷酸化PKC的差异水平和相同细胞中Aβ诱导的变化可一起用于构建确定对象是否患AD的算法比。
所述方法取决于来自候选对象和任选地非AD对照对象(AC)的外周细胞中稳定状态或磷酸化PKC同工酶的测量水平。随后或同时，在缺失和存在Aβ肽情况下从AD和AC对象的外周细胞中测量第一PKC同工酶的稳定水平，产生所述PKC同工酶水平的第一比例(缺失Aβ肽的PKC同工酶水平/存在Aβ肽的水平)。再通过测量缺失和存在Aβ肽情况下对象的外周细胞中第二PKC同工酶的稳定状态或磷酸化水平还获得第二PKC同工酶比例。然后这些测量结果用于构建第三比例，其中所述第一比例(不接触Aβ肽的细胞中获得的第一PKC同工酶水平/接触Aβ肽的细胞中获得的第一PKC同工酶水平)除以所述第二比例(不接触Aβ肽的细胞中第二PKC同工酶水平/接触Aβ肽的细胞中第二PKC同工酶水平)生成PKC同工酶指数。该PKC同工酶指数可用以下通式生成：
Figure BPA00001563867200071
或
Figure BPA00001563867200072
其中“x”代表感兴趣的PKC同工酶，“z”代表所述第二PKC同工酶，“p-PKC-x”和“p-PKC-z”代表磷酸化PKC同工酶，且Aβ代表存在Aβ肽时确定PKC同工酶水平的细胞。
在一些实施方式中，PKC-x和p-PKC-x代表AD与非AD细胞相比已知的受Aβ肽差异影响的PKC同工酶，且PKC-z和PKC-z代表AD与非AD细胞相比未知是否受Aβ肽差异影响的PKC同工酶。具体地，预期PKC-x为PKC-α或PKC-ε，且PKC-z为PKC-γ。
在一个具体实施方式中，本发明提供通过按照下式1生成PKC-α指数来诊断存在或不存在AD的方法：
Figure BPA00001563867200073
意外发现来自非AD对象，甚至是患非AD痴呆或健忘的对象的PKC-α指数高于AD患者的相同PKC指数。
在一个实施方式中，若PKC-α指数为约1.0或更少，则诊断为AD。
在另一具体实施方式中，本发明提供通过按照下式2生成PKC-ε指数来诊断存在或不存在AD的方法：
Figure BPA00001563867200081
意外发现来自非AD对象，甚至是患非AD痴呆或健忘的对象的PKC-ε指数高于AD患者的相同PKC指数。
在一个实施方式中，若PKC-ε指数为约1.0或更少，则诊断为AD。
本发明方法还可与PKC激活剂联用。在本实施方式中，细胞在缺失或存在Aβ时与PKC激活剂接触，且按照上述公式I和II的PKC同工酶水平会用于确定本发明的PKC指数。
具体预期用于诊断方法、药盒和筛选方法中以鉴定本发明化合物的蛋白激酶C激活剂包括但不限于：大环内酯、苯唑拉胺、或吡咯烷酮。缓激肽；苔藓抑素1；苔藓抑素2-18；夹竹桃抑素；佛波酯；缓激肽、铃蟾肽、胆囊收缩素、凝血酶、前列腺素F2α和加压素。还包括称为“苔藓抑素类似物”的化合物，其为苔藓抑素的衍生物。虽然苔藓抑素-1具有两个吡喃环和一个六元环状缩醛，但在大部分苔藓抑素类似物中，苔藓抑素-1的一个吡喃被第二个六元缩醛环代替。参见PCTWO2008/100449。最后，环氧化和环丙烷化的多不饱和脂肪酸已鉴定为PKC-ε选择性激活剂。参见2009年7月28日提交的待批PCT系列号PCT US/2009/051927。
按照本发明，术语“PKC同工酶”指-α、-β1、-β2-γ、-δ、-ε、-η、-θ、-ξ、-λ、-η、-ι、和-μ同工酶。在具体实施方式中，术语PKC同工酶指-α、-β、-γ、-δ、和-ε。
术语“Aβ肽”指来自膜蛋白淀粉样前体蛋白(APP)的长39-43氨基酸的肽，其似乎是阿尔茨海默病患者大脑中淀粉样斑的主要组分。在具体实施方式中，本发明方法所用的Aβ肽为Aβ(1-40)和/或Aβ(1-42)。术语“淀粉样β肽”、“β淀粉样蛋白”、“β淀粉样肽”、“β淀粉样”可互换施用。存在多种APP同种型如APP695、APP751、和APP770。目前已知人体中存在的APP具体同种型的示例为Kang等，Nature.1987；325：733-736所述的695氨基酸多肽，称为“正常”APP；Ponte等，Nature.1988；331：525-527和Tanzi等，Nature.1988；331：528-530所述的751氨基酸多肽；和Kitaguchi等Nature.1988；331：530-532所述的770氨基酸多肽。不同α-和β-分泌酶在体内或原位蛋白水解加工APP的结果是发现长40氨基酸的“短形式”Aβ和长42-43氨基酸的长形式Aβ。
Aβ肽市售可得，例如rPeptides公司(乔治亚州的博加特)或金斯瑞公司(GenScript)(新泽西州皮斯卡特维)。此外，Aβ肽可用按照已知方法的重组工程技术合成或生成。
本发明还提供监控对象中AD发展的方法。随着AD的发展如从早期AD或轻度AD到中度AD或到晚期AD，预期如上所述确定的PKC同工酶指数值相较早期AD的PKC同工酶指数值或AD前病症的PKC同工酶指数值下降，或甚至变为负值。
如本文所用，“早期阿尔茨海默病”表示疾病的阶段。患早期AD和相关痴呆的人仅由于所述疾病症状引起轻度功能障碍。其仍可工作、驾车且仅日常生活的某些活动需最小协助。该阶段的对象常自知其诊断和能力。
“轻度阿尔茨海默病”指认知下降更明显的阶段。轻度AD患者可能忘记近期事件或人的细节。其他问题包括数学能力受损(例如，9秒内难以从100向后计数)、进行复杂任务如举办聚会或财务管理的能力下降、喜怒无常和回避社会。
如本文所用，“非AD痴呆”指与AD共有症状的病症。这些症状包括轻度认知障碍、血管性痴呆如打击或头部创伤造成的那些、混合痴呆、路易体痴呆、帕金森病、额颞性痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病或其他感染疾病、皮克病、亨延顿病、韦尼克-科尔萨科夫综合症(Wernicke-Korsakoff Syndrome)。
“轻度认知障碍”指表征为记忆问题比根据衰老正常预期的严重，但没有显示痴呆的其他症状如判断和推理缺陷的病症。每年有10％-15％的MCI患者发生AD，相比之下正常老年群体为1％。“健忘MCI”是涉及短期记忆丢失的一种MCI类型。
按照本发明的“非AD对照对象”指未被诊断或怀疑患有AD的对象。该对象可包括患非AD痴呆或健忘的对象。
本发明的方法中，取自个体或患者的外周细胞可为任何活细胞。在一个实施方式中，所述细胞为皮肤成纤维细胞，但若任何其他外周组织细胞(即中枢神经系统外的组织细胞)更便于获取或加工，则该细胞可用于本发明的测试。其他合适的细胞包括但不限于血液细胞如红细胞和白细胞、口腔颊粘膜细胞、神经细胞如嗅觉神经元、脑脊液、尿液和任何其他外周细胞类型。此外，用于对比目的的细胞不一定来自健康供体。
所述细胞可为新鲜的或可为培养的(参见美国专利号6,107,050，其通过引用全文纳入本文)。在一个具体实施方式中，可采用皮肤打孔活检从对象获取皮肤成纤维细胞。这些成纤维细胞用本文所述技术直接分析或引入细胞培养条件中。然后如实施例和整个说明书所述分析得到的培养成纤维细胞。可能需要其他步骤制备用于分析的其他类型细胞，如口腔颊粘膜细胞、神经细胞如嗅觉细胞、血液细胞如红细胞和白细胞等。例如，血液细胞可通过从外周静脉中提取血液而容易地获得。然后细胞可用标准程序(如用细胞分选器、离心等)分离并稍后分析。
根据本发明的方法，所用的Aβ肽浓度可为约1nM-100μM，优选约10nM-10μM。处理时细胞应为约80-100％融合。
可通过本领域技术人员已知的常规方法从细胞中分离蛋白。在优选的方法中，清洗分离自患者的细胞并在磷酸缓冲盐水(PBS)中成团。然后团块用含50nM NaF、1mM EDTA、1mM EGTA、20μg/ml亮抑肽酶、50μg/ml抑胃酶肽、10mMTRIS-HCl、pH＝7.4的“均质缓冲液”清洗并通过离心成团。弃上清，并在所述团块中加入“均质缓冲液”然后超声处理所述团块。蛋白提取物可新鲜使用或储存于-80℃用于后续分析。
本发明的方法中，公开的免疫试验中所用的抗体可为单抗或多抗来源。用于生成所述抗体的磷酸化和非磷酸化PKC同工酶、蛋白或其部分可来自天然或重组来源或通过化学合成生成。
在本发明诊断方法的某些实施方式中，PKC同工酶蛋白通过免疫试验检测。在本发明的某些实施方式中，所述免疫试验可为放射性免疫试验、Western印迹试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫沉淀试验、化学发光试验、免疫组化试验、免疫电泳试验、斑点印迹试验或狭缝印迹试验。本发明的诊断方法的其他优选实施方式中，所述诊断方法可用蛋白阵列或肽阵列或蛋白微阵列。蛋白定量可用例如密度分析或分光光度法评估。
此外，本文公开的方法可与其他诊断方法联用，所述其他方法例如基于2009年10月2日提交的美国临时申请系列号61/248,368、61/344,045、61/362,518和61/365,545，用于诊断阿尔茨海默病的成纤维细胞生长模式，题为“Fibroblast GrowthPaterns for the Diagnosis of Alzheimer’s Disease(用于诊断阿尔茨海默病的成纤维细胞生长模式)”的申请中所述的那些。预期与本发明方法联用的其他方法在Alkon等的美国专利7,682,807和PCT申请号PCT/US2004/038160和PCTUS2005/036014中描述。
本发明某些实施方式中还涉及含用于检测或诊断AD的试剂或仪器的药盒。例如，所述药盒会含一种或多种Aβ肽如Aβ(1-40)和/或Aβ(1-42)；对稳定状态和磷酸化PKC同工酶特异的抗体；在免疫试验中用作对照的PKC同工酶的一种或多种蛋白样品；进行免疫试验和含评价结果的标准的说明。所述药盒还可含本文所述任何一种或多种蛋白激酶C激活剂(例如缓激肽或苔藓抑素)。所述药盒可包含进行一种或多种活检如皮肤打孔活检所需的仪器、缓冲液和储存容器。所述药盒还可包含缓冲液、二抗、对照细胞等。
另一方面，本文涉及鉴定用于治疗AD的先导化合物的筛选方法以及在药物制剂中使用这些化合物或先导化合物的化学衍生物以在需要的对象中治疗或预防AD的方法。鉴定治疗物质的一种所述筛选方法可包括将AD患者的样品细胞与本文筛选的物质接触，然后确定PKC指数。逆转或改善AD PKC指数值回复到非AD对照细胞中所见水平的试剂会被鉴定并选为可能用于治疗或预防AD的物质。
如本文所用，“先导化合物”是用本文所述筛选化合物的方法鉴定的化合物。先导化合物可具有将本文所述阿尔茨海默病特异分子生物标记(即PKC指数)转变为与本文所述试验中非阿尔茨海默病细胞所计算的那些值对应的数值的活性。随后先导化合物可经化学修饰以优化或提高其活性从而在治疗或防止阿尔茨海默病的药物组合物中应用。
由于不可能直接接触活人脑内的神经元，阿尔茨海默病的早期诊断极度困难。通过测定本文所述阿尔茨海默病特异性分子生物标记，本发明提供用于早期诊断阿尔茨海默病的高度实用、高度特异和高度选择性的测试。此外，本文所述阿尔茨海默病特异性PKC指数提供跟踪疾病发展和鉴定候选治疗剂的基础，用于靶向治疗和预防阿尔茨海默病的药物开发。
本发明的一个巨大优势为用于本文所述试验和方法的组织可用最小侵入性方法获自对象，即不用脊椎穿刺。
实施例
实施例1：阿尔茨海默病外周细胞中的异常PKC同工酶加工
原理：PKC信号通路调控学习能力和记忆以及阿尔茨海默病(AD)的神经变性病理生理中重要的分子事件。已显示在死后脑中、AD患者的皮肤成纤维细胞和血液样品中缺少PKC同工酶的诱因作用。PKC-α和PKC-ε直接或间接通过Erk的磷酸化来调控负责α、β和γ分泌酶的翻译后加工的所有主要途径，其控制Aβ的生成。Aβ治疗对PKC-α和PKC-ε同工酶的效应相较PKC-γ更厉害。用PKC-γ作为内标检测数种诊断方法。本发明涉及用外周组织从年龄匹配的对照(AC)病例和其他非AD痴呆病例中诊断AD的方法。这些方法可用于筛选在治疗或预防AD中使用的化合物。
细胞样品。本发明的方法中所用的样品如下：
(1)10AD，10AC，10非AD痴呆
(2)90％融合的皮肤成纤维细胞；
(3)处理：24小时，1μM Aβ(1-42)。
皮肤成纤维细胞取自两种不同来源：(A)新鲜获得的皮肤成纤维细胞新鲜皮肤成纤维细胞获自BRNI附属机构注册处和约翰霍普金斯大学(Johns HopkinsUniversity)和其附属中心，和(B)购自科里尔医学研究所(Coriell Institute forMedical Research)(新泽西州卡姆登)的人皮肤成纤维细胞库。来自新鲜获得的皮肤组织的成纤维细胞的收集和培养如下进行：由合格人员从AD、非AD痴呆患者和年龄匹配的对照中获取穿孔活检皮肤组织样品。简单地说，所述皮肤组织(活检样品)的外部角质层在用冷盐水溶液彻底漂洗后去除。所述组织的剩余部分切碎为小块(约1mm)。所述块存于在T-25(25平方厘米)细胞培养瓶。细胞用数小时粘附培养瓶表面。含45％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的3mL DMEM培养液小心加入所述培养瓶中并置于5％CO2和37℃培养箱中持续3天。3天后，加入5mL额外培养基。所有培养瓶定期检测，7-10天后其变为融合。用胰蛋白酶消化细胞并根据其数量扩增。细胞传代总数不能超过16。来自AD患者和年龄匹配对照的成纤维细胞库在具有含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基的T25/T75培养瓶中维持并培养。细胞传代总数不能超过16。
Aβ肽处理。来自AD和对照患者的成纤维细胞细胞系在达到90-100％融合后用溶于含10％胎牛血清的DMEM培养基中的1.0μM Aβ(1-42)(加利福尼亚州萨尼维尔的美国多肽公司(American Peptide Company))在5％CO2和37℃培养箱中处理24小时。与1.0μM Aβ(1-42)孵育24小时后，移除培养基并用常规无血清培养基清洗3次并存放16小时。
检测PKC同工酶：下述试验中所述的PKC同工酶通过Western印迹(免疫印迹)检测。
试验1：PKC-α、PKC-γ和PKC-ε
试验2：p-PKC-α、p-PKC-γ和p-PKC-ε
试验3：PKC移位
蛋白提取如前所述进行(Favit等，PNAS，1998，同上)。简单地说，在含0.1MHEPES、0.04M EDTA、0.8M蔗糖、0.01M苯甲基磺酰氟(PMSF)、2.4单位/毫升抑肽酶、和1％SDS的均质缓冲液中重悬团块并超声处理(超声匀化器，科尔帕默公司(Cole-Parmer))。按照常规方法测定蛋白质浓度。粗提取物置于4℃，然后进行免疫印迹分析。
对于Western印迹分析，SDS/PAGE在1.5-mm厚的10％丙烯酰胺梯度凝胶(圣迭戈的英杰公司(Invitrogen))中进行。粗匀浆用含0.5M TrisHCl(pH 6.8)、10％甘油、2％SDS、和0.5％2-巯基乙醇的样品缓冲液平衡至终体积20mL，总蛋白浓度为10μg/ml。所述样品进行电泳并过夜转至硝基纤维素纸上(英杰公司)。所述硝酸纤维素用1％BSA/95％TBS封闭1小时，然后用不同PKC同工酶单克隆抗体(PKC-α、PKC-γ、和PKC-ε；肯塔基州列克星敦的转导实验室(TransductionLaboratories))孵育1小时。然后印迹用抗小鼠碱性磷酸酶-偶联抗体(西格玛公司(Sigma))孵育1小时。最后，所述硝酸纤维素用含0.1M TrisHCl(pH 9.6)、0.001M MgCl、1％硝基氮蓝四唑(皮尔斯公司(Pierce))、和1％5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐甲苯胺盐(皮尔斯公司)的溶液染色。所有反应在室温下进行。免疫印迹在平坦的扫描仪上数字化并如下定量分析：
分析1；总PKC
本试验的结果如图1所示。可看出AD患者细胞中的PKC-α指数显著低于获自非AD对照对象的PKC-α指数。
Figure BPA00001563867200142
分析2；磷酸-PKC
Figure BPA00001563867200143
Figure BPA00001563867200144
将本申请引用的专利、专利申请、发表物、产品描述和实验方案通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims (26)

1.一种确定候选对象有或没有阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：
i)确定有和没有Aβ肽时候选对象的外周细胞中第一PKC同工酶的蛋白水平，生成第一比例；
ii)确定有和没有Aβ肽时候选对象的外周细胞中第二PKC同工酶的蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二PKC同工酶在AD细胞中相较非AD细胞是否受Aβ肽的差异调节未知；
iii)通过所述第一比例除以第二比例生成PKC同工酶指数，其中约1.0或更低的PKC同工酶指数表示诊断有阿尔茨海默病，而大于1.0的PKC同工酶指数表示没有阿尔茨海默病。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC同工酶指数用下式I表示的稳定状态水平的PKC同工酶生成：
其中“x”代表所述第一PKC同工酶、“z”代表所述第二PKC同工酶、且Aβ代表与Aβ肽接触的细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC同工酶指数用下式II表示的磷酸化水平的PKC同工酶生成：
Figure FPA00001563867100012
其中“x”代表所述第一PKC同工酶、“z”代表所述第二PKC同工酶、且Aβ代表与Aβ肽接触的细胞、且p-PKC-x和p-PKC-z代表磷酸化的PKC同工酶。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括存在PKC激活剂时确定步骤i和ii中所述第一和第二PKC同工酶的蛋白水平。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-α且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-ε且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-α且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-ε且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-α且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-ε且所述第二PKC同工酶是PKC-γ。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Aβ肽是Aβ(1-40)或Aβ(1-42)。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外周细胞是皮肤细胞、皮肤成纤维细胞、血液细胞或口腔颊粘膜细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述外周细胞是皮肤成纤维细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Aβ肽以约1.0nM-10μM的浓度存在。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述Aβ肽以约1.0μM的浓度存在。
16.一种监控对象阿尔茨海默病发展的方法，所述方法包括：
i)按照权利要求1所述的方法在第一时间点从测试对象的外周细胞中生成PKC同工酶指数以获得所述对象的参考PKC同工酶指数，其中所述测试对象已被诊断患有阿尔茨海默病；
ii)在第一时间点后的一个或多个时间点从相同对象的外周细胞中生成同样的PKC同工酶指数；
iii)确定获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数是否降低；
其中获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数降低表明阿尔茨海默病的发展。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述测试对象在所述第一时间点已被诊断为早期阿尔茨海默病。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述测试对象在所述第一时间点已被诊断为轻度阿尔茨海默病。
19.一种监控对象从非阿尔茨海默病症向阿尔茨海默病发展的方法，所述方法包括：
i)按照权利要求1所述的方法在第一时间点从测试对象的外周细胞中生成PKC同工酶指数以获得所述对象的参考PKC同工酶指数，其中所述测试对象未被诊断患有阿尔茨海默病；
ii)在第一时间点后的一个或多个时间点从相同对象的外周细胞中生成同样的PKC同工酶指数；
iii)确定获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数是否降低；
其中获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数降低表明向阿尔茨海默病的发展。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病症是轻度认知障碍。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述轻度认知障碍是健忘认知障碍。
22.一种药盒，所述药盒含：一种或多种Aβ肽；至少一种对PKC同工酶特异的抗体，已知所述PKC同工酶在AD细胞中相较非AD细胞受到Aβ肽的差异调控；至少一种对PKC同工酶特异的抗体，所述PKC同工酶在AD细胞中相较非AD细胞是否受到Aβ肽的差异调控未知；和用于确定PKC同工酶指数的说明。
23.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述Aβ肽是Aβ(1-40)或Aβ(1-42)。
24.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述已知在AD细胞中受到Aβ肽差异调控的PKC同工酶为PKC-α。
25.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述已知在AD细胞中受到Aβ肽差异调控的PKC同工酶为PKC-ε。
26.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述在AD细胞中是否受到Aβ肽差异调控未知的PKC同工酶为PKC-γ。
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