CN102741425A - 癌症和高度增生的自动检测方法 - Google Patents

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Abstract

检测生物样品中癌症和相关增生的自动方法。

Description

癌症和高度增生的自动检测方法
发明背景
相关申请交叉引用
本PCT申请要求2009年3月10日提交的，申请号为12/400,975的美国专利申请的优先权，该美国专利申请是2007年10月26日提交的，申请号为11/925,123的美国专利申请的部分继续申请，所述11/925,123为2007年10月25日提交的，申请号为11/924,293的美国专利申请的继续申请，所述11/924,293要求2006年10月25日提交的，申请号为60/862,974的美国临时申请优先权。该参考文献和所有在本说明书中引用的其他参考文献，以及它们的参考文献在适合用于教导额外的或备选的细节、特征和/或技术背景的情况下均通过引用的方式并入本文。
发明领域
本发明一般涉及用于检测受试者中癌症和发育异常，尤其是高度发育异常的自动方法。一方面，提供用于监测一种或更多种癌症治疗方案有效性的方法。
相关技术的描述
许多方法已知有助于样本的显微分析。例如，非限制地，已知某些染料对某些细胞或亚细胞结构具有亲和力。因此所述染料通过辅助进一步显示所述结构，可用于辅助分析。染料与所述结构的结合可以使用多种显微检测技术鉴定和分析。
细胞和组织的荧光显微术为本领域所熟知。已开发出在显微镜中使荧光细胞成像和提取所述细胞中发生的空间分布和时间变化相关信息的方法。一些上述方法及其应用由Taylor等在American Scientist 80(1992)，第322-335页的文章中有所描述。这些方法经过设计和优化，用于制备一些标本，用于细胞中荧光报告分子的分布、含量和生化环境的高时空分辨率成像测量。可采取落射荧光显微镜检测荧光信号，其使用发射的荧光形成图像(而常规反射显微镜使用散射的照明光形成图像)。落射荧光显微镜的激发光用于激发样本中的荧光标签，使其发射荧光。落射荧光显微镜的优点在于，制备好的样本中，荧光分子优先附着在感兴趣的生物结构上，使该感兴趣的生物结构得以鉴别。
生物样本的自动显微分析方法改进了诊断程序，优化了基于显微镜的诊断设备中的样本通量。以下更全面描述的多个共同拥有的美国专利申请公开了用于自动显微分析的设备和方法的方面和实施方案，包括整合的机器人显微镜系统，动态自动显微操作和载玻片扫描系统，多种可互换的物镜，滤镜和适于在自动显微镜系统中使用的类似元件，适于在自动显微镜系统中使用的自动显微镜载物台，适于在自动显微镜系统中使用的自动显微镜载玻片盒和载玻片操作系统，适于在自动显微镜系统中使用的自动显微镜载玻片装载和卸载机构，应用电脑内置程序驱动对生物样本中的荧光信号进行显微检测的自动化方法，其可用于驱动自动显微镜的系统，使用电脑内置程序以驱动显微镜进行用于图像处理的FISH分析的显微镜自动化操作。
缩写词“FISH”(荧光原位杂交)指使用在被例如紫外或可见光源照射时发出特征性光或颜色的荧光标签或标记以检测染色体结构的技术。FISH使用只与与其具有高度序列相似性的染色体的那些部分结合的荧光探针，所述探针可针对特异性染色体和特异性染色体区域，必须具有足够长度以与其靶标(不与基因组中相似的序列)特异性杂交，但是不能太大而阻碍杂交过程，并且应该用荧光团直接标记。标记可以采用多种方式，例如，缺口平移和使用标记核苷酸的PCR。如果需要增强信号而超过显微镜的检测阈值(其取决于许多因素，例如探针标记效率、探针和荧光染料的种类)，可以使用以例如生物素或地高辛等半抗原标记的探针，特异性荧光标记的抗体或链霉亲和素与所述半抗原分子结合，从而使荧光增强。FISH技术可用于鉴定染色体异常和基因定位。
癌细胞中基因过表达的通常研究机制一般称为基因扩增，这是一个基因在祖细胞染色体内复制成多拷贝的过程。该过程包括含有所述基因的染色体区域无计划性的复制，随后复制片段重组返回所述染色体(Alitalo K.等.(1986)，Adv.Cancer Res.47：235-281)，结果会产生50个或更多的基因拷贝。重复区域有时称为“扩增子”，转化细胞中的基因表达水平(即产生的信使RNA量)以与产生的基因拷贝数量同样的比率升高(Alitalo等)。
与其它致癌基因，尤其是那些成神经细胞瘤致癌基因相关的工作表明，原癌基因的基因重复与更恶性癌症形式相关的事件，并可作为临床结果的预示(Schwab M.等的综述(1990)，Genes Chromosomes Cancer 1：181-193；Alitalo等)。在乳腺癌中，已有报告erbB2基因的重复与疾病复发和存活时间减低均相关(Slamon D.J.等.(1987)，Science 235：178-182)。有证据表明，erbB2有助于鉴别对使用环磷酰胺、阿霉素和氟尿嘧啶的辅助化疗有反应的肿瘤(Muss等.N EnglJ Med.1994 330(18)：1260-6)。
在乳腺癌中发生基因重复的基因中仅有一部分被鉴定出来。首先，染色体异常，例如双微(DM)染色体和均匀染色区(HSR)在癌细胞中大量存在。HSR是在染色体组型分析中全长显现中等密度吉姆萨染色，而非常规的明暗交替带纹的模式，它们对应于多基因重复。HSR在乳腺癌中尤其丰富，在所调查的肿瘤中最高达60-65％都有出现(Dutrillaux B.等.(1990)，Cancer Genet Cytogenet49：203-217；Zafrani B.等.(1992)，Hum Pathol23：542-547)。当使用任意16个已知人致癌基因(包括erbB2和myc)的探针，通过原位杂交检测所述区域时，仅有一部分肿瘤显示了与HSR区域的任意杂交。而且，每个染色体组型中只有一部分HSR被牵涉。
第二，比较基因组杂交(CGH)已经揭示肿瘤中拷贝数量的增加的存在，即使是在HSR外的染色体区域。CGH是一种新方法，其中使用两种不同荧光染料对具有来自正常细胞和癌细胞的DNA片段的全长伸展染色体进行同时染色。图像经电脑处理，计算荧光比率，表明癌细胞中发生扩增或缺失的染色体区域(Kallioniemi A.等.(1992)，Science 258：818-821)。该方法最近被用于15种乳腺癌细胞系(Kallioniemi A.等.(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2156-2160)，在所有23对染色体中均检测到DNA序列拷贝数量的增加。
So，C-K等(Clinical Cancer Research 10：19-27，2004)发现在来自中国林州(林县)的食管鳞状细胞癌样本中，环AMP反应元件结合蛋白(CBP)，一种核转录辅激活蛋白，发生内部串联重复。So等表示，CBP基因的内部串联重复在人鳞状细胞癌中是频发的遗传事件。
人表皮生长因子受体2(HER-2)/neu(c-erbB-2)基因定位于染色体17q，编码作为表皮生长因子受体(EGFR)或HER家族成员的跨膜酪氨酸激酶受体蛋白质(Ross，JS等，The Oncologist.第8卷第4期，307-325，2003年8月)。HER-2基因在一部分，可能人乳腺癌的25％中发生扩增。
荧光原位杂交(FISH)常用于检测染色体异常，包括序列改变，例如在致癌基因中发现的单核苷酸多态性或突变。
已经公开许多用于筛查癌症和发育异常，例如高度发育异常的方法和试剂盒。
例如，由Abbott Molecular制造的Pro Vysion多色探针组设计用于检测和定量8号染色体，位于8p22的脂蛋白脂酶(LPL)基因和位于8q24区域的C-MYC基因。8q24和8p21-22(LPL)的增加以及杂合性缺失为两种在异常样本中观察到的遗传变异。ProVysion多色探针组由具有三种独立荧光团标记的三种探针组成。据称多色探针组被设计用于同时分析单个细胞中的三个基因组标志物：用SpectrumAqua标记的CEP
Figure BPA00001482445300041
8探针、用SpectrumOrange标记的LSI LPL和用SpectrumGreen标记的LSI C-MYC。CEP 8α卫星DNA探针与8号染色体的着丝粒区域(8p11.1-q11.1)杂交，提供了用于鉴定8号染色体拷贝数的机制。LSI LPL大小为约170kb，与8p22上的LPL基因杂交。LSI C-MYC探针(约750kb探针)与位于8q24的C-MYC基因杂交。制造商声称，在与ProVysion多色探针组杂交的正常细胞中，预期的模式是两个橙色、两个绿色和两个浅绿色信号(2O2G2A)信号模式，而在异常细胞中，可观察到三种探针信号拷贝的组合。检测试剂盒指示，多于或少于两个任意探针的拷贝数分别表明染色体或基因的增加或缺失。相对于CEP 8的拷贝数，少于两个拷贝的LSI LPL或LSI C-MYC探针的多重拷贝分别表明相对于8号染色体拷贝数，LPL区域的缺失和C-MYC区域的增加。
Vysis公司的公开号为2004/028107和2005/0026190的美国专利要求保护使用探针和探针组在子宫颈细胞中检测高度发育异常和癌的方法。该方法需要使一个或更多个染色体探针与生物样本杂交，并检测染色体探针的杂交模式，以确定受试者是否患有高度发育异常或癌症。该方法包括使用一个或更多个探针的组，其矢量值(vector value)为约60或更少，其中矢量值如下计算：矢量值＝[(100-特异性)2+(100-灵敏度)2]1/2。所述染色体探针可包括用于特异性基因座，例如8q24、3q36、Xp22和CEP15的探针，或者例如与HPV-16、HPV-18、HPV-30、HPV-45、HPV-51和HPV-58中每一个的全编码序列基本互补的探针。待筛查的生物样本可以预筛查细胞周期蛋白质的存在，例如p16或CyclinE，或细胞增殖标志物，例如Ki67或PCNA。
Abbott Molecular公布号为2006/0063194的美国专利也公开了探针组，以及使用探针和探针组检测癌症，尤其是肺癌的方法。基因座特异性探针和染色体计数探针联合使用，其杂交模式用于确定受试者是否患有肺癌。确定出染色体组分，例如，用于确定肺癌的探针组可包括5p15基因座特异性探针、8q24基因座特异性探针、6号染色体计数探针和7p12基因座特异性探针。
诊断性FISH光点计数已由熟练的显微镜技术人员常规手工操作，除了正确地鉴别点及其颜色外，其它的大小和形状特征必须进行分类，以正确地鉴定染色体状态。由于该现象影响造成的时间紧迫使得分析更加困难，因此，显微镜技术人员必须接受训练以实施该项检测。即使在最优条件下，该方法也是单调、冗长并易受人为错误影响。
自动显微镜检测的应用具有克服手动操作多种缺点的潜质。自动化显微镜能够可靠地鉴别样本中的荧光点，准确地确定其颜色，基于形状和大小对其分类，并进行必要的概要分析以确定目标状态的存在与否，而不受操作人员在所有适时操作中所引入的不可避免的主观因素影响。
值得注意的是，用于检测癌症的试剂盒通常被设计仅用来提供阳性或者阴性的答案——是否患有特定的癌症。虽然这样的检测表明需要例如化疗的干预疗法，但其并不被设计为指导人们采取最适当的干预疗法。相反地，癌症患者经常接受多重疗法，并且疗效只能由治疗开始后多个时间点的癌症状态的快照(snap-shots)确定。这样的快照需要例如用MRI和CAT扫描身体，以确定肿瘤的生长或缩减。由于所述快照方法需要一定的经济成本，其本身也存在风险(如辐射暴露)，这样的快照能以比考虑到快速干预以解决疾病状态的需要所期望的时间更长的时间间隔进行。如下文所提出的，本发明人还认识到，使用自动显微镜检测不仅可有利地用于确定某人是否罹患特定的癌症/增生进行，还可作为监测工具，以确定针对癌症/高度增生的治疗的不同干预治疗手段的效果。在一个实施方案中，疗效监测通过监测体循环(包括血管和淋巴系统)中的癌症/增生细胞，癌症/增生相关异常细胞数量的减少视为治疗成功的指示，所述细胞减少程度被用作一种疗法相对于另一种疗法的效能的度量。
本领域需要对用可检测的标记探针，包括荧光标记探针处理的癌组织样本进行自动成像和图像分析。此外，还需要对上述标记样本进行便捷、快速、非手工的自动荧光显微检测。
发明简述
本文公开了多种实施方案。
在一个实施方案中，一种筛查受试者中病变的存在和/或程度的自动方法，所述病变的特征在于受试者细胞中的异常染色体成分，其包括以下步骤：
a)使来自所述受试者的包含细胞核的生物样本与针对至少一种表现异常特征的染色体序列的一种或更多种可区分的标记探针接触，所述接触在促进所述一种或更多种探针与所述至少一种序列杂交的条件下进行；
b)自动获得所述一种或更多种与染色体序列杂交的可区分的标记的表现(representation)；
c)自动分析所述表现中一种或更多种标记结合的分布和强度，以确定异常染色体成分的存在和/或程度；和
d)自动报告步骤c)的分析结果；
其中步骤b)至d)在无人干预下实施。
在筛查方法的多个其它的实施方案中，自动显微镜系统实施自动获得表现、自动分析结合和自动报告结果中的一个，并且通常是所有的步骤。在该方法中，获得表现和实施自动成像分析鉴定病变特征性的核酸性质。多种靶向的染色体异常可包括单核苷酸多态性(SNP)、突变序列，重复的基因或其部分。在一个实施方案中，靶向的染色体基因座(单种或复数种)在TERC和PIK3A序列附近的800kb区域内，探针的染色体靶标包括人3号或7号染色体的着丝粒或靶序列，以及全部或部分TERC基因。在一个实施方案中，靶向的染色体基因座(单种或复数种)为PIK3A序列，该靶向的染色体基因座(单种或复数种)也可位于TERC和/或PIK3A基因或其部分的5′和3′附近区域。在另外的实施方案中，对照探针针对7号和/或3号染色体着丝粒区域，在该实施方案中，每个细胞核的7号和/或3号染色体的对照计数为2个信号，针对靶向的染色体异常的探针的4个，优选5个或更多的计数表明高度增生或癌症。
在另外的实施方案中，可使用多种针对已知不是异常的染色体基因座的参照探针或参照染色剂，以使获得表现和分析步骤以参照探针或染色剂为参照。
在另外的实施方案中，筛查受试者中与癌症、高度增生或高度发育异常相关异常的自动方法包括以下步骤：
a)从受试者中获得包含细胞核的生物样本；
b)在促进探针与靶向的染色体基因座杂交的条件下，使样本中的细胞核与第一探针接触，该第一探针具有针对异常相关的染色体序列的第一可检测标记；
c)在所述杂交条件下，使样本与针对已知不是异常的染色体基因座的可检测地标记的参照探针和参照染色剂中的至少一种接触；
d)使结合于染色体序列的标记自动成像，并使染色剂(如使用)成像；
e)自动分析图像中杂交标记和染色剂(如使用)的分布和强度；和
f)自动报告步骤e)的分析结果；
其中步骤d)至f)在无人干预下实施；
从而提供对受试者异常的评估。
在所述筛查方法的实施方案中，在接触步骤之前，从样本中分离细胞核，并将其沉积形成一层细胞核。在进一步的实施方案中，自动显微镜实施自动成像、自动分析和自动报告结果中的至少一个，并且通常是所有的步骤。该单层细胞核可由本领域已知的多种方法制备，例如对得自石蜡包埋的肿瘤组织样本的薄切片进行适当加工。在该方法中，获自受试者的样本可从多处来源获得。在该筛查方法的其他实施方案中，自动显微镜在该方法的多个阶段使用，包括自动提供图像，经显微镜自动优化图像发生的视野后获得图像，从样本视野中的两个或更多个平面获得图像以实施对图像的自动分析。在多种实施方案中，异常可为癌症、高度增生或高度发育异常。由探针靶向的多种异常可以包括单核苷酸多态性、突变的序列、重复的基因或其部分。另外，在某些实施方案中，探针靶向3号或7号染色体的着丝粒，或包含TERC基因或其部分的序列。
在另个实施方案中，公开了在治疗患者中的癌症或高度增生期间，监测随时间推移的治疗功效的自动方法，该方法包括以下步骤：
(a)自患者获得流体生物样本，其中含有与癌症或高度增生相关的细胞；
(b)用一种或更多种可检测地标记的染色体探针处理流体生物样本或其部分，所述探针对一个或更多个染色体基因座具有高度序列相似性，所述染色体基因座或其扩增与癌症或高度增生相关，其中所述处理在足以使探针与样本中的染色体杂交的条件下实施；
(c)自动扫描经处理的流体生物样本，检测一个或更多个结合于一个或更多个染色体探针的标记，所述探针与样本中的任意染色体杂交；
(d)自动检测与杂交至所述染色体探针的染色体相关的细胞数量；和
(e)在疗程的不同时间自动比较步骤(c)和(d)中提供的标记杂交模式和细胞数结果，从而评估所述治疗在治疗癌症或高度增生中的疗效。
在不同实施方案中，流体生物样本包括血液、淋巴、尿液、渗出液、上皮碎屑、灌洗液、生物流体、一种或更多种活组织检查样本、手术切除样本涂片(例如来自子宫颈)、口腔粘膜涂片、抽吸液、唾液、痰和组织的一种或更多种。
在一个实施方案中，以1天或更长的时间间隔实施监测。在监测疗效的该方法的其它实施方案中，自动显微镜系统进行至少一次自动扫描，该自动检测使用自动显微镜系统，还自动优化样本扫描的视野，并在样本视野中的两个或更多个平面进行扫描。在多种实施方案中，自动显微镜系统在无人干预下操作。在另一些实施方案中，探针靶向单核苷酸多态性(SNP)、突变的序列、重复或扩增的基因或其部分、3号染色体着丝粒、7号染色体着丝粒、包含TERC基因或其部分的序列中的至少一种。
在更进一步的实施方案中，公开了用于染色体异常的自动高通量表征方法。该方法包括以下步骤：
a)提供至少一块其上包含生物样本的显微镜载玻片，其中所述样本疑似具有染色体异常，且其中所述样本已与至少一种特异于检测异常的可检测地标记探针杂交；
b)将所述至少一块包含样本的载玻片在用于自动、可翻转放置载玻片的装置中安装于自动显微镜载物台上；
c)使所述放置装置自动化、可翻转地将包含样本的载玻片可翻转地放置于显微镜载物台上；
d)使显微镜自动获得标本的至少一个图像，其中所述图像包括与染色体杂交的标记探针的表现；
e)使显微镜自动分析图像，以表征异常；
f)自动报告步骤(e)的分析结果；和
g)自动重复步骤(c)至(f)。
在多种实施方案中，自动显微镜在无人干预下运行。在该高通量方法的其它实施方案中，自动化显微镜通过优化图像产生的视野，自动获得图像，并从细胞核视野的两个或更多个平面获得图像。生物样本可来源于任意不同的组织和生物流体。此外，异常可为癌症、高度增生或高度发育异常。由用于高通量方法中的探针靶向的各种异常可包括单核苷酸多态性(SNP)、突变的序列、重复的或扩增的基因或其部分、3号染色体着丝粒、7号染色体着丝粒、包含TERC基因或其部分的序列中的至少一种。
再一个实施方案公开了一种方法，其按顺序包括：(a)在足以使探针与样本中的染色体(如果有的话)杂交的条件下，使与一个或更多个部分的染色体物质具有高度序列相似性的一个或更多个染色体探针与生物样本杂交，所述探针的特征在于用一个或更多个可被检测器检测的标签标记；(b)自动扫描生物样本，并用检测器检测与杂交至样本中任意染色体的一种或更多种染色体探针相关的一个或更多个标签；和(c)自动报告用杂交探针和与染色体相关的特定探针标记的样本中染色体(如果有的话)。
此处公开方法的多种实施方案中，着丝粒探针可针对已知具有基因座的染色体，该基因座的重复或存在与特定的癌症状态相关。例如，着丝粒探针可针对3号和/或7号染色体。针对单拷贝序列的基因座特异性探针同样可与癌症相关基因座，例如3号染色体q臂上的基因座杂交。在足以使探针与样本中的染色体杂交的条件下，探针本身可有利地与基因座相关的一个或更多个部分的染色体物质具有高度序列相似性，所述基因座或其扩增与特定癌症/增生相关。探针，例如可以是由四个包含染色体3q26位上TERC基因的重叠BAC克隆组成的重叠群。可将另外的着丝粒或基因座特异性探针添加至探针混合物中。核染色可采用复染方法，核染色剂可以是，例如DAPI。在自动扫描样本时，可将样本装载到视野自动切换的自动显微镜上。显微镜可被程控或者可操作化地配置为允许监测若干信号通道。例如，自动显微镜可在DAPI和其它荧光通道扫描(以便对例如3号染色体信号、3q上的基因座信号，以及其它着丝粒或基因座特异性信号计数)。扫描的细胞核可由自动显微镜自动记录，和/或被提交给细胞遗传学者和/或病理学者，或其它医疗服务人员。提交方式多种多样，例如以分类的方式，首先提交具有异常计数的对象(如首先提交计数不等于2的3q)。可以检测不同的癌症，例如宫颈癌(使用例如用于3号和/或7号染色体的着丝粒探针，以及用于3号染色体q臂上的单拷贝序列的基因座特异性探针，其包括由四个含有位于染色体3q26上的TERC基因或其部分的重叠BAC克隆组成的重叠群，DAPI核复染，然后计数3号染色体信号、3q上基因座的信号，找出3q相关信号不为2的异常计数)。
上述实施方案中的自动扫描可例如通过自动显微镜来实施，其中将生物标本放置在载玻片上，其通过手工或自动化装载在显微镜载物台上，并自动扫描载玻片。上述系统中可用的自动显微镜如同在申请人其它的专利申请(参见下文)中所描述的。生物样本也可放置在其他基质上/内进行扫描。扫描可包括扫描生物样本的一个或多于一个平面，例如两个、三个或更多。通过在多个平面扫描，可显著改善对就样本中细胞总量而言较少的异常细胞的检测。探针可采用FISH探针，其荧光信号由检测器检得。探针可在有或没有另一个输入信号下产生信号，例如它们可为放射性的，或被激发信号(例如适合波长的光或其它电磁辐射)撞击时发出荧光。探针可针对不同的重复相关的癌症基因座，并且可包括不同的荧光标签，以产生不同的信号。可依据由标签产生的信号选择检测器，如用于检测荧光标签的荧光检测器，其可操作化地配置为可以检测由荧光标签产生的特定荧光信号。报告可包括与特定染色体相关的特定标签的简单报告，和/或可以包括自动诊断报告(表明与染色体的特定杂交模式相关的癌症类型)。与正常标本比较的矢量值可选定小于特定阈值，例如小于约60，小于约40，小于约30，小于约20，小于约10或小于约0.500。有用的系统可包括同时，或在相对短的时间间隔内(如小于1分钟)，完成多信号通道的自动扫描和检测。可对系统进行可操作化地配置，以同时或并行(或其混合)的方式，实时处理多信号中的每个信号，实现染色体区域和/或代表一种或更多特定癌症/增生的区域性重复的快速检测。
附图说明
附图1是宫颈癌诊断方法的流程示意图。
发明详述
这里使用的“标签”和“标记”同义地指与探针缀合，并使该探针可被特定检测方法和方式检测的部分。
这里使用的“探针”一般指特异性设计以结合细胞靶标，而不与非靶标细胞部分或结构显著结合的物质。在几个实施方案中，探针可为核酸、聚核苷酸或寡核苷酸，其序列与细胞染色体或其它的核酸中的靶序列充分互补，在适当的条件下与其杂交。在多种其它实施方案中，探针可为带有特异性地靶向细胞结构的特异性决定结合部位的抗体或其部分。
这里使用的“表现”一般指表征使用特定检测方法检查生物样本所得结果的任何视觉、图形、数字信息或类似的信息集合。通过非限制性实施例，表现包括：含有至少一部分生物样本的显微镜视野的图像，例如通过电脑驱动的方式将附带颜色值的信息转变为视野中特定特征的进一步修饰的图像，表征来自样本图像的特定特征的图象显示，表征来自图像特征的数值或语言条目的表格。
这里使用的“靶标”、“被靶向”、“靶向”和类似的词或短语一般指探针特异性针对的细胞结构。靶标是探针和靶标组成的特异性结合对的成员的任意结构或成分。探针和靶标具有相互结合的高特异性和亲和力，而对于不意图被识别的探针或靶标分别具有低特异性和低亲和力。对于包括核酸或至少特异性碱基序列的探针而言，靶标是在细胞的染色体或核酸成分中的互补序列。对于为抗体或其特异性结合片段的探针而言，靶标可以是细胞中的抗原或半抗原结构。在该框架下，探针是“靶向”部分，而靶标结构被探针“靶向”。
这里提供了利用信号自动检测来检测和监测癌症和增生，尤其是高度增生的系统和方法。
在有代表性的实施方案中，将生物样本用具有可检测标签的一种或更多种染色体探针进行质询(interrogate)。所述染色体探针可选择和/或配置为与对指示癌症或增生，例如高度增生相关的成分的一个或更多个部分的染色体物质具有高度序列相似性。所述探针可选择与染色体上某区域相关，所述区域指示癌症/增生或其扩增与癌症/增生相关。例如，染色体上的特定基因座的多重重复可为癌症/增生的指征。有利地，探针上的标签直接或间接(如通过将另一个可检测的分子结合至标签的一部分)地可检测。在一种情况下，标签是荧光的，例如在FISH(荧光原位杂交)中。为了促进标记的探针和染色体物质上的感兴趣基因座之间的杂交，杂交应该在可充分杂交的条件下实施。在这样的实施方案中，用可检测标签的检测器自动扫描样本。自动扫描可由经可操作化配置，在多个视野搜寻样本的自动显微镜进行，无需人为干预。将标签与特定的染色体关联的能力，使得人们能够确定杂交特性是否可指示癌症或增生，例如高度增生。这样的关联可以确定癌症/增生是否可能存在。可选地，上述实施方案的系统可包括例如软件、硬件或软件/硬件组合的装置，用于自动报告样本中用杂交探针标记的染色体和与染色体相关的特定探针。作为自动显微镜系统的一部分，基于杂交的自动诊断也可提供。
在另一个有代表性的实施方案中，提供监测治疗癌症或增生，例如高度增生的疗效的方法和系统。可随着时间的推移实施监测，以便在患者接受治疗时跟踪治疗方案的效果。在这样的实施方案中，易于获得的流体样本，例如血液、淋巴、渗出液、灌洗液或抽吸液从接受癌症和/或增生治疗的患者中获取。这样获得的任何样本均具有有核细胞，包括疑似具有癌症或高度增生特征性的可检测的染色体异常的细胞。然后用与染色体物质中的特异性基因座或部位杂交的染色体探针处理样本，例如，以检测与由流体样本包含的异常样本相关的扩增。可选地，可使用针对不同基因座的多重探针，其中两个或更多个所述基因座与特定的癌症/增生相关。这样的组合的使用可以改善癌症/增生的检测效率。有利地，用不同的标签，例如不同的荧光标签标记上述多重探针。选择标签以使可被与自动扫描装置，例如自动显微镜相关联的检测器读取，自动显微镜可操作化地配置以便在无人干预下重复观察样本的不连续区域。通过检测与杂交至样本中染色体的一个或更多个染色体探针相关的标签，检测者可确定是否见到指示癌症/增生的杂交模式。通过自动检测与用染色体探针杂交的染色体相关的细胞数量，可改善检测效率。即，通过判断指示异常染色体组的流体中的细胞数量是否比在较早前看到的细胞数量少或多，检测者可判断正在使用的治疗对于癌症/增生的治疗是否有效。因而，针对特定癌症的特定疗法的疗效基于随着时间推移在生物样本中检测到的细胞数量的变化。例如，如果治疗后比治疗前所见细胞减少，可确定该治疗是有效的。也可通过循环异常细胞的减少程度比较不同的疗法。
作为方法的变型，提供用于监测治疗癌症或增生的疗效的方法和系统，患者无需前往医疗机构或医院便可提供样本。例如，可向患者提供试剂盒、系统或类似的设备，以获取血液样本，并利用此处描述的方法进行后续分析。在这样的非限制性实例中，采集小体积的血液样本，例如一滴或数滴，可选地进行处理以防止凝集，可选地将其沉积在载玻片上，或保持于适于随后分析的状态。收集所述样本的安排可包括每天取样，或每隔一天取样，或每周两次，或每周一次，或每两周一次，或每月一次，或更长的时间间隔。样本可以储存在干燥的腔室内，也可以在等待运输或转运，以及后续分析时将样本冷藏或冷冻。
在有代表性的实施方案中还描述可用于检测与染色体3q的扩增相关的癌症/增生，例如高度增生的系统/方法。在一个实施方案方法中，制备用于分裂间期FISH杂交的单层细胞核。例如，可对来自石蜡包埋的肿瘤组织样本的薄切片进行适当加工，以提供核涂片，从而获得细胞核层。然后用3号或7号染色体的着丝粒探针对核涂片染色。在此之后、之前或同时，也可用3号染色体q臂上的单拷贝序列基因座特异性探针对核涂片染色，该序列指示感兴趣的癌症/增生状态。例如，探针可以是由四个包含染色体3q26位上TERC基因或其部分的重叠BAC克隆组成的重叠群。可将其它的着丝粒或基因座特异性探针加至该探针混合物中。在一个有利的方面，每种探针用不同的荧光染料标记，以便更容易地检测不同的信号。可选地，可用核染色剂，例如DAPI复染涂片。然后将染色的涂片应用于自动扫描装置，例如自动显微镜，并且在DAPI和所需的许多荧光通道中自动扫描，以计数3号染色体的信号，3q上基因座的信号和任意其它着丝粒或基因座特异性信号。扫描的细胞核可提交给专业医疗服务人员，例如细胞遗传学者或病理学者进行评估。结果可以以分类的方式提交给专业医疗服务人员，例如，首先提交具有3q相关信号异常计数(如不等于2)的细胞核。可选择地，或联合地，该系统可进行可操作化配置(如通过程序)，以基于预先程序化的运算法则(例如)分析扫描的核，并且向医疗服务人员提供自动诊断指示。这样的检验可用于检测多种癌症，包括宫颈癌。
用于实施生物样本的显微分析的自动设备和方法可改进诊断程序，优化基于显微镜的诊断设备中的样本通量。在2007年8月2日提交的共同拥有的美国专利申请11833203中，描述了一种机器人显微镜系统。其公开了一种沿着第二表面的可置换的集成显微镜系统，其包括安置在不透光的外壳中的自动机器人显微镜系统。在该系统中，所述自动机器人显微镜系统包括(i)有载物台的显微镜；(ii)可定位在载物台上的至少一块标本载玻片；(iii)照射载玻片的光源；(iv)捕捉标本图像的图像捕捉装置；和(v)与所述标本载玻片、光源和图像捕捉装置联通并控制其定位的电、电子和/或电脑驱动的装置。此外，在该系统中，不透光的外壳包括壳内至少一块搁板，其中所述自动机器人显微镜系统被放置在搁板上；以及能够显示被观察或分析的显微视野的图像或表现的观察监视器，其放置在从外壳外部的位置可见的所述外壳表面。
参见附图1，其呈现了一种生物样本宫颈癌细胞的自动筛查方法的实施方案。获得一个包含从受试者中获取的带有细胞核的生物样本的载玻片(步骤10)，所述生物样本先与具有针对7号染色体的第一可检测标记的第一细胞核着丝粒探针接触(步骤20)，再与具有针对3号染色体q臂上的单拷贝序列的第二可检测标记的第二细胞核非着丝粒探针接触(步骤30)，其中所述单拷贝序列包括四个包含染色体3q26位上至少部分TERC基因的重叠BAC克隆的重叠群序列，并以DAPI复染。所述第一和第二探针在促进每个所述第一和第二探针与各自染色体基因座杂交的条件下接触。然后定位包括细胞核在内的DAPI染色区域(步骤40)，确定第一和第二探针的存在(步骤50)，对每个细胞核区域中所述第一细胞核着丝粒探针和第二细胞核非着丝粒探针的标记进行定量(步骤60)，每个细胞核中可检测两个第一探针标记(步骤70)，而大于或等于4个第二探针标记可作为宫颈癌细胞的阳性标识(步骤90)。如果第二探针标记少于4个(步骤80)，便为阴性标识。
在2007年8月3日提交的共同拥有的美国专利申请11833594中，描述了动态自动显微镜操作和载玻片扫描系统。公开的实施方案包括用于动态扫描安置在显微镜载玻片上的标本的自动显微镜和方法，其使用将显微镜载玻片载物台、至少一个照明能源、至少一个电子成像装置、至少一个可互换元件圆盘传送带和同步控制器组合在一起的动态扫描显微镜。作为例证的自动显微镜能显著减少实施检查所需的时间，减少系统波动，提供诊断结果。在成像过程中，载物台和滤色镜转盘匀速运动，而非如以前的方法中保持静止。每个移动子系统上的实时位置传感器准确遥测载物台安置的载玻片和滤色镜转盘的即时位置。滤色镜转盘以足够高的速度旋转，使得在每一个滤镜波长、每一个成像位置和聚焦的平面上捕捉图像。
在2007年8月2日提交的共同拥有的美国专利申请11833154中，描述了可互换的物镜、滤镜和在自动显微镜系统中使用的类似元件。该申请一般涉及远程操作的或用机器人控制的显微镜，还特异性地涉及用于自动互换的物镜集合、滤镜和/或其它光学组件的装置的机械化。公开了用于互换光路上的光学组件的仪器，其包括具有可旋转的电机轴的控制发动机；支持控制发动机的支持结构；由一般与围绕平面基座上中心点对称的外围限定的平面基座，所述平面基座包括等角设置在离基座中心等距的包含多个多个光学组件的多个固定装置，和引起平面基座围绕其中心大体对称旋转的机械装置，这样，选择的特定光学组件被定位在光束中。
2007年8月2日提交的共同拥有的美国专利申请11833183描述了用于自动显微镜系统中的自动显微镜载物台。该申请一般涉及沿着显微镜的光轴可调节地移动的显微镜载物台。例如，公开了沿着显微镜的光轴方向可调节的显微镜载玻片支架，包括基座底板；可移动地装配在所述底板上的显微镜载物台部件，所述底板可操作化地配置为允许所述部件沿着光轴方向移动；以及固定在所述显微镜载物台部件的显微镜载玻片夹持装置。
2007年8月3日提交的共同拥有的美国专利申请11833517中描述了用于自动显微镜系统中的自动显微镜载玻片盒和载玻片处理系统。该申请公开了用于移去和更换放置在载玻片盒中的载玻片的装置，所述载玻片盒含有多个经配置用于平行放置载玻片的狭槽。
2007年8月3日提交的共同拥有的美国专利申请11833428中描述了用于自动显微镜系统中的自动显微镜载玻片装载和卸载装置。作为例证的实施方案公开了显微镜载玻片操纵装置，其包括：基座结构；具有穿孔的套管，所述套管具有第一端和第二端，第二端紧扣在基座上，且套管方向与基座垂直；围绕虚构的纵轴对称的纵向杆，其以允许纵向杆在套管穿孔中轴向和纵向运动的方式，部分地被安置在套管穿孔中，纵向杆具有杆的第一端和杆的第二端，杆的第二端被安置于套管穿孔中，而杆的第一端伸出套管第一端之外，并且包括在套管虚构的纵轴的平面中的平行轨道结构；平板可滑动地安置在套管第一端上的平行轨道结构之间，平板具有第一平板端和第二平板端，第一平板端和第二平板端之一具有两个分叉的叉状构造，在每个叉子之间限定出相当于显微镜载玻片宽度的空隙区域，并且其中叉子具有紧夹结构，其可操作化地配置为以允许沿着其边缘紧夹显微镜载玻片。
在2007年8月3日提交的共同拥有的美国专利申请11833849中，公开了应用电脑内置程序驱动显微检测来自生物样本荧光信号的自动方法，其可用于驱动自动显微镜系统。其中公开的适于多个样本高通量分析的作为实施例的显微分析方法包括以下步骤：提供自动显微镜，其包括载玻片载物台、至少一个物镜、图像捕捉装置、用于依据方案操作显微镜的程控装置和用于提供分析结果的程控装置；提供其上包括样本和可质询的数据的显微镜载玻片，其中可质询的数据提供与所述样本分析方案相关的信息；质询数据；将载玻片安置于载玻片载物台上；使显微镜依据编码在可质询的数据中的分析方案分析样本；和使显微镜提供代表样本的分析结果。2007年8月2日提交的共同拥有的美国专利申请11833204中描述了在实施图像加工的FISH分析中，使用电脑内置程序驱动显微镜的显微镜自动操作，并公开了执行多种图像处理功能，可用于实施自动荧光原位杂交方法的实施方案。该实施方案包括用于在超过数字电子学动态范围的强度范围，使样本的所有区域可令人满意的成像的自动曝光方法；用于计数定位样本中靶标的感兴趣的目标物的荧光原位杂交的方法；用于分类和表征被计数的感兴趣目标物的细胞核鉴定方法；用于确定经鉴定的感兴趣目标物形状的细胞核分割方法。所述方法的实施方案用于表征细胞核或计数染色体。
前文中所述的自动显微镜系统在电脑内置和电脑执行的指令控制下运行，相应地，该系统在无人干预下实现自动检测和样本分析。自动载玻片盒和自动载玻片装载和卸载装置使得无人照顾地进行多个样本的高通量分析。
这里公开的方法针对组织标本的自动检测和分析，其细胞疑似具有在致癌过程中发生体细胞基因重复或基因扩增。该方法采用电脑驱动的图像采集，对得到的图像进行电脑驱动的分析，并以多种形式自动报告分析结果，其使该方法显著地免于人为干扰。非限制性地，报告可以以图表、表格、载玻片上视野的示意图以及类似形式呈现。报告为例如文档或记载的数字化格式，以便于本地或远程传播用于评估。由于使用本文所述的自动荧光显微镜，例如包括各种组件和软件的系统，得以对组织样本进行快速、便捷和准确的筛查。所述方法及其中所用的自动显微镜系统尤其适于对多个组织样本的高通量分析。
组织样本可来源于从疑似组织或器官产生样本的医疗或手术过程，非限制性地，包括从上皮表面刮取、手术切除上皮组织、多种活组织检查以及手术切割下的组织和器官。在非限制性实施方案中，将这样的样本固定和包埋在支持材料中，并在显微镜用薄片切片机或类似的器具中制备其组织切片，将组织切片固定在显微镜载玻片上。另外，用于分析的样本可源自活组织检查样本、血液、淋巴、尿液、渗出液、生物流体、灌洗液、抽吸液、痰和组织。
在多种实施方案中，固定于载玻片的组织切片用常规荧光染料处理，所述荧光染料利用可被适当滤光器分离的特定发射颜色的荧光探针，使染色体或核酸染色。常规染料的非限制性实例是4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用DAPI染色提供了确定细胞核或染色体位置的方式，以便电脑驱动的图像捕捉程序进一步捕捉来自FISH探针的图像。
组织标本与荧光标记的FISH探针杂交，所述探针的核苷酸序列特异性靶向基因序列，或基因序列的片段或部分，即特异性针对待靶向癌基因。当使用适当的滤镜和相关的光学组件时，用于探针的多种荧光标记在光学上可分离。核苷酸序列的特异性确保具有靶序列的标本中的所有或大部分染色体确实与探针杂交，而非靶标序列保持不杂交。充分加热使靶序列变性，暴露与探针互补的单链DNA，从而引发杂交。该过程继续，这通过探针与暴露的单链退火，实现序列的荧光标记。发明所属技术领域的技术人员知道溶液离子强度、缓冲液组分、温度之类的特定条件，可以实现所需杂交。退火后，多余的探针被漂洗掉。
将承载杂交标本的载玻片插入作为自动显微镜系统元件的载玻片装载盒。系统投入运行，在该时刻载玻片从盒中转运并置于显微镜载物台上。在许多实施方案中，每一片载玻片可带有由自动显微镜质询的编码，其包括如下信息，例如标本识别，任何常规染色体染料的身份，以及与待测标本一起使用的FISH探针上的各种荧光标记。这些信息指导自动显微镜在整个图像积累过程中选择适当的滤光器和相关光学元件。
自动扫描装置，例如自动显微镜可配置为在一个或多于一个，例如两个、三个或更多的平面扫描生物样本。通过在多个平面扫描，可显著改善对就样本中细胞总量而言较少的异常细胞的检测。
在一个实施方案中，探针可利用FISH探针，其荧光信号由检测器检测。应该理解的是，探针可在有或没有另一个输入信号下产生信号，例如它们可为放射性的，或当由激活信号(例如适当波长的光或其它电磁辐射)刺激时发荧光。探针可针对不同的复制相关癌症/增生基因座，与癌症/增生相关的特定基因座。不同的荧光标签可与针对不同基因座的探针相关联，以产生不同的信号。
可以依据标签产生的信号选择检测器，如用于检测荧光标签的荧光检测器，其可操作化地配置，使荧光标签产生的特定荧光信号得以检测。
可如下开始自动分析：指定使用低倍显微镜，至少使用常规染料，也可以使用探针标记，以确定标本中用于更高倍成像的区域。当电脑软件在低倍下确定感兴趣的区域时，其可指令自动显微镜变换物镜和/或滤镜，以及任何其它光学组件，以便根据源自探针中所用的荧光标记的一种或另一种的发射光，在较高放大倍数下进行确定基因座的适当的图像分析。电脑软件可使用图像中的特征，作为非限制性实例，例如FISH标记斑点的强度和数量，以计数出现在单个细胞核中的所述斑点。所述计数可提供被分析标本中的组织细胞中基因扩增程度的结果指示。
报告可包括与特定染色体相关的特定标签的简单报告，和/或可以包括自动诊断报告(表明与染色体的特定杂交模式相关的癌症类型)。在某些实施方案中，自动显微镜系统自动产生报告，其详细描述在操作过程中得到的多种图像、视野和表现中所获得结果。所述报告可利用，或可参考已经存储在与自动显微镜相关联的存储装置中的历史信息或患者信息。
有用的系统可包括同时，或在相当短的时间间隔内(如小于1分钟)，完成多信号通道的自动扫描和检测。可对系统进行可操作化地配置，以同时或并行(或其混合)的方式，实时处理多信号中的每个信号，实现指示一种或更多特定癌症的染色体区域和/或区域性复制的快速检测。
与正常标本比较的矢量值可选定小于特定阈值，例如小于约60，或小于约40，或小于约30，或小于约20，或小于约10，或小于约3，或小于约1，或小于约0.500。
在分析方法的非限制性实例中，自动方法可包括如下步骤：
1.通过将来自石蜡包埋的组织薄切片铺于载玻片上，使显微标本沉积。
2.用用于靶向的染色体基因座或序列的荧光原位杂交(FISH)探针对组织切片进行染色。
3.FISH探针处理后，使用桌面扫描器扫描载玻片，分辨率可设定为每英寸100个点，或200个点，或300个点，或400个点，或更多个点，加工扫描图像，以识别病理学者标记用于注意的区域。该区域的数字化信息传输至自动荧光显微镜，例如IkoniscopeTM显微镜系统(Ikonisys，Inc.New Haven，CT)。
4.将载玻片装载在自动显微镜上。
5.采用低放大倍数，例如2X，或4X，或5X，或10X，或类似的低放大倍数开始自动扫描，用DAPI通道分析，由此所述仪器检测包含细胞核的载玻片区域。典型地，扫描在步骤(3)中标记的区域中进行。
6.然后使用更高放大倍数，例如10X，或15X，或20X，或40X，或甚至更高放大倍数，显微镜系统扫描在此前的步骤中确定的区域。在DAPI通道中扫描以检测细胞核，再在针对由探针中使用的荧光标记发射范围中的光波长的通道中进行扫描，例如橙色通道，用于计数例如来自具有发射橙色射线的标记物的FISH探针的橙色信号，在绿色通道中计数来自具有发射绿色射线的标记物的FISH探针的信号。这提供感兴趣的特征，例如细胞核，以供进一步的表征。
7.具有感兴趣特征的位置被记录，用于后续在最高放大倍数，例如100X倍数下的扫描和信号计数确认。
8.自动显微镜将20X和100X扫描期间收集的所有图像提供给病理学者进行评估，如果病理学者需要在高放大倍数下对另一载玻片区域进行评估，还可随后对载玻片进行再扫描。
有关优选实施方案的陈述
尽管参照优选的实施方案对本发明进行了描述，但本领域技术人员应该易于理解，在不背离如由所附的权利要求书限定的本发明的精神和范围下，可对本发明进行多种变化和/或修改。本文引用的所有文件，在适合用于教导额外的或备选的细节、特征和/或技术背景的情况下均通过引用的方式并入本文。

Claims (19)

1.一种筛查受试者中病变的存在和/或程度的方法，所述病变特征在于受试者细胞中的异常染色体成分，所述方法包括以下步骤：
a)使来自所述受试者的包含细胞核的生物样本与针对至少一种表现异常特征的染色体序列的一种或更多种可区分的标记探针接触，所述接触在促进所述一种或更多种探针与所述至少一种序列杂交的条件下进行；
b)自动获得所述一种或更多种与染色体序列杂交的可区分的标记的表现；
c)自动分析所述表现中一种或更多种标记结合的分布和强度，以确定异常染色体成分的存在和/或程度；和
d)自动报告步骤c)的分析结果；
其中步骤b)-d)在无人干预下实施。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b)-d)由自动显微镜系统实施。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，探针靶向单核苷酸多态性(SNP)，突变单或多碱基核苷酸序列，TERC和PIK3A基因座附近800kb染色体区域内重复或扩增的基因或其部分，3号染色体着丝粒，7号染色体着丝粒，以及包含TERC、PIK3A基因、基因或这些基因的部分的5′和3′附近区域的序列中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述杂交条件下将所述样本与针对已知不是异常的染色体基因座的标记参照探针接触，或将所述样本与参照染色剂接触，并使获得表现和分析步骤以参照探针或染色剂为参照。
5.筛查受试者中与癌症、高度增生或高度发育异常相关异常的方法，其包括以下步骤：
a)从受试者中获得包含细胞核的生物样本；
b)在促进探针与靶向的染色体基因座杂交的条件下，使生物样本与第一探针接触，该第一探针具有针对异常相关的染色体序列的第一可检测标记；
c)在所述杂交条件下，使所述样本与至少一种针对已知不是异常的染色体基因座的可检测地标记的参照探针接触，并进一步将所述样本与细胞核参照染色剂接触；
d)在样本中自动寻找具有所述参照染色剂的区域，并对与染色体序列结合的标记成像；
e)自动分析所述标记图像中杂交标记的分布和强度；和
f)自动报告步骤e)的分析结果；
其中步骤d)-f)在无人干预下实施。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤d)-f)由自动显微镜执行。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，在接触步骤之前，所述细胞核从样本中分离并沉积形成层。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述样本包括活组织检查样本、手术切除样本、血液、淋巴、尿液、渗出液、生物流体、上皮碎屑、子宫颈涂片、口腔粘膜涂片、灌洗液、抽吸液、唾液、痰和组织中的一种或更多种。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一和第二标记是荧光标记。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一探针靶向单核苷酸多态性(SNP)，突变序列，重复或扩增的基因或其部分，3号染色体着丝粒，7号染色体着丝粒，以及包含TERC基因或其部分的序列中的至少一种。
11.一种在治疗患者的癌症或高度增生期间，监测随时间推移的治疗功效的自动方法，所述方法包括以下步骤：
(a)自患者获得流体生物样本，其中含有与癌症或高度增生相关的细胞；
(b)用一种或更多种可检测地标记的染色体探针处理所述流体生物样本或其部分，所述探针对一个或更多个染色体基因座具有高度序列相似性，所述染色体基因座或其扩增与所述癌症或高度增生相关，其中所述处理在足以使所述探针与样本中的染色体杂交的条件下实施；
(c)利用机器人显微镜自动扫描所述经处理的流体生物样本，检测所述一个或更多个结合于所述样本中的任意染色体的标记；
(d)利用机器人显微镜自动检测与杂交至所述染色体探针的所述染色体相关的细胞数量；和
(e)在疗程的不同时间自动比较步骤(c)和(d)中提供的标记杂交模式和细胞数量结果，从而评估该疗法在治疗癌症或高度增生中的疗效。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，以1天或更长的间隔进行监测。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述流体生物样本包括血液、淋巴、尿液、渗出液、上皮碎屑、子宫颈涂片、口腔粘膜涂片、灌洗液、唾液、抽吸液和痰的一种或更多种。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，自动显微镜系统在无人干预下实施步骤(c)-(e)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，自动显微镜系统自动优化扫描样本的视野。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，自动显微镜在样本视野中扫描两个或更多平面。
17.根据权利要求11所述的方法，其中，探针靶向单核苷酸多态性(SNP)，突变单或多碱基核苷酸序列，TERC和PIK3A基因座附近800kb染色体区域内重复或扩增的基因或其部分，3号染色体着丝粒，7号染色体着丝粒，以及包含TERC、PIK3A基因、基因或这些基因的部分的5′和3′附近区域的序列中的至少一种。
18.根据权利要求11所述的方法，其中，患者无需他人帮助获取样本。
19.筛查宫颈癌细胞的自动方法，其包括以下步骤：
(a)获得包含来自受试者的带有细胞核的生物样本的载玻片，所述生物样本已与具有针对7号染色体的第一可检测标记的第一细胞核着丝粒探针，和具有针对3号染色体q臂上的单拷贝序列的第二可检测标记的第二细胞核非着丝粒探针接触，其中，所述单拷贝序列包括四个包含染色体3q26位上至少部分TERC基因的重叠BAC克隆的重叠群序列，并以DAPI复染，其中所述第一和第二探针在促进每个所述第一和第二探针与各自染色体基因座杂交的条件下接触；
(b)搜索所述载玻片，寻找所述生物样本中的DAPI染色区域；
(c)搜索所述DAPI染色区域，寻找所述第一细胞核着丝粒探针的标记和所述第二细胞核非着丝粒探针的标记的存在；
(d)定量地确定所述生物样本中每个DAPI染色区域中每个细胞核的所述第一细胞核着丝粒探针和第二细胞核非着丝粒探针的数量；
(e)当每个细胞核的DAPI内的所述第一探针数量约为2，并且每个细胞核的DAPI染色区域内的所述第二细胞核非着丝粒探针数量等于或多于4时，指定所述生物样本具有发展为高度增生和扩散性宫颈癌的可能性。
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