CN102740860B

CN102740860B - 通读诱导剂以及无义突变型遗传疾病的治疗药物

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Publication number: CN102740860B
Application number: CN201180008253.8A
Authority: CN
Inventors: 松田良一; 盐塚政孝; 我妻玲; 高桥良和; 池田大四郎; 野野村祯昭; 松尾雅文; 西田笃史
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation; University of Tokyo NUC
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation; University of Tokyo NUC
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2011-02-03
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2031-02-03
Also published as: CN102740860A; KR20120123509A; EP2535051A1; US9358246B2; BR112012019515A2; RU2571060C2; EP2535051A4; CA2788730A1; RU2012137245A; EP2535051B1; AU2011211744B2; AU2011211744A1; WO2011096484A1; IL221251A0; US20150005249A1; JPWO2011096484A1; MX2012009028A; JP5705136B2; US20130005953A1

Abstract

本发明提供一种含有下述结构式(A)所示的化合物的、针对由无义突变形成的提前终止密码子的通读诱导剂以及含有前述通读诱导剂的治疗无义突变型遗传疾病的药物。

Description

通读诱导剂以及无义突变型遗传疾病的治疗药物

技术领域

本发明涉及一种针对由无义突变形成的提前终止密码子的通读诱导剂(Read Through Inducer)以及无义突变型遗传疾病的治疗药物。

背景技术

无义突变型遗传疾病的起因是：由于基因上的点突变导致形成了提前终止密码子，使得蛋白质的表达被阻碍。这类疾病例如可以列举：肌营养不良症、多发性硬化症、婴儿神经元蜡样质脂褐素沉积病、阿尔茨海默病、泰-萨克斯病、神经组织变性、帕金森综合症、慢性关节风湿病、移植物抗宿主病、关节炎、血友病、血管性血友病、毛细管扩张性运动失调、地中海贫血、肾结石、成骨不全症、肝硬变、神经纤维瘤病、水疱性疾病、溶酶体性贮积病、贺勒氏症（粘多糖症）、家族性胆固醇血症、小脑运动失调症、结节性硬化症、家族性红细胞增多症、免疫缺陷、肾脏病、肺疾病、囊胞性纤维症、家族性高胆固醇血症、色素性视网膜病、淀粉样变性（淀粉沉积症）、动脉粥样硬化症、巨人症、侏儒症、甲状腺机能低下症、甲状腺机能亢进症、老化、肥胖、糖尿病、尼曼-匹克（Niemann-Pick）病（神经鞘髓磷脂病）、马凡氏综合症、癌症等。

例如，杜氏肌营养不良症是由于肌纤维鞘中肌营养不良蛋白缺失导致的疾病。在该疾病中，存在于X染色体中的肌营养不良基因上发生了突变，导致生成终止密码子（提前终止密码子），在该突变部位，翻译发生中断或者终了，导致正常的肌营养不良蛋白以及与肌营养不良相关联的蛋白质的表达被抑制，结果导致了肌营养不良蛋白缺失。

关于这样的无义突变型遗传疾病的治疗方法，正在摸索使用具有通读活性的化合物进行治疗的方法。前述的通读活性是指，对于因无义突变导致提前终止密码子产生的特定蛋白质缺失的患者，在给他们施用特定化合物时，前述化合物作用于核糖体，使得核糖体跳过终止密码子进行翻译。于是，通读的结果可以合成野生型正常蛋白质。

具有前述通读活性的化合物，例如可以列举已知的氨基糖苷类抗生素的庆大霉素、二肽系抗生素的负霉素（Negamycin）等。

关于庆大霉素，Politano等通过给杜氏肌营养不良症患者施用庆大霉素，确认了肌营养不良蛋白的蓄积（例如，参照非专利文献1）。另外，通过对囊胞性纤维症患者的呼吸道上皮局部施用庆大霉素，可以使得典型的电生理学异常正常化的结果也有见报道（例如，参照非专利文献2）。并且，美国正在进行使用庆大霉素作为遗传疾病治疗方法的临床试验。然而，所存在的问题是，由于庆大霉素毒性强，对于需要长期服用药物的无义突变型遗传疾病的患者来说，并不能称之为理想的治疗药物。

关于负霉素，通过将该化合物施用于肌营养不良症模型小鼠，确认出肌营养不良蛋白的表达得到恢复（例如，参照专利文献1）。然而，所存在的问题是，负霉素是尚未被承认的药物，因此作为急需药物的无义突变型遗传疾病治疗药物来说是不现实的。

另外，作为治疗杜氏肌营养不良症等的药剂，具有通读活性的Ataluren（PTC124）的临床试验正在美国进行。然而，现在在第三阶段停了下来，作为急需药物的无义突变型遗传疾病治疗药物来说，并不现实。

于是，现在急需的是，迅速开发一种毒性弱，且含有具有通读活性的化合物的通读诱导剂以及治疗无义突变型遗传疾病的药物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2002/102361号公报

非专利文献

非专利文献1：Acta.Myol.第22卷，第15～21页，2003年

非专利文献2：N.Engl.J.Med.第349卷，第1433～1441页，2003年

发明内容

技术问题

本发明是以解决前述的到目前为止存在的诸多问题，并以达成以下目的为课题。即本发明的目的是提供一种毒性弱，且含有具有通读活性的化合物的通读诱导剂以及含有前述通读诱导剂的治疗无义突变型遗传疾病的药物。

技术方案

为了解决前述课题，本发明的发明者们经过专心研究，结果发现作为MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）感染症的特效药被使用的、由如下结构式（A）所表示的化合物（以下被称为“阿贝卡星（arbekacin）”），具有优异的通读活性，并基于此完成了本发明。

[化学式1]

结构式（A）

本发明是基于发明者们所得出的前述研究结果作出的，其用于解决前述课题的手段如下：即，

〈1〉以含有如下的结构式（A）所表示的化合物为特征的，针对由无义突变形成的提前终止密码子的通读诱导剂。

[化学式2]

结构式（A）

〈2〉以含有前述〈1〉中所记载的通读诱导剂为特征的、治疗无义突变型遗传疾病的药物。

〈3〉前述〈2〉所记载的治疗无义突变型遗传疾病的药物所针对的无义突变型遗传疾病是肌营养不良症。

〈4〉一种用于治疗患有无义突变型遗传疾病的个体的方法，其特征在于，前述〈1〉中所记载的通读诱导剂以及前述〈2〉所记载的治疗无义突变型遗传疾病的药物，至少使用其中一种进行治疗。

〈5〉前述〈4〉中所记载的方法所针对的无义突变型遗传疾病是肌营养不良症。

〈6〉在前述〈4〉或〈5〉所记载的治疗方法中，使用前述〈1〉中所记载的通读诱导剂以及前述〈2〉所记载的治疗无义突变型遗传疾病的药物这两者中的至少一种时，其给药量，以前述结构式（A）所表示的化合物的量为基准，为0.1mg/kg/日～300mg/kg/日。

〈7〉在前述〈4〉或〈5〉所记载的治疗方法中，使用前述〈1〉中所记载的通读诱导剂以及前述〈2〉所记载的治疗无义突变型遗传疾病的药物这两者中的至少一种时，其给药量，以前述结构式（A）所表示的化合物的量为基准，为0.5mg/kg/日～50mg/kg/日。

〈8〉前述〈1〉中所记载的通读诱导剂，其特征在于，用于治疗无义突变型遗传疾病。

〈9〉为制备治疗无义突变型遗传疾病的有效药物，而使用前述〈1〉中所记载的通读诱导剂。

有益效果

根据本发明，可以提供一种毒性弱，且含有具通读活性的化合物的通读诱导剂以及含有前述通读诱导剂的无义突变型遗传疾病的治疗药物。

附图说明

图1所示为正常小鼠的根据抗肌营养不良蛋白抗体的免疫染色图像。

图2所示为正常小鼠的苏木精（Hematoxylin）以及曙红染色图像。

图3所示为只施用生理盐水的mdx小鼠的根据抗肌营养不良蛋白抗体的免疫染色图像。

图4所示为只施用生理盐水的mdx小鼠的苏木精（Hematoxylin）以及曙红染色图像。

图5所示为施用了ABK的mdx小鼠的根据抗肌营养不良蛋白抗体的免疫染色图像。

图6所示为施用了ABK的mdx小鼠的苏木精（Hematoxylin）以及曙红染色图像。

图7所示为试验例5中的B10小鼠、施用了阿贝卡星的mdx小鼠以及未施用阿贝卡星的mdx小鼠的握力测定结果示意图。

图8所示为在试验例6中的施用了阿贝卡星的mdx小鼠以及未施用阿贝卡星的mdx小鼠的腓肠肌强直张力测定结果示意图。

图9所示为在试验例7中的施用了阿贝卡星（2.5mg/日、5mg/日）的mdx小鼠以及未施用阿贝卡星的mdx小鼠的腓肠肌单收缩张力的测定结果示意图。

图10所示为试验例8中的免疫印迹的结果示意图。

具体实施方式

（通读诱导剂）

本发明的通读诱导剂，至少含有下述结构式(A)所示的化合物，根据需要还可含有其他成分。

[化学式3]

结构式（A）

前述通读是指由于遗传基因上的点突变，造成了一个碱基被置换，在原来的翻译终结部位的上游形成提前终止密码子时，越过前述的提前终止密码子，一直翻译到原来的翻译终结部位。通过“通读”前述提前终止密码子，能够合成功能性的全长蛋白质。

〈结构式（A）所表示的化合物（阿贝卡星）〉

前述阿贝卡星（1-N-AHB地贝卡星）是在地贝卡星（3′，4′-去氧卡那霉素B）中添加4-氨基-2-羟丁酰（AHB）基的产物，从1990年末开始用作MRSA感染症的特效药。

前述阿贝卡星可以以盐类化合物状态，也可以以溶剂化物状态存在。

对于前述的盐类化合物，并无特别限制，可根据目的适当选择，例如氢卤酸盐、无机酸盐、羧酸盐、氨基酸盐、有机酸盐等。其中，优选无机酸盐。

作为前述氢卤酸盐的具体例子，可以列举：氢氟酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等。

作为前述无机酸盐的具体例子，可以列举：硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、碳酸盐等。其中，优选硫酸盐。

作为前述羧酸盐的具体例子，可以列举：醋酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、羟基乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、安息香酸盐、扁桃酸盐、丁酸盐、马来酸盐、丙酸盐、蚁酸盐、苹果酸盐等。

作为前述氨基酸盐的具体例子，可以列举：精氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。

作为前述有机酸盐的具体例子，可以列举：甲磺酸盐、对甲本磺酸盐等。

而前述的溶剂化物，并无特别限制，可以根据目的适当选择，例如水溶剂化物、乙醇溶剂化物等。

对于前述阿贝卡星，可以使用化学合成物，也可以使用市场销售品。

前述阿贝卡星的合成方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如“The Journal of Antibiotics，26卷，1973年，412页”所记载的方法等。

而前述阿贝卡星的市场销售品，例如有哈贝卡星（ハベカシン，明治制果株式会社制）等。

另外，作为前述阿贝卡星的盐类化合物以及前述阿贝卡星的溶剂化物的制备方法，并无特别限制，可以适当地选择使用常规方法。

前述阿贝卡星也可以是其衍生物。

而前述通读诱导剂中前述阿贝卡星的含量，没有特别限制，可以根据目的适当选择。另外，前述的通读诱导剂也可以是前述阿贝卡星本身。

〈其他成分〉

作为前述通读诱导剂中的其他成分，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如在药理学上能够相容的载体等。

作为前述在药理学上能够相容的载体，没有特别的限制，可以根据目的适当选择，例如乙醇、水、淀粉等。

作为前述通读诱导剂中前述其他成分的含量，没有特别限制，只要在不损害阿贝卡星的效果的范围内，可以根据目的适当选择。

〈使用〉

前述通读诱导剂可以单独使用，也可以和将其他成分作为有效成分的医药品组合使用。另外，前述通读诱导剂还可以以被包含到将其他成分作为有效成分的医药品中的状态来使用。

由于前述通读诱导剂中含有阿贝卡星，所以如后述试验例1～8中所示，是一种毒性弱，且具有优异通读活性的物质。

因此，前述通读诱导剂可适用于治疗无义突变型遗传疾病。

〈剂型〉

作为前述通读诱导剂的剂型，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以使用液态状、粉末状、胶囊状、片剂状等剂型。采用这些剂型的前述通读诱导剂，可以按照通常的方法所制得。

〈给药〉

前述通读诱导剂的给药方法，没有特别限制，例如可以根据前述通读诱导剂的剂型等适当选择，可以是口服给药也可以是非口服给药。

前述通读诱导剂的给药量也没有特别限制，可以根据给药对象个体的年龄、体重、体质、症状、以及是否有以其他成分作为有效成分的医药品的给药等各项因素进行适当选择。前述通读诱导剂的给药量，例如以前述结构式（A）所表示的化合物（阿贝卡星）的量为基准，可以是0.1mg/kg/日～300mg/kg/日，优选的给药量为0.5mg/kg/日～50mg/kg/日。

前述通读诱导剂的给药时机，没有特别限制，可以根据目的适当选择。

作为前述通读诱导剂的给药对象的动物种类，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但以人类尤为适合。

关于前述通读诱导剂的给药，对事先从个体中采集的生物样品中所包含的基因进行检查，检查其中是否存在提前终止密码子，优选对检测出提前终止密码子的个体给药。作为前述提前终止密码子是否存在的检查方法，没有特别限制，可以适当选择常规方法，例如南方墨点法（Southern blot）、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）、短串联重复序列(short tandemrepeat，STR)、限制片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphisms，RFLP)等方法。

〈无义突变型遗传疾病的治疗药物〉

本发明中的无义突变型遗传疾病的治疗药物，至少含有前述的通读诱导剂，根据需要还可以含有其他成分。

〈无义突变型遗传疾病〉

前述无义突变型遗传疾病是由以下原因所导致的疾病：由于基因上的点突变导致一个碱基被置换，使得在原来的翻译终结部位的上游形成了提前终止密码子，由此，功能性的全长蛋白质的表达被阻碍，从而导致了该类疾病。

作为前述无义突变型遗传疾病的具体例子，可以列举：肌营养不良症、多发性硬化症、婴儿神经元蜡样质脂褐素沉积病、阿尔茨海默病、泰-萨克斯病、神经组织变性、帕金森综合症、慢性关节风湿病、移植物抗宿主病、关节炎、血友病、血管性血友病、毛细管扩张性运动失调、地中海贫血、肾结石、成骨不全症、肝硬变、神经纤维瘤病、水疱性疾病、溶酶体性贮积病、贺勒氏症（粘多糖症）、家族性胆固醇血症、小脑运动失调症、结节性硬化症、家族性红细胞增多症、免疫缺陷、肾脏病、肺疾病、囊胞性纤维症、家族性高胆固醇血症、色素性视网膜病、淀粉样变性（淀粉沉积症）、动脉粥样硬化症、巨人症、侏儒症、甲状腺机能低下症、甲状腺机能亢进症、老化、肥胖、糖尿病、尼曼-匹克（Niemann-Pick）病（神经鞘髓磷脂病）、马凡氏综合症、癌症等。其中，肌营养不良症，特别是杜氏肌营养不良症适合于作为研究病例。

作为前述无义突变型遗传疾病治疗药物中的前述通读诱导剂的含量，没有特别限制，可以根据目的适当选择。另外，前述无义突变型遗传疾病的治疗药物可以是前述通读诱导剂本身。

〈其他成分〉

作为前述无义突变型遗传疾病的治疗药物中的其他成分，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如在药理学上能够相容的载体等。

作为前述无义突变型遗传疾病的治疗药物中前述其他成分的含量，没有特别限制，只要在不损害阿贝卡星的效果的范围内，可以根据目的适当选择。

〈使用〉

前述无义突变型遗传疾病的治疗药物可以单独使用，也可以和将其他成分作为有效成分的医药品组合使用。另外，前述无义突变型遗传疾病的治疗药物还可以以被包含到将其他成分作为有效成分的医药品中的状态来使用。

由于前述无义突变型遗传疾病的治疗药物中含有前述通读诱导剂，所以如后述试验例1～8中所示，是一种毒性弱，且具有优异通读活性的药物。

因此，前述无义突变型遗传疾病的治疗药物可适用于治疗无义突变型遗传疾病。

〈剂型〉

作为前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的剂型，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以使用液态状、粉末状、胶囊状、片剂状等剂型。采用这些剂型的前述无义突变型遗传疾病的治疗药物，可以按照通常的方法所制得。

〈给药〉

前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的给药方法，没有特别限制，例如可以根据前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的剂型等适当选择，可以是口服给药也可以是非口服给药。

前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的给药量也没有特别限制，可以根据给药对象个体的年龄、体重、体质、症状、以及是否有以其他成分作为有效成分的医药品的给药等各项因素进行适当选择。前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的给药量，例如以前述结构式（A）所表示的化合物（阿贝卡星）的量为基准，可以是0.1mg/kg/日～300mg/kg/日，优选的给药量为0.5mg/kg/日～50mg/kg/日。

前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的给药时机，没有特别限制，可以根据目的适当选择。

作为前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的给药对象的动物种类，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但以人类尤为适合。

关于前述无义突变型遗传疾病的治疗药物的给药，对事先从个体中采集的生物样品中所包含的基因进行检查，检查其中是否存在提前终止密码子，优选对检测出提前终止密码子的个体给药。作为前述提前终止密码子是否存在的检查方法，没有特别限制，可以适当选择常规方法，例如南方墨点法（Southern blot）、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）、短串联重复序列(short tandem repeat，STR)、限制片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphisms，RFLP)等方法。

〈治疗方法〉

前述无义突变型遗传疾病的治疗药物由于含有前述通读诱导剂，所以通过给患有无义突变型遗传疾病的个体施用，可以治疗患有无义突变型遗传疾病的个体。因此，本发明也涉及以给个体施用前述无义突变型遗传疾病的治疗药物为特征的，治疗患有无义突变型遗传疾病的个体的治疗方法。

实施例

通过列举下述试验例，对本发明进行具体说明，但是本发明不局限于这些试验例。

（试验例1：通读活性解析）

〈通读活性检测用基因导入小鼠的制作〉

为了解析生物体内的通读活性，利用与国际公开WO2008/004610号[0071]～[0083]段中记载的方法相同的方法，得到了通读活性检测用基因导入小鼠（Readthrough Evaluation and Assessment by Dual-reporter mice，以下称作R.E.A.D.小鼠（R.E.A.D.マウス））。

前述R.E.A.D.小鼠(R.E.A.D.マウス)中，含有将β-半乳糖苷酶基因和荧光素酶基因连接起来、在其接点处插入提前终止密码子（TGA）的构造（含有mdx小鼠的外显子23的提前终止密码子前后12mer周边序列的27mer）的具备巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白杂合启动子的表达载体（pCAGGS）被导入到生殖细胞系。所制作出的R.E.A.D.小鼠(R.E.A.D.マウス)，正常时只能够表达β-半乳糖苷酶，通过通读提前终止密码子表达荧光素酶。

〈通读活性的评价〉

给同母所生的3组雌性R.E.A.D.小鼠(（8周龄的一组（7只），10周龄的两组（每组5只）），将下表1所记载的给药化合物按照各自的给药量，连续7天进行皮下注射。

作为前述给药化合物，使用阿贝卡星（以下称为“ABK”）和庆大霉素（以下称为“GM”）。

前述阿贝卡星使用明治制果株式会社所提供的ABK粉末。另外，前述庆大霉素作为比较用。

给药是以采用生理盐水（大塚制药社制）对前述给药化合物进行稀释，并给小鼠注射0.1mL的方式进行。

给试验小鼠连续7天进行皮下注射后，从被摘出的肌肉组织提取液中，使用荧光素半乳糖苷酶和荧光素，根据光度计测定β-半乳糖苷酶（Beta-Galactosidase）的活性和荧光素酶（luciferase）的活性。将测定的荧光素酶（luciferase）的活性除以β-半乳糖苷酶（Beta-Galactosidase）的活性所得的值便是通读效率。下表1中所记录的是将施用庆大霉素时的通读效率视为1的情况下的相对通读效率。

[表1]

从前述表1中的结果可以确认出阿贝卡星（ABK）具有通读活性。并且，通过与已知具有通读活性的庆大霉素（GM）相比，确认出阿贝卡星的通读活性高于庆大霉素的通读活性。

（试验例2：毒性试验）

利用10周龄的同母所生的R.E.A.D.小鼠雄性、雌性各一组（每组3只），按照下表2所记载的给药量，作为阿贝卡星（ABK）使用明治制果株式会社发售的哈贝卡星（阿贝卡星硫酸盐）注射液（50mg/1mL），采用生理盐水（大塚制药社制）稀释后，每天注射0.2mL，连续7天进行皮下注射。

关于毒性，对7日间连续进行皮下注射的小鼠，测量其注射药物前后的体重，通过体重的增加率（6只的平均值）进行判断。

另外，通读效率和试验例1相同，测定β-半乳糖苷酶（Beta-Galactosidase）的活性和荧光素酶（luciferase）的活性，将前述测定的荧光素酶（luciferase）的活性除以β-半乳糖苷酶（Beta-Galactosidase）的活性所得的值作为通读效率。下表2中所记录的是将只施用生理盐水时的通读效率视为1的情况下的相对通读效率。

[表2]

ABK的给药量为7.5mg/日时，给药开始两天后，一只死亡（体重：从18.4g变为17.3g），给药开始三天后，两只死亡（体重：一只从21.0g变至19.0g，另一只从19.3g变至18.2g）。

从前述表2的结果可以看出，阿贝卡星（ABK）的给药量为7.5mg/日的大剂量时，试验小鼠死亡，但是当给药量为能够观察到通读活性的2.5mg/日和5mg/日时，试验小鼠的体重减少不大，可以被确认为毒性小。

另外，Development of Novel Aminoglycoside(NB54)with Reduced Toxicity and Enhanced Suppression of Disease-Causing Premature Stop Mutations.,J.Med.Chem.2009,52,2836-2845;Fujisawa,K.,Hoshiya,T.,Kawaguchi,H.,Aminoglycoside antibiotics.VII.Acute toxicity of aminoglycoside antibiotics.,J.Antibiot.1974,27,677-681以及Kondo,S.,Hotta,K.,Semisynthetic aminoglycoside antibiotics:Development and enzymatic modifications.,J.Infect.Chemother.1999,5,1-9的记载中显示，给小鼠静脉注射庆大霉素时的LD₅₀（50%致命剂量，Lethal Dose）大约为76mg/kg，相对于该数值，给小鼠静脉注射阿贝卡星时的LD₅₀大约为118mg/kg，由这一点也可知阿贝卡星的毒性较弱。

（试验例3：肌营养不良蛋白的表达）

给作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性、雌性，5月龄，n＝8）给药，所给药物是用生理盐水（大塚制药社制）稀释至1mg/0.1mL的ABK粉末(明治制果株式会社提供)，将该药物连续两周每天给试验小鼠进行皮下给药。然后，将股直肌摘出并制成冷冻切片，以兔的多克隆抗肌营养不良蛋白抗体（AbCam公司制造）作为第一抗体，对该切片进行免疫染色。

图1所示为正常小鼠的根据抗肌营养不良蛋白抗体的免疫染色图像，图2所示为正常小鼠的苏木精（Hematoxylin）以及曙红染色图像，图3所示为只施用生理盐水的mdx小鼠的根据抗肌营养不良蛋白抗体的免疫染色图像，图4所示为只施用生理盐水的mdx小鼠的苏木精（Hematoxylin）以及曙红染色图像，图5所示为施用了ABK的mdx小鼠的根据抗肌营养不良蛋白抗体的免疫染色图像，图6所示为施用了ABK的mdx小鼠的苏木精（Hematoxylin）以及曙红染色图像。

从图1以及图2所示可知，对于正常小鼠，体内有肌营养不良蛋白的表达，肌肉组织的大小较整齐。而另一方面，从图3以及图4所示可知，对于mdx小鼠，体内没有肌营养不良蛋白的表达，肌肉组织的大小不整齐。

从图5以及图6所示可知，对于施用了阿贝卡星（ABK）的mdx小鼠，体内有肌营养不良蛋白的表达，而且肌肉组织的大小较整齐。

由以上可以确定阿贝卡星是治疗肌营养不良症的有效药物。

（试验例4：前肢张力的测定）

按照下表3所记载的给药量，给作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性、雌性，5月龄，n＝8）给药，所给药物是用生理盐水（大塚制药社制）稀释的ABK粉末(明治制果株式会社提供)，将该药物连续两周每天以0.1ml的量给试验小鼠进行皮下给药。两周后，测定了小鼠的前肢张力。

前述的前肢张力是利用小动物握力测定装置（测力计是日本计测系统株式会社所制）来测定的。

下表3中所表示的，是将以体重校正了的正常小鼠的前肢张力计为100的相对张力。

[表3]

从前述表3的结果可知，通过施用阿贝卡星（ABK），mdx小鼠的前肢张力得到恢复。从而可以确定阿贝卡星是治疗肌营养不良症的有效药物。

（试验例5：握力的测定）

本试验中使用了以下三种小鼠：（1）作为正常小鼠的B10小鼠（同母的雄性、雌性，5个月龄，n＝9）；（2）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性、雌性，5个月龄，n＝9），将明治制果株式会社发售的哈贝卡星（阿贝卡星硫酸盐）注射液用生理盐水（大塚制药社制）稀释，并以1mg/日的量，连续三周每天给该mdx小鼠进行皮下给药；（3）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性、雌性，5个月龄，n＝8）。

作为前述握力（Grip Strength）的测定装置，参考了小动物用的握力测定装置，是在市售的测力计（日本计测系统株式会社所制）上设置了长70mm、宽55mm的不锈钢金属网而制成的。该测力计的精度为：±0.2%FS，反复精度为：±0.1%FS，最大可以测定100N(10kgf)，拥有0.01N（1gf）的1/10000的分解能力，可以测定峰值。

小鼠的握力测定按如下操作进行测定。

将小鼠放于测定用的网上，用手沿水平方向拉小鼠的尾巴，测定直到前述小鼠无法忍耐所受拉力从抓着的网脱离时的最大力（握力）。该握力的测定，每隔两分钟测定一次，一共测定5次，取其平均值。另外，通过用体重去除测定的握力将其标准化。

前述握力的测定结果用图7表示。

图7中，“B10”是作为正常小鼠的B10小鼠（前述（1））的结果，“mdx-ABK”是施用了阿贝卡星的mdx小鼠（前述（2））的结果，“mdx”是没有施用阿贝卡星的mdx小鼠（前述（3））的结果。

从图7的结果可以确认通过阿贝卡星的给药，可以观察到肌肉力量的改善倾向。

（试验例6：腓肠肌的强直张力的测定）

本试验中使用了以下两种小鼠：（1）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性，4个月龄），将明治制果株式会社发售的哈贝卡星（阿贝卡星硫酸盐）注射液用生理盐水（大塚制药社制）稀释，并以2.5mg/日的量，连续三周每天给该mdx小鼠进行皮下给药；（2）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性，4个月龄）。

前述腓肠肌的强直张力的测定，是利用由个人电脑、AD/DA转换器、电极以及测力计构成的等长收缩张力测定系统，按照以下的操作进行。

首先，在戊巴比妥钠麻醉下将小鼠的小腿三头肌解剖出来，测量小腿三头肌的长度。

接着，将阿基里斯腱从踵骨部切掉，用棉线捆绑，装在测力计上。同时，在膝盖处插入一支电刺激用的白金电极，通过诊断用神经肌肉电刺激装置（日本光电工业株式会社制）进行电刺激。

测定时，调整肌肉长（肌肉的长度）、刺激电压量以获得最大等长收缩张力。等长收缩张力通过肌肉的横截面积（通过肌肉重量、肌肉长、密度1.06mg/mm³计算）标准化。

另外，为了防止小腿三头肌表面干燥，在其表面上涂抹上生理盐水。

前述腓肠肌的强直张力的测定，在显示最大单收缩张力的刺激电压（0.5ms宽的短矩形波）的大小和肌肉的长度下，以80Hz～100Hz的频率、200ms破裂（burst）的状态进行。另外，所测定的产生张力是根据肌肉的横截面积（通过肌肉重量、肌肉长、密度1.06mg/mm³计算）进行标准化的。

调节刺激电压的大小（0V～20V）和肌肉的长度，使单发电刺激产生的单收缩张力变得最大。另外，用千分尺测定肌肉的长度。

前述腓肠肌强直张力（Tetanus Tension）的测定结果如图8所示。

图8中，“A”显示的为施用了阿贝卡星的mdx小鼠的结果，“B”显示的为没有施用阿贝卡星的mdx小鼠的结果。

从图8的结果可以确认，通过阿贝卡星的给药，能够观察到肌肉力量的改善倾向。

（试验例7：腓肠肌单收缩张力的测定）

本试验中使用了以下三种小鼠：（1）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性，4个月龄），将明治制果株式会社发售的哈贝卡星（阿贝卡星硫酸盐）注射液用生理盐水（大塚制药社制）稀释，并以2.5mg/日的量，连续三周每天给该mdx小鼠进行皮下给药；（2）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性，4个月龄），将明治制果株式会社发售的哈贝卡星（阿贝卡星硫酸盐）注射液用生理盐水（大塚制药社制）稀释，并以5mg/日的量，连续三周每天给该mdx小鼠进行皮下给药；（3）作为杜氏肌营养不良症的模型动物的mdx小鼠（同母的雄性，4个月龄）。

前述腓肠肌单收缩张力的测定除了利用短脉冲宽度的电刺激之外，其他都和前述腓肠肌强直张力的测定相同。

前述腓肠肌单收缩张力（Twitch Tension）的测定结果如图9所示。

图9中，“C”显示的为按照2.5mg/日的量连续三周进行阿贝卡星皮下给药的mdx小鼠（前述（1））的结果；“D”显示的为按照5mg/日的量连续三周进行阿贝卡星皮下给药的mdx小鼠（前述（2））的结果；“E”显示的为没有施用阿贝卡星的mdx小鼠的结果。

从图9的结果可以确认，通过阿贝卡星的给药，能够观察到肌肉力量的改善倾向。

（试验例8：来自DMD患者的培养肌细胞中的肌营养不良蛋白的表达）

〈肌细胞的培养〉

使用两种（#919，#809，任何一种都是来自UAA无义突变患者的肌细胞）来自无义突变型杜氏肌营养不良症（DMD）患者的肌细胞，按照以下的操作试验来自DMD患者的培养肌细胞中的肌营养不良蛋白的表达。

利用明胶涂层的6孔板（IWAKI）在增殖培养液（含有20%胎牛血清（Gibco）、4%Ultrocer G(Pall Corporation)以及1%Antibiotic-Antimycotic（Gibco）的杜尔贝科改良伊格尔最小必需培养液（DMEM，Sigma））中对前述来自患者的肌细胞进行增殖。

为了使前述增殖细胞分化为肌管，在分化培养液（含有2%马血清（Gibco）的杜尔贝科改良伊格尔最小必需培养液（DMEM，Sigma））中培养2周。在前述培养过程中，每2天交换一次培养液，并且要添加阿贝卡星（400μg/mL）。另外，在未添加阿贝卡星时，只交换培养液。前述阿贝卡星是使用将由明治制果株式会社发售的哈贝卡星（阿贝卡星硫酸盐）注射液的浓度调整至前述浓度的注射液。

<免疫印迹（Western blot）>

前述培养结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗净细胞，然后采用1×细胞裂解液（cell signaling technology）溶解并回收细胞。将前述回收的总蛋白质（未添加阿贝卡星的细胞：60μg，添加阿贝卡星的细胞：30μg）在3-10%的聚丙烯酰胺凝胶（PAGEL，ATTO株式会社）中进行电泳。将通过前述电泳分离的蛋白质转移至蛋白杂交膜HYBOND-P（通用电气医疗集团，GEHealthcare）。

免疫印迹是使用ECL Advance Western Blotting检测试剂盒（通用电气医疗集团，GE Healthcare），按照制造商的操作说明书进行操作。所使用的抗肌营养不良蛋白C端抗体，是将NCL-DYS2（Leica Microsystems）稀释10倍的稀释液，使用抗小鼠IgG（GE Healthcare）检测肌营养不良蛋白和抗肌营养不良蛋白免疫复合体。

另外，按照同样的方法，对结蛋白（Desmin）进行免疫印迹操作。所使用的抗结蛋白抗体是将H-76（Santa Cruz公司）稀释50倍的稀释液，使用抗兔IgG（GE Healthcare）检测结蛋白－抗结蛋白免疫复合体。

前述免疫印迹的结果如表4以及图10所示。

[表4]

根据肌营养不良蛋白/结蛋白的相对表达量

从表4以及图10的结果可以看出，来自于UAA无义突变患者的两种培养细胞（#919，#809）中，肌营养不良蛋白的表达得到恢复。通过抑制提前终止密码子可以诱导肌营养不良蛋白的表达，使得在日常生活中因肌肉收缩造成的肌肉损伤可以得到减轻。

产业上的利用可能性

本发明的通读诱导剂，因含有阿贝卡星，毒性弱，通读活性优异，所以能够适合用作无义突变型遗传疾病的治疗药物。

并且，由于前述阿贝卡星是已获得认可的治疗MRSA感染症的药物，所以本发明的治疗无义突变型遗传疾病的药物，作为治疗无义突变型遗传疾病的急需药物，是非常适合的。

Claims

1.通读诱导剂在制备治疗无义突变型遗传疾病的药物中的应用，其特征在于所述通读诱导剂含有下述结构式(A)所示的化合物，所述无义突变型遗传疾病是肌营养不良症，

2.如权利要求1所述的通读诱导剂的应用，其特征在于肌营养不良症是杜氏肌营养不良症。

3.如权利要求1所述的通读诱导剂的应用，其特征在于，治疗无义突变型遗传疾病的药物的给药量，以结构式(A)所示的化合物的量为基准，为0.1mg/kg/日～300mg/kg/日。

4.如权利要求1所述的通读诱导剂的应用，其特征在于，治疗无义突变型遗传疾病的药物的给药量，以结构式(A)所示的化合物的量为基准，为0.5mg/kg/日～50mg/kg/日。

5.如权利要求2所述的通读诱导剂的应用，其特征在于，治疗无义突变型遗传疾病的药物的给药量，以结构式(A)所示的化合物的量为基准，为0.1mg/kg/日～300mg/kg/日。

6.如权利要求2所述的通读诱导剂的应用，其特征在于，治疗无义突变型遗传疾病的药物的给药量，以结构式(A)所示的化合物的量为基准，为0.5mg/kg/日～50mg/kg/日。