CN102732598A - 一种全基因组dna序列拼接测序方法 - Google Patents
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Abstract
一种全基因组DNA序列拼接测序方法，属于生物技术领域，改进了目前DNA测序的底物制备并提出新的序列拼接方法，应用于生物、医学、农林牧副业相关DNA检测。本专利涉及一系列DNA相关操作，包括基因组DNA两端添加不对称接头，单端锚定到布满扩增引物的平面支持物上，通过电泳等方法使DNA片段定向化后锚定另一端，在DNA双链上制造并扩大缺刻，用含有随机末端的测序引物连接到缺刻5’端，用单链DNA连接酶使扩增引物与测序引物连接，增加缺刻数目等产生可测序的局部DNA片段。与现有测序技术相比，每个局部DNA片段都保留了距离信息，以距离作权值对局部序列的拼接结果进行打分，可得到完整的基因组序列。我们的方法在拼接未知生物基因组和检测基因组变异上具有突出的优势。
Description
技术领域：分子生物学技术
背景技术
高通量全基因组DNA测序在生物技术相关领域中具有非常重要的应用。这类技术主要目的是在有限的时间内，完成一个物种的所有基因组DNA序列的测序工作。这类技术具有快速和高灵敏度的特点，并且可以得到丰富的物种基因组序列信息；因此，在医学相关检测，农业病虫害快速鉴定，刑侦法医鉴定等很多领域中，此类技术都有很大的商业应用前景。在实际应用中，现有的全基因组高通量测序技术可称为“第二代全基因组测序技术”，这类技术并不是直接测定出某个物种的整体DNA序列，而是通过一个“高通量化”的实验过程，在有限的时间(数周)内，测定出此物种基因组DNA的很多小片段序列(30个到100个碱基的长度)。因此，现在的全基因高通量测序还被称为“全基因组重测序”。
全基因DNA测序的“高通量化”过程，涉及若干不同的具体操作和反应。目前，三家公司的具体技术在这个测序领域中进行着角逐，分别是ABI(Applied biosystem)，罗氏(Roche)和Illumina，并有相关的仪器出售。这三家公司实现“高通量化”的技术特征可以描述为：(i)所有的测序片段及其测序反应都“展示”在一个平面支持物(我们在这里可称为测序板，对应三家公司的不同称呼)上。(ii)通过灵敏的图像采集技术，可以同一时间得到数百万甚至更多的反应信息(荧光类别和强度)。(iii)将这些反应信息进行计算机整合，即可得到“展示”在测序板上的DNA片段的序列信息。然而，这种高通量测序方法并不能“真正”测得某物种全基因序列，仅能得到全基因组序列之中随机选择的短片段DNA的序列信息。组合这些短片段DNA序列，很难得到一个完整的基因组DNA序列，因此更不能有效检测此基因组的各种变异，包括单核苷酸多态性和长片段的结构性变异。要注意的是，这些基因组变异才是我们实际应用中最关心的内容。
由短片段DNA序列拼接出完整的基因组DNA序列，需要跨越一个几乎不可解决的数学难题。我们以人类的基因组为例，其由约32亿个碱基组成，分为23(24)条染色体(线性DNA序列)。如果我们所测得短片段均是70个碱基长度的序列，由这样的序列作为起点而尝试去拼接人类基因组DNA的全序列。完成拼接的第一个先决条件是，不同位置的实际序列，在70个碱基范围内不能发生重复或者类似(具有一个碱基差别的类似，这考虑了测序过程中可能产生约1％的错误)。这个条件在很多的染色体序列中是不能满足的。即便假设在70个碱基范围内不发生重复或类似，想得到完整的人类基因组序列，我们需要(3200000000/70)×k个位置随机选择的片段。这个系数k得上百甚至更多，以保证我们每段拼接都有足够好的重叠，进而保证每段拼接都有足够的可信性。
为了“真正”拼接测序某一物种的全基因DNA序列，特别是未知生物的全基因序列信息， 我们发展了一种全基因组DNA序列拼接测序方法。该方法的优点在于，通过特殊的测序底物制备策略，为测序的短片段保留了基因组位置信息，使得每一个短片段不再是孤立的，而是基因组DNA片段(100k甚至更长)的一员。在这种情况下，在70个碱基范围内发生序列重复或相似的片段也可以精确拼接到全基因组序列中。对于可能发生的各种基因组变异，特别是长片段结构性变异，可以通过基因组位置信息进行精确测量和拼接。总的看来，我们发明的拼接测序方法不再局限于“全基因组重测序”，可以对任何的未知物种的基因组，通过类似“编藤条”的方式拼接出全部DNA序列。
发明内容
发明目的是在制备测序底物的同时保留测序片段的位置信息，使得可以拼接出物种的全基因组DNA序列。所采用的方案如下：
1、针对100到500kb的基因组DNA片段，在其两端添加5’磷酸化和非磷酸化两种不同接头(这些接头是特制的DNA双链，其模式见图1中Adapter A和Adapter A’)，或者在操作过程中逐个添加5’磷酸化和非磷酸化接头的方法，使得整个DNA片段的一端以稳定的磷酸二脂键锚定到测序板上，而另一端仅通过碱基配对的方式(以5’非磷酸化接头的粘末端)与测序板上的扩增引物相互作用。在这里，测序板是指布满单链DNA扩增引物的平面支持物。T4DNA连接酶能够连接接头和测序板上单链DNA扩增引物的3’端的原因在于，接头的粘末端和引物可以很好的配对(图1中Adapter A和Adapter A’的粘末端)。然后加入T4 Polynucleotide Kinase，将5’非磷酸化的接头磷酸化(图3中的d，e，f)。
2、在流动槽中添加电泳缓冲液，并在两端施加0.1～5V/cm的电场，时间在10分钟到12小时，并采用45到15度逐步降温的方式，使得基因组DNA片段的一端(对应于最初5’非磷酸化接头一端)指向正极方向。这时，此端仍以碱基配对的方式与测序板上的扩增引物相连，在较低的温度下保持DNA的线性走向。终止电泳并保持液流流动，添加T4DNA连接酶将此端连以磷酸二脂键的方式与测序板上的扩增引物稳定相连(图3中的g和图4中的h)。
3、添加双链DNA特异的缺刻内切酶(以Nt.CviPII缺刻内切酶为最常用)，以10到50kb的密度在双端已锚定的基因组DNA片段上随机产生缺刻，然后加入T7外切核酸酶从缺刻5’磷酸位置除去50到100个核苷酸(图4中的i)。
4、将3’末端含有8bp随机序列的DNA引物(图1中Prober A)通过T4DNA连接酶连接到缺刻的5’端，然后利用单链DNA特异的连接酶(此种酶的经典类型即T4RNA连接酶，另有更高效的商用单链DNA连接酶)将引物5’末端与测序板上的扩增引物3’端共价结合(图4中的j，k)。
5、采用步骤3中的方法，以500到1000个核苷酸的密度随机产生缺刻，然后将5’末端含有 8bp随机序列和测序测序相关序列的DNA片段(图1中Prober B)连接到缺刻的3’端(图5中的l，m)。
6、加入0.126％的NaOH溶液，使得整个基因组DNA片段解体(由于大量缺刻的存在，整个基因组DNA片段会很快变性解体)，并进行NaOH溶液清洗以除去没有共价结合的DNA片段(来自基因组DNA片段的碎片)。在测序板上，按照步骤3中的缺刻位置会分布有一连串的长度在500～1000bp左右的DNA单链片段。以测序板上的序列为扩增引物，进行10轮以上的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，使得每个捕捉片段都在测序板上形成具有相同序列的克隆簇(图5中的n，o)。后续的操作可以采用已成熟的“边合成边测序”方法(Illumina)，或者“连接测序”的方案(Applied biosystem)对这些克隆簇DNA的两端序列进行测序。
7、由短片段拼接整个基因组DNA序列的策略：(i)将每个克隆簇DNA的两端序列分别定义为两个read；采用优化的算法将所有的read序列进行匹配比较，保留具有重叠性质的匹配以组成总的“匹配库”。在这里优化的匹配算法是指提取每个read的部分序列(每个read产生多个序列，既能保证匹配灵敏度，也能“容忍”单个碱基突变的测序偏差和单核苷酸多态性)，以这些部分序列做出5bp序列类型的“指纹数据”。通过指纹数据排序比较，可以快速搜索出具有真实匹配的read。(ii)从“匹配库”中任取一个匹配，按照重叠匹配关系延伸下去，可以构建一个由read重叠起来的“可能的”大序列。(iii)如果这个大序列在2000bp的范围遇到了属于同一克隆簇的另一个序列，那么这个大序列下属匹配的打分值增加1；如果这个大序列在50kb范围遇到了属于同一基因组DNA片段的read，那么这个大序列的下属匹配的打分值增加1。(iv)串联起打分值最高的“可能的”大序列，即为整个基因组(染色体)的测序序列。如果出现“二分”性质的打分值的分支，那么这个分支就是来源于基因组变异的多态性序列。
以往的测序方法中，由于各种限制并不能完成对所有基因组的从头测序(denovo sequence)，只能根据现有的参考序列对测得的短序列进行mapping。即便结合传统方法进行测序、然后进行拼接；所得到的序列，由于只依赖于序列拼接的相似性等有限信息，所得序列的正确性，对序列变异的检测结果都很有大的疑问。我们的方法，可以通过所得序列克隆簇的距离，及本克隆簇内两个测序序列的可能距离，对所拼接的“可能序列”进行系统评价。这样就使得传统方法不能测得的复杂序列得到有效测序和拼接。总的说来，我们采用了更稳定可靠的拼接方案，可以实现整个未知基因组序列的顺利拼接。
附图说明
图1、发明方案中所用Adapter和引物序列的模式图。在Adapter A和A’中，红色是与平 面支持物上扩增引物相配对的序列，而黑色部分表示测序所用的引物序列，而蓝色是标识基因组DNA片段起始位置的序列。在ProberA中，橙色表示的是八个随机核苷酸组成的序列，而黑色部分表示测序所用的序列。在Prober B中，橙色表示的是八个随机核苷酸组成的序列，红色表示与扩增引物匹配的序列，并有部分配对链组成双链，以排除测序板上扩增引物的干扰，而黑色部分表示测序所用的序列。在Adapter A、Adpater A’、Prober A和Prober B中，可根据实际要求，在扩增序列和测序序列之间加入若干核苷酸的间隔序列。
图2、一种使基因组DNA片段形成非对称接头的方法。其中a是基因组DNA片段，b是经修复和末端加A(腺嘌呤脱氧核苷酸)的DNA片段，而c是利用AdapterA和A’比例为1∶3时进行连接的结果。具体见实施例2步骤1。
图3、基因组DNA片段锚定在测序版上的一种定向化方案。其中d是布满单链DNA扩增引物的平面支持物，e两端连有不同Adater的基因组DNA片段，f是已经锚定一端的DNA片段，而g是通过电泳的方法使DNA指向正极方向。具体见实施例1步骤5、6、7、8。
图4、定向锚定的DNA片段上形成缺刻的方法。其中h是两端已经定向锚定的DNA片段，i是含有缺刻的DNA片段，j中黑色表示缺刻5’端连接有含有测序相关序列的单链DNA片段(Prober A)，而k中缺刻处的单链DNA的5’端与平面支持物上的扩增引物的3’端具有连接。具体见实施例1步骤9、10、11。
图5、通过缺刻捕捉实现DNA子序列按位置固定在测序板上。其中1中的黑色部分是新产生的缺刻，m中的新缺刻3’端与ProberB的5’端相连接，n表示变性后的缺刻捕捉位置所留下的500～1000bp的单链DNA，o是这些单链DNA形成局部克隆簇后的示意图。这里要注意的是在o中，沿着最初锚定的基因组DNA片段位置，会产生一些列按照“线性”序列排列的克隆簇。克隆簇的距离和缺刻间DNA的长度有密切对应关系。具体见实施例1步骤12、13、14、15、16。
图6、基因组DNA片段定向锚定在测序板上的一种备选方法。这里要注意的是，b中Adapter A是连接到平面支持物上的，而e中直到基因组DNA片段一端锚定后，才在另一端添加AdapterA’。具体见实施例1步骤2、3、4。
具体实施方式
实施例1：
1、蛋白酶k/苯酚法抽提血液样本的基因组DNA。为保证DNA的完整性(150kb以上)，在苯酚进行抽提后，将水相DNA转移到透析袋(透析截留分子量1000kDa)中，并在4摄氏度透析3小时。后续的操作中将直接在透析袋内进行，直至DNA片段连接到测序板上。在每步酶反应进行之前，将透析袋在10倍量以上的缓冲液(与反应体系相同的缓冲液) 透析30分钟，4摄氏度。在进行酶反应时，将透析袋放入含有少量缓冲液的50ml管中进行。酶反应之后，将透析袋放入10倍量以上的缓冲液(匹配下次反应)，进行两次透析，以除去上次反应残留的酶和缓冲液。对少量DNA样品，可考虑用Millipore 100kDa的超滤管，透析时间延长1倍。
2、用T4DNA Polymerase对DNA进行末端平滑化。透析除去T4DNA Polymerase，然后加入BcaBestDNA Polymerase在DNA的两端3’位置加核苷酸A(腺嘌呤脱氧核苷酸)。
3、利用T4DNA ligase可以使Adapter A连接到测序板上，15摄氏度，6小时以上。此时，AdapterA需保持较低的用量，以使连接后的AdapterA具有较大的间隔，具体投放量可以按照如下计算：(测序板面积(um2)/1600um)/80％。此后的酶反应过程都是在流动槽-测序板系统中进行的。每一步反应后的酶、缓冲液及可能多余DNA残留，都可以很容易通过供液-排液系统清除掉，下面每一步不再详述。
4、利用T4DNA ligase将步骤2中制备的DNA片段连接到测序板上。由于Adapter A的突出核苷酸T和DNA片段的A互补(图1)，并且投入的DNA片段量大于Adapter的量至少5倍，因此，可以以很高效率的连接到测序板上(图6)。
5、加入过量的Adapter A’，由于其具有突出T末端，可通过T4DNA ligase连接到DNA片段的另一端。由于Adapter A’的粘末端对应的5’位置没有磷酸基团，所以DNA片段的另一端仍可以自由移动。
6、加入T4 Polynucleotide Kinase，将Adapter A’的粘末端5’位置进行磷酸化。
7、更换电泳缓冲液，在流动槽中进行电泳，使得DNA片段指向一个方向。电泳最初电压可控制在0.5V/cm，并适当提示整个体系的温度在45度左右，使得DNA片段粘性末端具有较大的自由活动倾向。15分钟后，逐步降低整个体系的温度，最终控制在15度。电泳缓冲液可以采用30mM Tris-HCl，pH 8.0。对于常用的流动槽，可以考虑在进液管和出液管处加入电极，并在电极处保留较多的缓冲液，使得电泳过程中产生的气体及时排除。
8、缓慢加入浓缩1M MgCl2、1M DTT、50mM ATP，时最终浓度为10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP。加入T4DNA连接酶，使最终浓度为0.5个单位。一种备选方案是，可在控制电压0.1V/cm的同时，考虑分三批加入至最终浓度0.6个单位的连接酶。反应时间为3小时。
9、加入微量的Nt.CviPII缺刻内切酶，在双链DNA上形成缺刻。此时需要控制加入酶的量和反应时间，使得约20kb一个缺刻。利用T7 Exonuclease扩大缺刻，对于平均每个缺刻位置，沿着5’端切去50～100个核苷酸。
10、加入过量3’末端带有8个随机核苷酸的测序引物混合物(Prober A)，并加入T4DNA 连接酶。在此反应条件下，测序引物的3’端会根据8个随机核苷酸的配对情况，按照序列特异性连接到缺刻处的5’磷酸位置。
11、加入CircLigaseTM ssDNA Ligase，此时对于每个缺刻处已经连接上的测序引物的5’端，周围有成千上万个扩增引物的3’端可供连接。酶反应条件为15度3小时。
12、再次加入Nt.CviPII缺刻内切酶，在双链DNA上形成缺刻，并用T7 Exonuclease扩大缺刻50～100个核苷酸。此时控制缺刻内切酶的用量和反应时间，使得约500bp一个缺刻。
13、加入过量5’末端带有8个随机核苷酸的测序引物(含扩增序列)混合物(Prober B)，并加入T4DNA连接酶，使得切刻处的3’羟基和Prober B共价结合。
14、加入0.126％的NaOH溶液，使基因组DNA解体；并利用液流进行清洗，除去体系中没有与平面支持物共价结合的DNA。此时，根据步骤9中缺刻形成位置，锚定有一些列的单链DNA片段。
15、利用测序板上的引物作为扩增引物，进行10轮以上的PCR反应，可以在局部形成由相同DNA片段组成的克隆簇(示意图可见图5中的o)。
16、利用“边合成边测序”的方法(Illumina)进行测序。
17、我们附图中提供的Adapter和引物序列为模式序列，只要能保证适合作为扩增引物和测序引物即可。但是，此时引物设计应注意，序列中不能含有GC和CG序列，因为缺刻内切酶Nt.CviPII作用于这样的序列，会使部分已锚定的基因组片段去“锚定”。另外，GC的序列的具有高密度分布的特征，同时，我们采用T7 Exonuclease在DNA片段5’端随机切去50bp～100bp的核苷酸，这两者共同保证了我们的缺刻捕捉位置是完全随机分布的。
18、在最初设计时，Adapter A和A’在测序序列后分别加入了AGT和TAC的特征序列，这有利于在最终结果中，判断基因组DNA片段的头和尾巴。对于测序板上，沿可能的捕捉的缺刻位置分布的DNA片段，我们采用横坐标和纵坐标的相关系数(co-relation)＞0.85作为判断标准，除去了一些不可信的捕捉序列组。最终我们得到了约5亿个数据组，68亿个reads。
19、我们编写了专门的序列拼接工具bSeqAssemblyer。按照前述的由短片段拼接整个基因组序列的策略，我们可以拼接出总长度约31亿的DNA序列，约占参考人类基因组序列的96.5％。
要注意的是，在实验步骤1、2、3、4中的DNA片段较大，要尽量减少操作过程中剪切力对DNA的影响。由于Nt.CviPII缺刻内切酶的切割位点是GC序列特异的，所以在Adapter A、Adapter A’，Prober A、Prober B和扩增引物设计中要避免正向和反向GC序列的出现，以防止不必要的误切而导致有效片段克隆簇的减少。
实施例2：
在前述操作中，实际DNA片段的使用量较大，并且前期操作过程较繁琐，因此，我们尝试采用改进的策略，在试验最初，即在基因组DNA片段的两侧加入不对称的Adapter。具体步骤如下：
1、承接实施例1中步骤2之后，我们按照1∶3的比例加入Adapter A和A’，然后加入T4DNA连接酶，15摄氏度反应时间3小时。此时，两端含有Adapter A、两端分别含有Adapter A和A’，两端含有Adapter A’的DNA片段的比例为1∶6∶9(图2)。
2、将基因组DNA片段导入测序板中，加入T4DNA连接酶，15摄氏度反应3小时。此时，只有至少一端含有Adapter A的DNA片段被锚定，其余DNA片段仍处于游离状态。液流清洗后，只有共价锚定的DNA片段保留在测序板上。
3、加入T4Polynucleotide Kinase，将Adapter A’的粘末端5’位置进行磷酸化。后续步骤采用和实施例1中相同的操作。
4、对于测序板上，沿可能缺刻位置分布的DNA片段，我们采用横坐标和纵坐标的相关系数(co-relation)＞0.79作为判断标准，除去了一些不可信的捕捉序列组。最终我们得到了约5亿个数据组，65亿个reads。利用拼接工具bSeqAssemblyer，我们可以拼接出总长度约31亿的DNA序列，约占参考人类基因组序列的96.2％。
Claims (12)
1.一种全基因组DNA序列拼接测序方法，其特征在于基因组DNA片段在平面支持物上的定向锚定，锚定片段在随机位置产生和扩大缺刻，缺刻位置5’磷酸基团的捕捉及测序-扩增序列的连接，缺刻捕捉位置DNA的碎裂及测序-扩增序列的连接，捕捉位置的局部DNA片段扩增和测序，局部测序片段拼接完整基因组序列。
2.如权利要求1所述基因组DNA片段在平面支持物上的定向锚定，锚定片段在随机位置产生和扩大缺刻，缺刻位置5’磷酸基团的捕捉及测序-扩增序列的连接，缺刻捕捉位置DNA的碎裂及测序-扩增序列的连接，捕捉位置的局部DNA片段扩增和测序，其特征是在布满单链DNA扩增引物的平面支持物上进行的一系列酶-DNA生物化学反应。
3.如权利要求1所述基因组DNA片段在平面支持物上的定向锚定，其特征是100kb到500kb的DNA片段两端添加5’磷酸化和非磷酸化两种不同接头，并通过5’磷酸化的接头与平面支持物上的单链DNA扩增引物进行DNA连接酶所催化的连接。
4.如权利要求1所述基因组DNA片段在平面支持物上的定向锚定，其特征是使用0.1到5V每厘米的电场强度、10分钟到12小时的电泳。
5.如权利要求1所述基因组DNA片段在平面支持物上的定向锚定，其特征是将单侧5’非磷酸化接头在电泳前用激酶磷酸化，在电泳后将此接头与平面支持物上的单链DNA扩增引物进行DNA连接酶所催化的连接。
6.如权利要求1所述锚定片段在随机位置产生和扩大缺刻，其特征是以10到50kb的密度，用双链DNA特异的缺刻酶随机产生缺刻，并用T7核酸外切酶从缺刻处5’磷酸位置除去50到100个核苷酸。
7.如权利要求1所述缺刻位置5’磷酸基团的捕捉及测序-扩增序列的连接，其特征是加入3’端含有8bp随机序列并含有测序引物相关序列的单链DNA片段，并用DNA连接酶将此DNA片段连接到缺刻处5’磷酸位置。
8.如权利要求7所述缺刻位置5’磷酸基团的捕捉及测序-扩增序列的连接，其特征是将缺刻位置已连接单链DNA片段5’端与平面支持物上的单链DNA扩增引物的3’端，通过单链DNA连接酶进行催化连接。
9.如权利要求1所述缺刻捕捉位置DNA的碎裂及测序-扩增序列的连接，其特征是以500到1000bp的密度，用双链DNA特异的缺刻酶随机产生缺刻，并用T7核酸外切酶从缺刻处5’磷酸位置除去50到100个核苷酸。
10.如权利要求9所述缺刻捕捉位置DNA的碎裂及测序-扩增序列的连接，其特征是加入5’端含有8bp随机序列并含有测序引物相关序列的单链DNA片段，并用DNA连接酶将此DNA片段连接到缺刻处3’羟基位置。
11.如权利要求1所述捕捉位置的局部DNA片段扩增和测序，其特征是对捕捉的DNA片段进行原位扩增，并采用现有的“边合成边测序”或者“连接测序”的方法测序。
12.如权利要求1所述局部测序片段拼接完整基因组序列，其特征是测量捕捉的局部DNA片段在平面支持物上的距离，以此距离作为权值对局部DNA片段拼接结果进行打分。
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