CN102728102B

CN102728102B - 一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺

Info

Publication number: CN102728102B
Application number: CN201210249240.6A
Authority: CN
Inventors: 伍长华; 吴强; 关晓峰; 樊钒
Original assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-07-18
Also published as: CN102728102A

Abstract

本发明公开了一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺，它包括以下步骤：（I）将凝胶装入A段层析柱和B段层析柱，用洗脱液平衡2个柱体积；（II）a泵连接A段柱上端，上样，然后洗脱0.2～0.3个柱体积；（III）断开A、B两段层析柱，将b泵连接B段层析柱的上端；同时对A、B两段层析柱洗脱，收集B段层析柱洗出液起峰至KD值小于X(0~0.4)的部分；（IV）停止洗脱。本发明的有益效果是：提高了串联式凝胶层析柱的纯化效率，降低了大生产时纯化工艺中的设备成本，扩大了凝胶层析纯化技术的应用领域；有效的保护了层析柱中的凝胶；且适用于所有利用凝胶层析分离纯化大分子物质的工艺。

Description

一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺

技术领域

本发明涉及凝胶层析技术领域，特别是一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺。

背景技术

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。

Vo简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。

Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL/g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即

Ve＝Vo＋Vi

对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：

Ve＝Vo＋K_D·Vi

式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。K_D为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。K_D可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。

Ve＝Vo＋K_D·Vi

可改写为：

K_D=（Ve-Vo）/Vi

当K_D＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；

当K_D＝1时，即Ve小分子＝Vo＋K_D·Vi，说明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。

但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子＝Vo＋0.8Vi；当0＜K_D＜l时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，K_D愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；K_D＝0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo+0.5Vi。

凝胶层析技术的优点：凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。

凝胶层析技术的缺点：在大生产中，由于需要较高的分离效率，通常需要设计直径达20cm的大型层析柱，但由于技术原因，大型层析柱不能达到1m的有效分离柱长，通行做法是将两根50cm的层析柱串联起来使用，达到理想的分离效果。串联式大型凝胶层析柱虽然解决了工业化生产上的纯化效率需求，但一套串联式大型凝胶层析系统的价格十分昂贵，而其中主要的成本集中在凝胶层析柱上。因此，提高层析柱的使用效率是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种提高纯化效率，降低设备成本的大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺，它包括以下步骤：

（I）将凝胶装入A段层析柱和B段层析柱，用管道连接A段层析柱和B段层析柱后，用洗脱液平衡2个柱体积，然后测柱效，柱效合格后，标定层析柱测出V₀和V_t；

（II）a泵连接A段柱上端，按1～10%的上样体积上样，然后将a泵进液管道放入洗脱液中，开启a泵洗脱0.2～0.3个柱体积；

（III）断开A、B两段层析柱，将b泵连接B段层析柱的上端；同时开启a泵、b泵分别对A、B两段层析柱洗脱0.4～0.5个柱体积，收集B段层析柱洗出液起峰至K_D值小于X(0~0.4)的部分；

（IV）A、B两段层析柱各自洗脱0.4～0.5个柱体积后，停止洗脱。

上述工艺所需要的设备器材为：需要进行分离纯化的样品，样品洗脱液，适合分离纯化样品的凝胶，一根由A、B两段凝胶层析柱串联的层析柱M，两组独立洗脱液运行泵a泵、b泵和紫外检测器。

本发明具有以下优点：改进后的新工艺，在不增加层析柱的负荷的条件下，用更少的时间完成了纯化过程，并且保持了纯化样品的回收率。改进后的工艺提高了串联式凝胶层析柱的纯化效率55~75%。另外，纯化洗脱时，A、B段分离后，存在于A段层析柱中的小分子物质，直接被洗出，未进入B段层析柱，减小了B段层析柱的洗脱载荷，有效的保护了层析柱中的凝胶。

因此，本发明提高了串联式凝胶层析柱的纯化效率，降低了大生产时纯化工艺中的设备成本，扩大了凝胶层析纯化技术的应用领域；有效的保护了层析柱中的凝胶。经过多次试验证明本发明适用于所有利用凝胶层析分离纯化大分子物质的工艺；但须满足待分离物质的收集段在V₀起始至K_D≤0.4的洗脱段内。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1：

本实施例是对b型流感嗜血杆菌结合疫苗的纯化，所使用的设备器材有：Hib多糖-TT结合物原液（Hib—b型流感嗜血杆菌，TT—破伤风类毒素），0.2mol/LNaCl溶液，Sepharose4FF凝胶，一根由A、B两段（每段有效柱长50cm，切面积20cm²）凝胶层析柱串联的层析柱M，两组独立洗脱液运行泵a泵、b泵，紫外检测器。

一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺，其包括以下步骤：

（I）将Sepharose 4FF凝胶装入A段层析柱和B段层析柱，用管道连接A段层析柱和B段层析柱后，用0.2mol/L NaCl溶液平衡2个柱体积(柱体积:2000ml)，然后测柱效，柱效=3500，标定层析柱测出V₀=535ml和V_t=1660ml；

（II）a泵连接A段柱上端，上样100ml，然后将a泵进液管道放入洗脱液中，开启a泵洗脱400ml；

（III）断开A、B两段层析柱，将b泵连接B段层析柱的上端；同时开启a泵、b泵分别对A、B两段层析柱洗脱1000ml，收集B段层析柱洗出液V₀至K_D值小于0.2的部分；

（IV）A、B两段层析柱各自洗脱0.5个柱体积后，停止洗脱。

改进后的纯化结果与改进前的结果对比如下表所示：

结果分析：改进后的新工艺，在不增加层析柱的负荷的条件下，用更少的时间完成了纯化过程，并且保持了纯化样品的回收率。改进后的工艺提高了串联式凝胶层析柱的纯化效率71.4%。另外，纯化洗脱时，A、B段分离后，存在于A段层析柱中的小分子物质，直接被洗出，未进入B段层析柱，减小了B段层析柱的洗脱载荷，有效的保护了层析柱中的凝胶。

实施例2：

本实施例是对流脑A群结合疫苗纯化，所使用的设备器材有：流脑A群多糖-TT结合物原液，0.2mol/L NaCl溶液，Sepharose CL-4B凝胶，一根由A、B两段（每段有效柱长50cm，切面积20cm²）凝胶层析柱串联的层析柱M，两组独立洗脱液运行泵a泵、b泵，紫外检测器。

（I）将Sepharose CL-4B凝胶装入A段层析柱和B段层析柱，用管道连接A段层析柱和B段层析柱后，用0.2mol/L NaCl溶液平衡2个柱体积(柱体积:2000ml)，然后测柱效，柱效=5500，标定层析柱测出V₀=525ml和V_t=1645ml；

（II）a泵连接A段柱上端，上样20ml，然后将a泵进液管道放入洗脱液中，开启a泵洗脱500ml；

（III）断开A、B两段层析柱，将b泵连接B段层析柱的上端；同时开启a泵、b泵分别对A、B两段层析柱洗脱900ml，收集B段层析柱洗出液V₀至K_D值小于0.25的部分；

（IV）A、B两段层析柱各自洗脱900ml后，停止洗脱。

改进后的纯化结果与改进前的结果对比如下表所示：

结果分析：改进后的新工艺，在不增加层析柱的负荷的条件下，用更少的时间完成了纯化过程，并且保持了纯化样品的回收率。改进后的工艺提高了串联式凝胶层析柱的纯化效率64.3%。另外，纯化洗脱时，A、B段分离后，存在于A段层析柱中的小分子物质，直接被洗出，未进入B段层析柱，减小了B段层析柱的洗脱载荷，有效的保护了层析柱中的凝胶。

实施例3：

本实施例是对流脑C群结合疫苗纯化，所使用的设备器材有：流脑C群多糖-TT结合物原液，0.2mol/L NaCl溶液，Sepharose 4FF凝胶，一根由A、B两段（每段有效柱长50cm，切面积20cm²）凝胶层析柱串联的层析柱M，两组独立洗脱液运行泵a泵、b泵，紫外检测器。

（I）将Sepharose 4FF凝胶装入A段层析柱和B段层析柱，用管道连接A段层析柱和B段层析柱后，用0.2mol/L NaCl溶液平衡2个柱体积(柱体积:2000ml)，然后测柱效，柱效=3500，标定层析柱测出V₀=545ml和V_t=1665ml；

（II）a泵连接A段柱上端，上样200ml，然后将a泵进液管道放入洗脱液中，开启a泵洗脱600ml；

（III）断开A、B两段层析柱，将b泵连接B段层析柱的上端；同时开启a泵、b泵分别对A、B两段层析柱洗脱800ml，收集B段层析柱洗出液V₀至KD值小于0.3的部分；

（IV）A、B两段层析柱各自洗脱800ml后，停止洗脱。

改进后的纯化结果与改进前的结果对比如下表所示：

结果分析：改进后的新工艺，在不增加层析柱的负荷的条件下，用更少的时间完成了纯化过程，并且保持了纯化样品的回收率。改进后的工艺提高了串联式凝胶层析柱的纯化效率57.1%。另外，纯化洗脱时，A、B段分离后，存在于A段层析柱中的小分子物质，直接被洗出，未进入B段层析柱，减小了B段层析柱的洗脱载荷，有效的保护了层析柱中的凝胶。

Claims

1.一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺，其特征在于：它包括以下步骤：

（Ⅰ）将凝胶装入A段层析柱和B段层析柱，用管道连接A段层析柱和B段层析柱后，用洗脱液平衡2个柱体积，然后测柱效，柱效合格后，标定层析柱测出V₀和V_t；

（Ⅱ）a泵连接A段柱上端，按1～10%的上样体积上样，然后将a泵进液管道放入洗脱液中，开启a泵洗脱0.2～0.3个柱体积；

（Ⅲ）断开A、B两段层析柱，将b泵连接B段层析柱的上端；同时开启a泵、b泵分别对A、B两段层析柱洗脱0.4～0.5个柱体积，收集B段层析柱洗出液起峰至K_D值小于0.2～0.3的部分；

（Ⅳ）A、B两段层析柱各自洗脱0.4～0.5个柱体积后，停止洗脱。