CN102725417B - 用于评估作为疾病早期标志物的糖形的凝集素测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于评估作为疾病的生物标志的蛋白糖形的方法、组合物、装置和试剂盒。将纯化的重组形式凝集素用作检测分子以特异性标记在疾病状态中表达的靶糖类。重组凝集素的高亲和力使用于疾病例如但不限于癌症或肝病诊断的测定得以自动化。

Description

用于评估作为疾病早期标志物的糖形的凝集素测定

交叉引用

本申请要求保护于2009年8月5日提交的美国临时申请号61/231400优先权的权益，其通过引用结合到本文中。

发明背景

多种蛋白以两种或更多种不同的同工型存在，其差异仅在于糖基化模式。这种差异，或差异糖基化的同工型的相对比例，可为疾病或病症的指征并且因而需要能够区分差异糖基化的同工型的测定系统。

抗体用于区分内源性蛋白的差异糖基化同工型的应用是有问题的，因为产生特异性结合或优先结合内源性糖基化蛋白的特定同工型的抗体的成功率相对低。

此外，已显示对内源性蛋白差异糖基化同工型的相对浓度的测定在临床上是重要的。Keir等论述了患有糖蛋白糖链缺陷综合征(carbohydrate deficient glycoproteinsyndrome)或先天性糖蛋白糖基化缺陷(congenital disorder of glycosylation)的患者中转移糖基化同工型的相对丰度异常(Keir等.Ann.Clin.Biochem.36：20-36(1999)。具有翻译后糖基化的任何蛋白质可潜在地以不同糖基化同工型存在。因此临床相关蛋白质可以不同糖基化同工型存在，包括癌症和其它疾病的糖基化标志物，所述标志物包括碱性磷酸酶、甲胎蛋白、人绒膜促性腺激素以及可能包括朊病毒蛋白(CD230)。

本发明中其它与病症相关并认为是用于开发测定法的潜在靶标的糖蛋白包括但不限于，α-1-酸糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、触珠蛋白、甲状腺球蛋白、前列腺特异性抗原、HEMPAS红细胞带3(与先天性红细胞生成异常II型贫血相关)、PC-1浆细胞膜糖蛋白、CD41糖蛋白IIb、CD42b糖盏蛋白(glycocalicin)、CD43白细胞唾液酸糖蛋白、CD63溶酶体膜相关糖蛋白3、CD66a胆汁糖蛋白、CD66f妊娠特异性b1糖蛋白、CD164多-糖基化核心蛋白24以及Cd235血型糖蛋白家族。

橙黄网胞盘菌凝集素(Aleuria aurantia lectin)(AAL)为312个氨基酸的蛋白质，其不含糖链而含有5个针对L-岩藻糖或L-岩藻糖-连接的寡糖的结合位点。与其它凝集素相比，AAL的多价性质赋予其针对糖类配体异常高的结合亲和力(微摩尔)。商业化制备AAL基于通过与岩藻糖-淀粉柱的结合来分离并纯化凝集素。用50mM L-岩藻糖将AAL从柱洗脱出来(Fujihashi等)。然而，结构和生化分析显示，由于此制备过程，市售AAL的5个配体结合位点中的3至5个被岩藻糖占据(Olausson等，Amano等，Fujihashi等和Wimmerova等)。因此，通过这些方法产生的AAL缺乏掺入到临床显著性诊断测定中所需的特异性和亲和力。

因此，需要可选择性区分两种或更多种具有不同糖基化模式的糖蛋白同工型的测定法，所述方法包括使用具有针对特定岩藻糖基化寡糖高亲和力识别的重组形式AAL，接触含有表达两种或更多种糖形的糖蛋白的样品，并且直接或间接检测糖形差异作为疾病状态的指示。

发明概述

本发明包括高亲和力凝集素用于检测蛋白质上靶糖部分中变化的用途并且提供用于在疾病早期检测中自动诊断测定的方法。本发明的一个实施方案是针对患有炎性病症、自身免疫病症、癌症、感染或其它病症的个体的血试验，其中特定蛋白质的糖基化模式的改变用作血清中的生物标志或用作在细胞表面上表达的生物标志。通过鉴定糖形或对表达这些糖形的蛋白质水平进行定量来对这些蛋白质水平进行分析，这提供了用于检测患有疾病的人或处于疾病进展风险的人的简单血试验。包括将高亲和力凝集素用作测定平台(例如但不限于基于板或基于珠的形式)中检测物的测定法可容易地自动化用于临床或现场护理(point-of-care)环境。

附图简述

图1：具有blade 1至6的AAL单体的整体结构。椭圆体表明岩藻糖结合位点1至5和相应位点6。在位点1、2和4的3个棍棒模式(stick mode)显示岩藻糖分子。

图2：使用镍NTA板用于IgG0配体的亲和力比较。

图3：使用与市售AAL蛋白竞争的重组AAL蛋白的间接ELISA。

发明详述

本发明基于最近的发现(1)某些蛋白质的岩藻糖基化糖形的血清水平增加作为疾病例如癌症的早期生物标志和(2)免疫球蛋白G的α半乳糖基化糖形(agalactosylatedglycoform)(称作α-gal IgG0)的血清水平增加与肝病诊断相关(参见实施例1)。因此，与本领域已知的任何报告分子(例如放射标记、发色团或荧光团)连接的重组或突变体形式的凝集素(AAL)用作α-gal IgG0检测分子，所述分子对血液中岩藻糖基化蛋白是特异性的。并入ELISA或基于珠的测定系统提供了自动化平台的基础以测定患者疾病状态。

本发明的一个实施方案涉及大肠杆菌细菌和/或酵母中重组野生型AAL蛋白的制备和分离。提供的方法包括通过定点诱变或随机诱变而改变并且随后选择突变体AAL蛋白产生和制备突变体AAL蛋白。这些AAL蛋白对外臂L-吡喃岩藻糖基连接(outerarm L-fucopyranosyl linkage)具有高亲和力，更具体而言突变AAL蛋白对α1-2外臂L-吡喃岩藻糖基连接、α1-3外臂L-吡喃岩藻糖基连接或α1-4外臂L-吡喃岩藻糖基连接具有高亲和力，所述连接存在于患有疾病例如但不限于癌症的患者的血清蛋白生物标志中。

本发明的又一实施方案包括单独的或与外臂连接联合的核心岩藻糖(α1-6连接的)糖形作为凝集素靶标的用途。核心连接的岩藻糖是癌症的许多血清生物标志中主要的疾病指示物并且特异性检测与外臂连接相反的α1-6提供显著的生物标志。N224Q突变体对1-6连接比对外臂更具选择性。这提供了与现有技术相比显著的优势。因此，本发明的AAL蛋白对核心α1-6L-吡喃岩藻糖基连接具有高亲和力，所述连接存在于患有疾病例如但不限于癌症的患者的血清蛋白生物标志中。

AAL为312个氨基酸的蛋白质，其含有5个针对L-岩藻糖或L-岩藻糖-连接的寡糖的结合位点。与其它凝集素相比，AAL的多价性质赋予其针对糖类配体异常高的结合亲和力(微摩尔)。AAL的商业化制备通过与岩藻糖-淀粉柱的结合来分离并纯化。用50mM L-岩藻糖将AAL从柱洗脱出来(Fujihashi等)。结构和生化分析显示，由于此制备过程，市售AAL的5个配体结合位点中的3至5个被岩藻糖占据(Olausson等，Amano等，Fujihashi等和Wimmerova等)。

意想不到地发现，在细菌中产生并且采用镍亲和色谱从细菌分离的重组(r)AAL，与市售制备的AAL相比，具有对岩藻糖基化寡糖显著更高的结合亲和力，这通过表面等离振子共振研究、色氨酸荧光研究和酶联凝集素测定法来测定。

本发明的一个实施方案提供用于产生和制备高亲和力(重组)rAAL和/或突变rAAL的方法，这使得所有配体结合位点均可用于结合特定L-吡喃岩藻糖基连接，所述连接存在于α-gal IgG0中以及疾病和癌症的血清蛋白生物标志中。

本发明的另一实施方案将作为检测分子的高亲和力rAAL并入灵敏和特异性的基于血液的测定中，以对处于疾病例如但不限于癌症风险中的人进行测定。

产生并选择高亲和力诱变AAL

通过遵循制造商的实验方案将AAL-pUC57质粒转化到XL1 Red大肠杆菌增变株(Strategene)来获得随机诱变的AAL。

定点诱变集中在AAL中5个岩藻糖结合位点的数个的配体结合亲和力改变。β-螺旋桨基序在AAL中重复6次。该基序在凝集素中普遍保守并且构成配体结合域。已描述基序中五(5)个岩藻糖结合位点(参见图1)，并且每一位点对岩藻糖基化配体具有不同的亲和力。

如图1所示，位点2和4是高亲和力配体结合位点，而位点1、3和5的结合亲和力较弱。每一β折叠包含具体参与岩藻糖结合的高度保守残基。具体而言，位点2和4在Q22和Q75的位置分别具有保守谷氨酰胺残基，这使岩藻糖结合位点保持岩藻糖可接近的开放状态。位点3和5的相应残基是天冬酰胺N129和N224。因为这些天冬酰胺残基(N)比谷氨酰胺(Q)少一个碳，所以它们不与邻近的保守残基发生必需的氢键接触以使这些位点保持能量稳定的开放构型。开发了突变体AAL分子，N129和N224残基分别和组合地换成谷氨酰胺(N129Q，N224Q)，即AALN129Q、AALN224Q以及AALN129Q，N224Q以使这些位点结构上类似高亲和力结合位点。

竞争实验显示，与野生型蛋白质相比，这些蛋白质对IgG0配体具有更高的亲和力(参见图2)。这些结果表明随机诱变方法将确定L-吡喃岩藻糖基连接的特异性且高亲和力配体结合物，用于选择突变体。

本发明的另一实施方案涉及开发凝集素的突变体文库，用于选择本文特别提及的那些之外的其它糖结构。

将基于酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的展示和选择系统用于筛选及选择与特定L-吡喃岩藻糖基连接具有反应性的突变体AAL蛋白。简言之，挑选用AAL-pUC57转化并对其进行增变实验方案(mutator protocol)(Strategene)的200-400 XL1红色菌落库并制备质粒DNA。使用标准分子生物学技术将突变的AAL序列亚克隆到一种酵母展示载体pCT302中。该系统和载体在Broder和Wittrup and(2000)Methods Enzymology.第328卷，430-444中详述。将含有突变体AAL文库的酵母展示质粒转化到单倍体酵母株EBY100中并且如所述的培养。突变体AAL蛋白为诱导型表达并且在酵母的细胞表面上展示。根据在选择条件下与含有特定L-吡喃岩藻糖基连接的生物素化配体的结合，对酵母展示突变体AAL文库进行针对高亲和力结合的富集(Bergan，L.，J.A.Gross，B.Nevin，N.Urban，N.Scholler.Cancer Lett 255，263-74(2007))。对结合配体的细胞进行2轮链霉抗生物素磁珠富集(Miltenyi Macs)，随后进行3轮流式分选(Scholler等，Feldhaus等，Broder和Wittrup)。已显示该系统消除了在噬菌体展示文库中常见的表达偏袒和生长选择，并且一致地产生对所选克隆的快速富集，10⁵(Feldhaus等)。

如Scholler等描述的，将展示文库转换成分泌的突变体AAL文库。将突变体AALDNA从富集的展示文库分离并且通过缺口修复克隆到pTOR中以使突变体AAL蛋白分泌到培养基中。pTOR载体的特征包括；引导重组蛋白分泌的α前导序列(alpha prepro leader)和符合读框的6X His-标签添加以及在突变体蛋白C-末端的Avitag序列(Scholler等)。Avitag是生物素受体位点并且当用突变体AAL pTOR文库转化的单倍体细胞与表达大肠杆菌生物素连接酶基因(BirA)的相反交配型单倍体细胞交配时，其在特定赖氨酸残基处被生物素化。在固体培养基上选择分泌His-标签的生物素化突变体AAL蛋白的二倍体细胞并且在诱导分泌所述蛋白的条件下于液体培养基中培养所述细胞。按照制造商的实验方案，将二倍体细胞培养物上清液脱盐、浓缩并经缓冲液调节，用于镍-琼脂糖柱纯化AAL-His(His-Trap，Amersham)。随后可纯化His-标签的生物素化重组突变体AAL并且用于后续配体结合研究。

用于选择配体和其它L-吡喃岩藻糖基寡糖的突变体和野生型AAL的定量平衡结合通过BIAcore分析和酶联凝集素测定法来测定(Olausson等)。

突变体AAL蛋白对IgG0配体的高亲和力识别

将含有10X组氨酸标签的等量重组AAL(野生型或突变体)包被到镍NTA板并且用渐增量IgG0配体(X轴)孵育。将无标签的市购AAL(AAL-V)亦包被到镍NTA板或到高亲和力结合ELISA板上(AAL-Vc)并且用渐增量IgG0配体孵育。将板洗涤并且用荧光标记的抗-人IgG孵育，洗涤并在荧光检测器中读数。渐增的相对荧光表明更高的结合亲和力。结果显示在未饱和情况下，突变体AAL_M1(N129Q)展示最高信噪比，将检测限提高10-100倍至10ng/mL，并且将动态范围从10ng/mL增加至100ug/mL(参见图2)。这些结果表明重组突变体AAL蛋白将增加基于血液的测定的灵敏度和特异性从而检测血清IgG0水平中的细微变化。

实施例1：对肝硬化患者具有选择性的rAAL蛋白

与市售AAL相比，重组凝集素(rAAL)对IgG0配体显示更高的亲和力。在基于竞争ELISA的实验中使用血清样品，在肝硬化患者中与对照相比，rAAL具有显著更高的亲和力(参见图3)。

实验方案：

将96孔板用经高碘酸钠(NaIO₄)处理的小鼠IgG(1.0ug/孔)包被。将3uL来自肝硬化患者的血清(Gish 342)或来自正常供体的血清(Sigma)稀释至100uL并且将其加入抗体包被的孔中。将板洗涤并且随后在振摇下，用等量的未生物素化市售(Vector)AAL、未生物素化重组10X-His标签的(rAAL 10X)、未生物素化重组10X-His标签突变体AAL(rAALN129Q，N224Q))室温孵育30分钟。随后向每孔加入等量生物素化AAL并且在振摇下室温孵育1小时。如先前所述，将板洗涤并且用链霉抗生物素-800-IRDye孵育。将板洗涤并且使用LiCor Odyssey设备进行荧光定量。在不存在未生物素化AAL下，测量对照样品中生物素化AAL与IgG0的结合。

实验结果

竞争实验提供间接ELISA以测量未生物素化市售(Vector)蛋白和未生物素化rAAL蛋白干扰生物素化AAL与IgG0配体结合的能力。这定性表明未标签的AAL蛋白对IgG0配体的相对亲和力。

如图3所示，在基于竞争ELISA的形式中，与市购(Vector)AAL相比，rAAL蛋白在更大程度上降低信号强度。在来自肝硬化患者(Gish 342)的血清样品中，未生物素化市售(Vector)AAL与生物素化AAL竞争而导致与对照相比信号强度降低(信号输出从约35降至约20)。未生物素化野生型rAAL 10X和突变体rAAL(N129Q，N224Q)蛋白导致信号输出更大地降低(对比对照)，表明在来自肝硬化患者的血清中对IgG0的亲和力更高。Sigma＝阴性对照血清(来自未患肝病个体的血清)。

本发明的又一实施方案提供用于本发明测定方法的试剂盒，所述试剂盒包括对特定岩藻糖基化寡糖具有高亲和力识别的重组或突变体形式的AAL。

尽管通过提及特定实施方案来描述本发明，但本领域技术人员认识到可对其作出多种改变，例如改变本文描述的与AAL连接的检测分子的具体选择，并且将领会和理解的是，本发明的公开内容在不违背本发明更宽范围和精神下仅显示本发明的一些优选实施方案和优点。将领会和理解的是，本发明的这些发现仅仅是本领域普通技术人员可预期的许多另外潜在应用中说明性的那些，并且因此绝不以任何方式限制本发明。因此，根据详细的说明书连同权利要求书，本发明的其它目标和优点对于本领域技术人员而言清楚明了。

Claims (16)

1.用于制备对岩藻糖基化蛋白具有高亲和力的凝集素的方法，所述方法包括：

a.获得含有至少一个针对L-岩藻糖或L-岩藻糖-连接的寡糖的结合位点的凝集素；

b.通过定点诱变在至少一个所述结合位点中使凝集素突变；和

c.富集所述突变的凝集素，其中所述凝集素具有对岩藻糖基化蛋白提高的结合亲和力；

其中所述提高的结合亲和力针对所述岩藻糖基化蛋白上的核心L-吡喃岩藻糖基连接，

其中所述凝集素为在结合位点3含有突变N129Q、在结合位点5含有突变N224Q或含有两者的重组AAL。

2.权利要求1的方法，其中所述凝集素获自细菌。

3.权利要求1的方法，其中所述富集通过镍色谱来进行。

4.权利要求1的方法，其中所述凝集素还与1个或更多个组氨酸残基连接。

5.权利要求1的方法，其中所述凝集素还与报告分子连接。

6.通过权利要求1的方法产生的凝集素在制备用于区分两种或更多种糖蛋白同工型的试剂盒中的用途，所述区分包括：

a.获取含有糖蛋白的样品；

b.使所述糖蛋白与所述凝集素结合，其中所述凝集素对糖蛋白同工型具有高亲和力并且其中所述凝集素与报告分子连接；和

c.检测所述报告分子的存在情况，存在所述报告分子表明存在所述同工型。

7.权利要求6的用途，其中所述凝集素为与10个或更多个组氨酸残基符合读框连接的重组AAL。

8.权利要求6的用途，其中所述凝集素为具有与c-末端符合读框连接的1个或更多个组氨酸残基的重组AAL。

9.权利要求8的用途，其中所述同工型具有α-1，6连接的岩藻糖残基。

10.权利要求9的用途，其中所述凝集素还包括在以下位点中的至少一个突变：结构域2中的R24A、E36A、R77A、结构域2中的E898A、结构域4中的R179A、结构域4中的E191A及其组合。

11.通过权利要求1的方法产生的凝集素在制备用于检测患者疾病的试剂盒中的用途，所述检测包括：

a.从含有岩藻糖基化糖形靶蛋白的患者获取生物样品；

b.使所述凝集素与具有岩藻糖基化糖形的靶蛋白结合；

c.检测岩藻糖基化糖形的存在情况，其中存在的岩藻糖基化糖形的量改变表明存在疾病。

12.权利要求11的用途，其中所述疾病为癌症。

13.权利要求11的用途，其中所述凝集素为与1个或更多个组氨酸残基符合读框连接的重组AAL。

14.含有至少一个针对L-岩藻糖或L-岩藻糖-连接的寡糖的结合位点的重组凝集素，其中所述凝集素对核心连接的岩藻糖糖蛋白同工型比对外臂连接的岩藻糖糖蛋白同工型具有更大程度的亲和力，其中所述凝集素为在结合位点3含有突变N129Q、在结合位点5含有突变N224Q或含有两者的重组AAL。

15.权利要求14的重组凝集素，其中所述凝集素为与1个或更多个组氨酸残基符合读框连接的重组AAL。

16.权利要求14的重组凝集素，其中所述凝集素为具有与c-末端符合读框连接的1个或更多个组氨酸残基的重组AAL。