CN102719490B

CN102719490B - 一种木质纤维水解糖液的脱毒方法

Info

Publication number: CN102719490B
Application number: CN201210230821.5A
Authority: CN
Inventors: 余世袁; 勇强; 赖晨欢; 李鑫; 徐勇; 朱均均
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-07-05
Also published as: CN102719490A

Abstract

本发明公开了一种木质纤维水解糖液的脱毒方法，以有机改性膨润土为吸附剂吸附去除木质纤维水解糖液中的疏水性抑制物；其中，所述的有机改性膨润土是通过阳离子表面活性剂改性处理后具有疏水性的膨润土。本发明采用有机改性膨润土吸附处理木质纤维水解糖液，在不吸附可发酵性糖的基础上，去除了发酵抑制物，特别是大大降低了羟甲基糠醛及酚类抑制物的含量，减少了发酵抑制物对微生物生长发酵的协同抑制作用，从而提高了木质纤维素水解糖液的可发酵性能，与未经吸附处理的木质纤维水解糖液相比，微生物对木质纤维水解糖液的利用速率大幅度提高，发酵周期缩短，为木质纤维水解糖液脱毒提供了一个新途径。

Description

一种木质纤维水解糖液的脱毒方法

技术领域

本发明属木质纤维原料利用技术领域，具体涉及一种木质纤维水解糖液的脱毒方法。

背景技术

随着石油资源的枯竭，木质纤维原料生产生物能源与化学品的研究成为近年来的研究热点。木质纤维素主要包括纤维素、半纤维素及木质素三大组分。木质纤维原料利用的途径之一是将其中的纤维素及半纤维素降解为糖，进而被发酵成乙醇或其它化学品。木质纤维原料中的纤维素、半纤维素和木质素结合紧密，较难被纤维素酶水解，因此在酶水解前需要进行预处理，增加原料中纤维素对酶的可及性，从而提高酶水解效率。常用的预处理方法有稀酸水解法、蒸汽爆破法等。在涉及到酸或热的预处理过程中，不可避免地会产生对后续发酵产生抑制作用的物质。为了提高后续发酵效率，木质纤维水解糖液在发酵前需要脱毒处理。

预处理过程中产生的发酵抑制物主要包括：弱酸类物质（甲酸、乙酸和少量乙酰丙酸）、醛类物质（糠醛、5-羟甲基糠醛）和酚类化合物。弱酸类物质对微生物生长及乙醇发酵的抑制主要是通过破坏存在于细胞膜上的H⁺离子梯度，通过控制发酵pH值可以减缓其抑制作用。醛类物质对酵母发酵的抑制作用主要表现在对菌体生长的抑制和对糖代谢的直接作用。酚类化合物是预处理过程中木质素降解产生的一类疏水性较大的化合物（包括香草醛（酸）、4-羟基苯甲醛（酸）、紫丁香醛（酸）等），其对后续发酵表现出很强的抑制作用。因而发酵抑制物的去除，特别是醛类及酚类抑制物的去除对木质纤维水解糖液的发酵有重要的意义。

目前常用的脱毒方法主要有氢氧化钙过中和法、离子交换吸附、活性炭吸附、有机溶剂萃取法等，这些方法在一定程度上可以提高木质纤维素水解糖液的发酵性能，但却存在可操作性低、成本昂贵、酚类抑制物去除率低或者处理过程中可发酵糖损失大的问题。漆酶生物处理法虽然专门针对酚类化合物进行作用，但其涉及生物酶反应，处理条件比较严格，且针对不同的木质纤维原料处理效果差异较大。

膨润土是一种天然矿物，主要成份是铝硅酸盐蒙脱土，具有强吸水性、可塑性、粘结性和强离子交换性。由于膨润土表面硅氧结构极强的亲水性以及层间阳离子的水解，故未经改性的膨润土(原土)吸附处理有机物的性能较差。由于膨润土层间阳离子具有较好的离子交换性，用有机阳离子表面活性剂对膨润土进行改性,将有机阳离子利用离子交换嵌入膨润土中，使膨润土的吸附表面呈疏水性。如此制备的有机膨润土层间距明显大于原土，且对疏水性有机化合物的吸附能力也大大提高。针对木质纤维原料预处理后产生的疏水性发酵抑制物，采用有机膨润土进行吸附处理，可大大降低疏水性抑制物的含量，且操作条件简单，可用于脱除木质纤维水解糖液中的疏水性抑制物，实现木质纤维原料的高效利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是针对木质纤维原料水解糖液中疏水性发酵抑制物对微生物生长的强抑制作用，提供一种木质纤维水解糖液的脱毒方法，能够有效去除木质纤维水解糖液中疏水性发酵抑制物。

研究发现，木质纤维水解糖液的发酵抑制物化合物的抑制作用通常与疏水性呈正比。因此，如果选择适当的具有疏水性表面的吸附剂，在适当的吸附条件下，木质纤维水解糖液中的发酵抑制物即可通过疏水作用吸附在吸附剂表面，而相对亲水的可发酵单糖仍溶解在液相中。通过简单的固液分离方法即可实现疏水性发酵抑制物与原木质纤维水解糖液的分离，从而提高木质纤维水解糖液的发酵性能，缩短发酵周期，提高木质纤维原料炼制生物能源和化学品的效率。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种木质纤维水解糖液的脱毒方法，以有机改性膨润土为吸附剂吸附去除木质纤维水解糖液中的发酵抑制物；其中，所述的有机改性膨润土是通过阳离子表面活性剂改性处理后具有疏水性的膨润土。

其中，所述的阳离子表面活性剂为季铵盐阳离子型表面活性剂，优选十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基氯化铵，最优选十六烷基三甲基溴化铵。

其中，膨润土的改性处理方法为，将膨润土浸泡于阳离子表面活性剂的水溶液中，70~80℃搅拌反应1~3h，离心分离弃去上清，洗涤改性后的膨润土，70~80℃下烘干，105℃下活化1~2h，研磨过筛即得。

膨润土与表面活性剂的用量配比根据膨润土阳离子交换容量（CEC）来确定。膨润土阳离子交换容量（%）的测定方法见实施例1，表面活性剂用量按照如下公式计算：

阳离子表面活性剂的用量=有机负载量与阳离子交换容量的百分比×膨润土阳离子交换容量×膨润土质量×表面活性剂的摩尔质量。

木质纤维水解糖液的脱毒方法，具体为，将木质纤维素水解糖液与有机改性膨润土混合，有机改性膨润土的负载量为80%～140%CEC，在pH1～8、20～50℃条件下搅拌15～60min；再经固液分离，弃去沉淀。

脱毒后的木质纤维水解糖液补加酸或碱，调至适当pH值，补加相应营养盐，加入相应菌种发酵即可制备相应的化学品，如乙醇或有机酸等。所述的酸、碱，可以是硫酸，氢氧化钠、氢氧化钾等。

其中，所述的固液分离方法为离心或板框过滤。

其中，木质纤维水解糖液为木质纤维素原料经过预处理的预水解液、木质纤维原料的酸水解液或木质纤维原料的酶水解液；所述的木质纤维素原料经过预处理的预水解液为中性或酸性蒸汽爆破水洗液、稀酸预处理水洗液、稀酸磨浆预处理水洗液、或高温热水预处理水洗液。

本发明的有益效果：本发明采用有机改性膨润土吸附木质纤维水解糖液，由于去除了发酵抑制物，特别是大大降低了羟甲基糠醛及酚类抑制物的含量，减少了发酵抑制物对微生物生长发酵的协同抑制作用，从而提高了木质纤维素水解糖液的发酵性能。采用有机改性膨润土吸附处理的木质纤维水解糖液，与未经吸附处理的木质纤维水解糖液相比，微生物对木质纤维水解糖液的利用速率大幅度提高，在相同时间内，糖利用率提高了42.6%，乙醇产量提高了45.5%，发酵周期缩短，为木质纤维水解糖液脱毒提供了一个新途径。

附图说明

图1为有机改性剂负载量对有机膨润土吸附羟甲基糠醛及酚类化合物的影响曲线，其实验条件为：有机膨润土用量7%，温度30℃，pH5.0，吸附时间2h。

图2为pH值对有机膨润土吸附羟甲基糠醛及酚类化合物的影响曲线，其实验条件为：有机膨润土用量7%，温度30℃，有机改性剂负载量120%CEC(阳离子交换容量)，吸附时间2h。

图3为吸附时间对有机膨润土吸附羟甲基糠醛及酚类化合物的影响曲线，其实验条件为：有机膨润土用量7%，温度30℃，有机改性剂负载量120%CEC，pH5.0。

图4为经CTAB-膨润土吸附处理的玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液乙醇发酵情况。

图5为未经CTAB-膨润土吸附处理的玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液乙醇发酵情况。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：用阳离子表面活性剂对膨润土进行有机改性。

膨润土的有机改性：以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为改性剂，对钠基膨润土进行有机改性，制备有机膨润土——CTAB-膨润土，按如下步骤操作：

1.称取2～4g十六烷基三甲基溴化铵充分溶解于100ml蒸馏水中，配制成2%～4%的十六烷基三甲基溴化铵溶液。

2.将10g钠基膨润土加入上述十六烷基三甲基溴化铵溶液中，配制成10%的悬浊液，于70℃下将其水浴搅拌加热2h。钠基膨润土与有机改性剂的用量配比根据膨润土阳离子交换容量来确定。

3.加热完毕后，离心分离，弃去上清液。

4.将上述离心所得膨润土反复洗涤，再于80℃下烘干，105℃下活化1h，研磨过100目筛，得到CTAB-膨润土。

阳离子交换容量的测定：用50%乙醇溶液清洗膨润土中可溶盐类，再加入0.1mol/L氯化铵-50%无水乙醇提取液，使其充分进行交换反应；收集交换液，并加入35%的中性甲醛，使其与交换液中残余铵根离子发生缩合反应生成甲酸，然后立即用0.1mol/L氢氧化钠标液进行滴定，其交换液中所消耗的铵根离子量即为相应的交换性阳离子量。阳离子交换容量是指pH值为7的条件下所吸附的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等阳离子总量，简称为CEC。膨润土阳离子交换容量是判断膨润土质量的主要依据，CEC值愈大表示其带负电量愈大，其水化、膨胀和分散能力愈强；反之，其水化、膨胀和分散能力愈差。实施例2：用阳离子表面活性剂对膨润土进行有机改性。

膨润土的有机改性：以十六烷基三甲基氯化铵为改性剂，对钠基膨润土进行有机改性，按如下步骤操作：

1.称取2～4g十六烷基三甲基氯化铵充分溶解于100ml蒸馏水中，配制成2%～4%的十六烷基三甲基溴化铵溶液。

2.将10g钠基膨润土加入上述十六烷基三甲基氯化铵溶液中，配制成10%的悬浊液，于80℃下将其水浴搅拌加热1h。钠基膨润土与有机改性剂的用量配比根据膨润土阳离子交换容量来确定。

3.加热完毕后，离心分离，弃去上清液。

4.将上述离心所得膨润土反复洗涤，再于70℃下烘干，105℃下活化2h，研磨过100目筛，得到。

实施例3：用阳离子表面活性剂对膨润土进行有机改性。

膨润土的有机改性：以十二烷基三甲基溴化铵为改性剂，对钠基膨润土进行有机改性，按如下步骤操作：

1.称取2～4g十二烷基三甲基溴化铵充分溶解于100ml蒸馏水中，配制成2%～4%的十六烷基三甲基溴化铵溶液。

2.将10g钠基膨润土加入上述十二烷基三甲基溴化铵溶液中，配制成10%的悬浊液，于70℃下将其水浴搅拌加热3h。钠基膨润土与有机改性剂的用量配比根据膨润土阳离子交换容量来确定。

3.加热完毕后，离心分离，弃去上清液。

实施例4：

同实施例3的方法，所不同的是，以十四烷基三甲基氯化铵替代十二烷基三甲基溴化铵。

实施例5：

同实施例3的方法，所不同的是，以十八烷基三甲基氯化铵替代十二烷基三甲基溴化铵。

实施例6：

同实施例3的方法，所不同的是，以十四烷基三甲基溴化铵替代十二烷基三甲基溴化铵。

实施例7：木质纤维原料水解糖液的获取。

玉米秸秆经过酸性蒸汽爆破预处理，少部分纤维素降解为葡萄糖，而半纤维素大部分降解为单糖。另外，还有弱酸类、呋喃类及酚类化合物等抑制物的产生。玉米秸秆酸性蒸汽爆破后，所得的玉米秸秆酸性蒸汽爆破物料经过以下处理得到玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液：

1.称取200g绝干玉米秸秆酸性蒸汽爆破物料，并用氨水调节pH至5左右，按照固液比1:7.5（w/v）量取蒸馏水，分三次浸泡、搅拌10min，并用布袋挤干，小心收集水洗液和残渣，冷藏备用。

2.上述水洗液经过旋转蒸发（70℃，160mbar）浓缩，使其糖浓度为原来的两倍，用于后续的木质纤维素水解糖液的脱毒评价。

实施例8：木质纤维原料水解糖液的获取。

同实施例7的方法，所不同的是，以玉米秸秆稀酸预处理物料替代玉米秸秆酸性蒸汽爆破物料。

实施例9：木质纤维原料水解糖液的获取。

200g绝干玉米秸秆酸性蒸汽爆破物料，将pH调至4.8，添加适量的纤维素酶（按照物料中每克纤维素20FPIU纤维素酶来添加）及pH4.8的柠檬酸缓冲液，底物浓度10%（w/v），于50℃，150r/min条件下，酶解48h，离心去除酶解残渣即得到玉米秸秆酸性蒸汽爆破酶水解糖液。

实施例10：木质纤维原料水解糖液的获取。

200g绝干玉米秸秆，按照底物浓度10%（w/v）添加2000ml 1%稀硫酸，并置于160℃下，酸解60min，所得即为玉米秸秆稀酸水解糖液。

实施例11：树干毕赤酵母的增殖与发酵。

1.树干毕赤酵母（Pichia stipitis）（MCCC2E00502）活化或增殖培养基成分（g/L）：葡萄糖15.0；木糖30.0；蛋白胨5.0；酵母浸膏3.0。

2.树干毕赤酵母发酵培养基成分（g/L）：玉米秸秆酸性蒸汽爆破水洗浓缩液；磷酸二氢钾3.0；七水硫酸镁0.5；乙二胺四乙酸0.03；七水硫酸锌0.009；二水氯化锰0.002；六水氯化钴0.0006；五水硫酸铜0.0006；碘化钾0.0002；用氢氧化钠将培养基pH调至值6.0。

3.树干毕赤酵母的增殖培养：50ml活化培养基置于250ml三角瓶中，于121℃下灭菌15min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的树干毕赤酵母，摇瓶置于恒温摇床中于30±1℃、170转/分条件下培养36h后，菌体通过离心收集于3000转/分条件下离心10min，再将菌体沉淀接入增殖培养基，于恒温摇床中于30±1℃、170转/分条件下培养24h，重复上述操作，继续培养一轮后备用。

4.树干毕赤酵母的发酵培养：50ml玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液添加营养盐及微量元素后，置于250ml三角瓶中，直接接入上述培养的树干毕赤酵母，置于恒温摇床中于30±1℃、150转/分条件下培养。

5.发酵培养过程中，每6或12h取样，测定残糖、乙醇及酵母浓度。

发酵液中葡萄糖、木糖及乙醇浓度均采用高效液相色谱法（HPLC）测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1200高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸，流速：0.6ml/min；柱温：55℃；检测器：示差折光检测器；进样量：10μL。外标法测定。

实施例12：吸附条件对CTAB-膨润土吸附木质纤维水解糖液中酚类抑制物的影响。

1.称取实施例1的有机改性剂负载量为20%～140%的CTAB-膨润土4.0g于250ml三角瓶中，加入实施例2的玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液50ml，pH2～12，时间置于150转/分的摇床中于温度30℃条件下吸附10～120min。

2.吸附结束后，于10000转/分下离心10min，得到上清液，测定液相中甲酸、乙酸、乙酰丙酸、羟甲基糠醛及总酚含量，计算有机改性膨润土对水洗液中抑制物的吸附率。有机改性剂负载量、吸附pH值和吸附时间对吸附率的影响结果如附图1～3。

吸附处理液中甲酸、乙酸、乙酰丙酸、羟甲基糠醛的测定：采用高效液相色谱法（HPLC）测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1200高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-RadAminex HPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸，流速：0.6ml/min；柱温：55℃；检测器：示差折光检测器；进样量：10μL。外标法测定。

吸附处理液中总酚含量的测定：采用福林酚比色法测定。反应体系：在10ml刻度试管中先加入1ml适当稀释的溶液及1ml 0.6mol/L的福林酚试剂充分混合，再加入5ml蒸馏水，最后加入3ml6%Na₂CO₃溶液至终体积为10mL，最后置于30℃下反应2h后，于745nm下测定其吸光度。代入标准方程计算出其总酚含量。

CTAB-膨润土对玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液中发酵抑制物的吸附率计算方法为：

吸附率（%）=[（初始发酵抑制物含量－吸附体系液相中发酵抑制物含量）/初始总酚含量]×100

其中初始发酵抑制物含量、吸附体系液相中发酵抑制物含量以含有的质量体积浓度表示，单位g/l。

附图1～3表明，CTAB-膨润土对玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液中发酵抑制物的吸附作用受吸附条件（有机改性剂负载量、pH值、时间）影响很大。以对疏水性发酵抑制物（羟甲基糠醛及酚类化合物）吸附率最大为考察指标，最适宜的吸附条件为pH值＜10.0、吸附时间1h。在此条件下，CTAB-膨润土对发酵抑制物的吸附率为55.24%。吸附后固液分离，大量疏水性发酵抑制物可随吸附剂的分离而除去。

CTAB-膨润土对酸爆水洗液中酚类化合物的吸附情况（以有机膨润土对酚类化合物的吸附率表示）如表1。

表1CTAB-膨润土对玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液中各组分的吸附情况（单位：g/l）

组分含量	吸附前	吸附后
			葡萄糖含量	10.09	10.12
木糖含量	46.39	46.29
			甲酸含量	0.87	0.78
乙酸含量	3.79	3.60
			乙酰丙酸含量	0.37	0.21
羟甲基糠醛含量	0.42	0.20

总酚含量

3.77

1.63

当采用其它木质纤维素水解糖液，如稀酸（预）水解液、中性蒸汽爆破木质纤维素（预）水解液或经预处理后的木质纤维原料的酶解液，吸附效果基本相同。

实施例13：在相同吸附条件下，不同阳离子改性膨润土对不同木质纤维原料水解糖液中酚类抑制物的去除效果。

表2不同阳离子改性膨润土对不同木质纤维原料水解糖液中酚类抑制物的吸附（单位：g/l）

实施例14：CTAB-膨润土吸附处理玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液及其处理液的乙醇发酵。

1.有机膨润土吸附脱毒处理——称取CTAB-膨润土7.2g于250ml三角瓶中，加入实施例2的两倍浓缩的玉米秸秆酸爆水洗液60ml，置于30℃、150转/分的摇床中吸附1h。

2.固液分离——上述体系吸附完成后，于10000转/分下离心10min，得到上清液用于后续发酵。吸附后水洗液的各抑制物组分含量如表2。

3.树干毕赤酵母发酵——取上述离心分离后的上清液，加入酸、碱使反应体系pH值为6.0，接入实施例3中增殖的树干毕赤酵母。置于30℃、150转/分的摇床中发酵30h，发酵结束后发酵液于3000转/分条件下离心10min，得到的清液即为由木质纤维素水解液制得的乙醇溶液。实验结果如图4。

比较例：未经CTAB-膨润土吸附处理的玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液的乙醇发酵。

直接使用实施例7中玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液进行乙醇发酵。预水解液的各抑制物组分含量如表2。实验方法如下：

量取实施例2的玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液50ml于250ml三角瓶中，加入酸、碱使反应体系pH值为6.0。接入实施例3中增殖的树干毕赤酵母。置于30℃、150转/分的摇床中发酵30h，发酵结束后发酵液于3000转/分条件下离心10min，得到的清液即为由木质纤维素预水解液制得的乙醇溶液。实验结果如图5。

表3未处理及处理玉米秸秆酸性蒸汽爆破预水解液中各抑制物组分含量（单位：g/l）

结果表明：经有机改性膨润土吸附处理后，木质纤维素水洗液的发酵性能明显提高，发酵周期明显缩短。与未处理的木质纤维素水洗液相比，酵母糖利用率从之前的68.1%提高到97.1%，乙醇产量从之前的15.36g/l提高到22.35g/l，提高了45.51%。

Claims

1.一种木质纤维水解糖液的脱毒方法，其特征在于，以有机改性膨润土为吸附剂吸附去除木质纤维水解糖液中的疏水性发酵抑制物；其中，所述的有机改性膨润土是通过阳离子表面活性剂改性处理后具有疏水性的膨润土；

所述的阳离子表面活性剂为十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基氯化铵。

2.根据权利要求1所述的木质纤维水解糖液的脱毒方法，其特征在于，所述的阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。

3.根据权利要求1～2中任意一项所述的木质纤维水解糖液的脱毒方法，其特征在于，膨润土的改性处理方法为，将膨润土浸泡于阳离子表面活性剂的水溶液中，70～80℃搅拌反应1～3h，离心分离弃去上清，洗涤改性后的膨润土，70～80℃下烘干，105℃下活化1～2h，研磨过筛即得。

4.根据权利要求1所述的木质纤维水解糖液的脱毒方法，其特征在于，将木质纤维素水解糖液与有机改性膨润土混合，有机改性膨润土的负载量为80%～140%，在pH1～8、20～50℃条件下搅拌15～60min；再经固液分离，弃去沉淀。

5.根据权利要求4所述的木质纤维水解糖液的脱毒方法，其特征在于，所述的固液分离方法为离心或板框过滤。

6.根据权利要求1所述的木质纤维水解糖液的脱毒方法，其特征在于，木质纤维水解糖液为木质纤维素原料经过预处理的预水解液、木质纤维原料的酸水解液或木质纤维原料的酶水解液；所述的木质纤维素原料经过预处理的预水解液为中性或酸性蒸汽爆破水洗液、稀酸预处理水洗液、稀酸磨浆预处理水洗液、或高温热水预处理水洗液。