CN102712952A - 用于乳状液破碎和回收生物学成分的系统和方法 - Google Patents

Abstract

描述了用于从乳状液中提取生物物质的方法的实施方案，其包括下述步骤：a）使用溶剂破碎乳状液，所述乳状液包含多个在油连续相中的水性微滴，以生产混合的水-油混合物，其中所述溶剂破裂水性微滴，所述水性微滴释放出许多生物学成分到混合的水-油混合物中，所述生物学成分各自固定化在基质上；b）将无机盐导入混合的水-油混合物中，造成所述混合物相分离成包含水性溶液和生物学成分的第一相与包含溶剂和油的第二相；c）从所述第二相萃取所述第一相；和d）从所述第一相收集基质固定化的生物学成分。

Description

用于乳状液破碎和回收生物学成分的系统和方法

发明领域

本发明提供了用于破碎分散在油相中的水性乳状液微滴和分离其中含有的核酸产物的系统、方法、试剂和试剂盒。更具体地，本发明涉及从热稳定的乳状液分离扩增的核酸产物。

发明背景

用于在“油包水”乳状液的微滴内执行生物学过程的方法和试剂盒的开发，已经为高处理量分析技术（特别是采用在乳状液微滴内扩增的核酸物质的高处理量核酸测序技术）的开发做出了巨大贡献。应当理解，这样的乳状液已经成功地用于许多用途，包括体外转录/翻译，这被称作定向进化和扩增过程。例如，乳状液的每个水性微滴是可以在其中单独进行目标过程的微隔室或微反应器，其中数千个微滴以整体平行的方式执行该过程。在核酸扩增的一个更具体的实例中，所述过程可以以非常高的效率进行，且没有邻近微滴的污染。在大多数应用中，在水性乳状液微滴中执行的扩增过程的类型是众所周知的聚合酶链式反应（PCR）方法，所述方法受益于乳状液的高效热传递特征以及典型的油包水乳状液的生物相容性。另外，许多用于产生可测序物质（sequencable material）的乳状液实施方案适合包含固相基质诸如微球（即珠型基质），在其上面可以固定化扩增产物。这会有效地隔离扩增产物，所以当破碎乳状液微滴来回收产物时，每种产物可以保持与其它产物分离，并随后用作克隆群体。

一般而言，破裂或“破碎”用于生物学背景中的油包水乳状液，然后纯化从微滴释放出的生物物质用于以后的应用，优选地不破坏或修改生物学完整性或组成。传统上，已经使用诸如异丙醇等溶剂来破碎油包水乳状液，并通过离心方法来分离组分。在采用离心方法且扩增的核酸群体与珠子隔离的实施方案中，优选地重复离心过程数次，以去除油和表面活性剂，随后用缓冲溶液冲洗，并进一步离心以去除异丙醇。传统的基于离心的方法是耗时的，且不适合转换至可商业得到的实验室自动化平台。

因此，本发明的目的是，提供一种更有效的且可自动化的方法，所述方法用于从乳状液中提取生物学成分（biological elements），且不造成那些成分的破坏或特征改变。

发明内容

本发明的实施方案涉及核酸序列的测定。更具体地，本发明的实施方案涉及用于校正在通过SBS测序核酸的过程中获得的数据中的误差的方法和系统。

描述了从乳状液提取生物物质的方法的一个实施方案，其包括下述步骤：a）使用溶剂破碎乳状液，所述乳状液包含多个在油连续相中的水性微滴，以生产混合的水-油混合物，其中所述溶剂会破裂水性微滴，所述水性微滴释放出多个生物学成分到混合的水-油混合物中，所述生物学成分各自固定化在基质上；b）将无机盐导入混合的水-油混合物中，造成所述混合物相分离成第一相（其包含水性溶液和生物学成分）和第二相（其包含溶剂和油）；c）从第二相萃取第一相；和d）从第一相收集基质固定化的生物学成分。

上述实施方案和实现不一定彼此包括或排斥，可以以任意不冲突的和其它可行的方式相组合，无论它们是否与相同的或不同的实施方案或实现相结合地呈现。一个实施方案或实现的描述无意对其它实施方案和/或实现进行限制。而且，在本说明书别处所述的任意一个或多个功能、步骤、操作或技术可以在替代实现中与在简述中描述的任意一个或多个功能、步骤、操作或技术相组合。因而，上述的实施方案和实现是例证性的，而不是限制性的。

附图说明

结合附图，从下述的详细描述会更清楚地理解以上和其它特征。在附图中，相同的参考数字代表相同的结构、元件或方法步骤，并且参考数字的最左边数字表示参考元件最早出现的附图的编号（例如，元件160最早出现在图1中）。然而，所有这些约定意图是典型的或例证性的，而不是限制性的。

图1是在计算机控制和反应基质下的测序仪器的一个实施方案的原理框图；且

图2是使用盐析方法从乳状液中提取生物学成分的方法的一个实施方案的原理框图。

具体实施方式

如下面将更详细地描述的，本文所述的发明的实施方案包括用于破碎乳状液和回收其中含有的生物学成分的系统、方法和试剂盒。具体地，本发明的实施方案涉及用于扩增核酸模板分子的油包水乳状液和用于高处理量技术（诸如核酸测序）中的扩增群体的回收。

a. 一般解释

术语“流程图”通常表示，通过SBS方法、特别是基于焦磷酸盐的测序方法（也称作“焦磷酸测序”）产生的序列数据的图示，且可以更具体地称作“焦磷酸测序谱图”。

本文使用的术语“读出”或“序列读出”通常表示，从单个核酸模板分子或多个基本上相同的模板核酸分子拷贝群体得到的整个序列数据。

本文使用的术语“运行”或“测序运行”通常表示，在一个或多个模板核酸分子的测序操作中进行的一系列测序反应。

本文使用的术语“流”通常表示，向包含模板核酸分子的环境中加入溶液的系列循环或迭代循环，其中所述溶液可以包括用于添加到新生分子上的核苷酸物质或其它试剂（诸如缓冲剂或酶），所述试剂可以用于测序反应中，或减少来自以前的核苷酸物质流循环的遗留或噪声效应。

本文使用的术语“流循环”通常表示，连续的系列流，其中核苷酸物质在该循环中流过一次（即流循环可以包括以T、A、C、G核苷酸物质的次序连续加入，尽管其它序列组合也被视作该定义的一部分）。通常，流循环是重复的循环，其具有在循环之间相同的流次序。

本文使用的术语“读出长度”通常表示，可以可靠地测序的模板分子的长度的上限。许多因素促成系统和/或方法的读出长度，包括，但不限于模板核酸分子中的GC含量的程度。

本文使用的术语“实验片段”或“TF”通常表示，可以用于质量控制、校正或其它相关用途的已知序列组成的核酸成分。

本文使用的术语“引物”通常表示这样的寡核苷酸：其在一定条件下充当DNA合成的起点，在所述条件下，在合适的温度，在适当的缓冲液中，诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成。引物优选地是单链寡脱氧核糖核苷酸。

“新生分子”通常表示这样的DNA链：其通过掺入与模板分子中的对应核苷酸物质互补的核苷酸物质而被模板-依赖性的DNA聚合酶延伸。

术语“模板核酸”、“模板分子”、“靶核酸”或“靶分子”通常表示，作为测序反应的主题的核酸分子，从所述测序反应产生序列数据或信息。

本文使用的术语“核苷酸物质”通常表示，通常掺入新生核酸分子中的核酸单体的身份，包括嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）和嘧啶（胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶）。

本文使用的术语“单体重复”或“同聚物”通常表示，包含相同核苷酸物质（即重复的核苷酸物质）的2个或更多个序列位置。

本文使用的术语“均匀延伸”通常表示延伸反应的关系或阶段，其中基本上相同的模板分子群体中的每个成员均匀地执行反应中的相同延伸步骤。

本文使用的术语“完成效率”通常表示，在给定的流期间适当延伸的新生分子的百分比。

本文使用的术语“不完全延伸率”通常表示，没有适当延伸的新生分子的数目与所有新生分子的数目之比。

本文使用的术语“基因组文库”或“鸟枪法文库”通常表示这样的分子集合：其源自和/或代表生物体或个体的整个基因组（即基因组的所有区域）。

本文使用的术语“扩增子”通常表示选择的扩增产物，诸如从聚合酶链式反应或连接酶链式反应技术生产的那些。

本文使用的术语“变体”或“等位基因”通常表示许多物质中的一种，所述物质各自编码类似的序列组成，但是彼此具有一定程度的区别。所述区别可以包括相关领域的普通技术人员已知的任意类型的遗传变异，包括、但不限于：多态性诸如单核苷酸多态性(SNP)、插入或缺失（插入/缺失事件的组合也称作“indels”）、重复序列（也称作串联重复）的数目的差异和结果变异。

本文使用的术语“等位基因频率”或“等位基因的频率”通常表示，所有变体在由特定变体组成的群体中的比例。

本文使用的术语“关键序列(key sequence)”或“关键元件(key element)”通常表示，与在已知位置（即，通常包括在连接的衔接元件中）中的具有已知序列组成的模板核酸分子有关的核酸序列元件（通常在约4个序列位置，即，TGAC或核苷酸物质的其它组合），其被用作从模板分子产生的序列数据的质量控制参照。如果序列数据包括与在正确位置的关键元件有关的已知序列组成，则它通过质量控制。

本文使用的术语“关键穿过（keypass）”或“关键穿过孔（keypass well）”通常表示，具有已知序列组成的全长核酸实验序列（即，“实验片段”或上面提及的“TF”）在反应孔中的测序，其中将源自TF序列的序列和/或与TF有关或在与靶核酸结合的接头中的关键序列的准确度与TF和/或关键（Key）的已知序列组成相对比，并用于测量测序准确度和用于质量控制。在典型的实施方案中，在测序运行中的孔的总数的比例是关键穿过孔，在有些实施方案中，它们可以分布在局部。

本文使用的术语“平端”与相关领域的普通技术人员的理解一致地进行解释，通常表示具有用一对互补核苷酸碱基物质结尾的末端的直链双链核酸分子，其中一对平端通常适合与彼此的连接。

本文使用的术语“粘性末端”或“突出端”与相关领域的普通技术人员的理解一致地进行解释，通常表示在分子的一条链的末端处具有一个或多个未配对的核苷酸物质的直链双链核酸分子，其中所述未配对的核苷酸物质可以存在于任一条链上，且包括单个碱基位置或多个碱基位置(有时也称作“粘端”)。

本文使用的术语“珠子”或“珠基质”通常表示，从任意数目的已知物质制成的任意方便大小的任意类型的珠子，所述物质例如：纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙烯(描述在，例如，Merrifield、Biochemistry 3 (1964) 1385-1390)、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、聚苯乙烯、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、天然海绵、硅胶、控制孔玻璃、金属、交联的葡聚糖(例如，Sephadex?)、琼脂糖凝胶(琼脂糖?)和本领域技术人员已知的其它固相珠子支持物。

在下面一般地描述了与样品制备和加工、序列数据的产生和序列数据的分析有关的系统和方法的一些示例性的实施方案，其中的一些或全部适合与本文所述的发明的实施方案一起使用。具体地，描述了用于制备模板核酸分子、扩增模板分子、产生靶物特异性的扩增子和/或基因组文库的系统和方法、测序方法和仪器以及计算机系统的示例性的实施方案。

在典型的实施方案中，源自实验样品或诊断样品的核酸分子必须从它的粗形式制备和加工成适合高处理量测序的模板分子。所述加工方法可以随用途不同而异，产生包含不同特征的模板分子。例如，在高处理量测序的一些实施方案中，优选地制备这样的模板分子：其序列或读出长度至少是特定测序方法可以准确地产生它的序列数据的长度。在本实施例中，所述长度可以包括约25-30碱基对、约50-100碱基对、约200-300碱基对、约350-500碱基对、大于500碱基对的范围，或适合特定测序用途的其它长度。在有些实施方案中，使用许多本领域普通技术人员已知的方法，将来自样品（诸如基因组样品）的核酸片段化。在优选的实施方案中，所述方法随机地片段化（即不对特定序列或区域进行选择）核酸，且可以包括所谓的雾化或声处理方法。但是，应当理解，其它片段化方法，诸如使用限制性内切核酸酶消化，可以用于片段化目的。也在本实施例中，一些加工方法可以采用本领域已知的大小选择方法，以选择性地分离具有希望的长度的核酸片段。

另外，在一些实施方案中，优选地使额外的功能元件结合每种模板核酸分子。所述元件可以用于多种功能，包括，但不限于，用于扩增和/或测序方法的引物序列、质量控制元件（即诸如关键元件或其它类型的质量控制元件）、编码不同结合（诸如与来源或患者的样品）的独特标识符（也称作多路标识符或“MID”）或其它功能元件。

例如，所述发明的一些实施方案包括：使具有已知的且可鉴别的序列组成的MID元件的一个或多个实施方案与样品结合，并使MID元件的实施方案与来自结合样品的模板核酸分子相偶联。将MID偶联的、来自许多不同样品的模板核酸分子合并成单个“多路化的”样品或组合物，其然后可以有效地加工，以生成每个MID偶联的模板核酸分子的序列数据。解卷积（de-convolute）每个模板核酸的序列数据，以鉴别偶联的MID元件的序列组成和与鉴别的起源的样品的结合。在本实施例中，多路化的组合物可以包括来自约384个样品、约96个样品、约50个样品、约20个样品、约16个样品、约10个样品或其它数目的样品的代表。在研究背景下，每个样品可以与不同的实验条件、处理、物质或个体相结合。类似地，在诊断背景下，每个样品可以与不同的组织、细胞、个体、条件、药物或其它处理相结合。相关领域的普通技术人员会明白，上面列出的样品的数目是用于实例目的，因而不应视作限制性的。

在优选的实施方案中，每个MID元件的序列组成是可容易地鉴别的，且不会导入来自测序过程的误差。MID元件的一些实施方案包括核酸物质的独特序列组成，所述核酸物质具有与天然存在的序列最小的序列相似性。或者，MID元件的实施方案可以包括与天然存在的序列的一定程度的序列相似性。

另外，在优选的实施方案中，已知每个MID元件的位置与模板核酸分子和/或偶联到模板分子上的衔接元件的某些特征有关。已知每个MID的位置，可用于发现序列数据中的MID元件和解释可能出错的MID序列组成，并随后与来源样品相关联。

例如，可用作与MID元件的位置关系的锚的某些特征可以包括、但不限于：模板分子的长度(即已知MID元件具有的从5’或3’端的许多序列位置)、可识别的序列标志物诸如位于MID元件附近的关键元件和/或一种或多种引物元件。在本实施例中，所述关键元件和引物元件通常包括已知序列组成，所述序列组成通常不会随多路组合物中的样品不同而异，且可以用作检索MID元件的位置参照。可以在计算机130上执行由应用程序135实现的分析算法，以分析产生的序列数据的每个MID偶联的模板，从而鉴别更容易识别的关键元件和/或引物元件，并从那些位置推延，以鉴别据推测包括MID元件序列的序列区域。应用程序135然后可以处理推测区域和在侧接区中可能离开一定距离的序列组成，以确定地鉴别出MID元件和它的序列组成。

一些或所有所述的功能元件可以组合成衔接元件，所述衔接元件在某些加工步骤中偶联至核苷酸序列上。例如，一些实施方案可以将包含互补序列组成的引发序列元件或区域结合到用于扩增和/或测序的引物序列上。此外，相同的元件可以用于所谓的核酸分子的“链选择”和核酸分子向固相基质的固定化。在有些实施方案中，2组引发序列区域（此后称作引发序列A和引发序列B）可以用于链选择，其中仅具有引发序列A的一个拷贝和引发序列B的一个拷贝的单链被选择，且被包括为制备的样品。在替代实施方案中，衔接元件的设计特征消除了对链选择的需求。相同的引发序列区域可以用于扩增和固定化方法中，其中，例如，可以将引发序列B固定化在固体基质上，并从其延伸扩增的产物。

为片段化、链选择以及功能元件和接头的添加而加工样品的额外实例描述在：公开为US-2004-0185484-A1的美国专利申请，标题为“Method for preparing single-stranded DNA libraries”，提交日为2004年1月28日；公开为US2009-0105959-A1的美国专利申请，标题为“System and Method for Identification of Individual Samples from a Multiplex Mixture”，提交日为2008年5月29日；和美国专利申请系列号12/380,139，标题为“System and Method for Improved Processing of Nucleic Acids for Production of Sequencable Libraries”，提交日为2009年2月23日，它们各自为了所有目的特此通过引用整体并入本文。

描述了用于执行模板核酸分子的扩增以产生基本上相同的拷贝群体的系统和方法的不同实施例。普通技术人员显而易见，在SBS的一些实施方案中，希望产生每个核酸成分的多个拷贝，以在一种或多种核苷酸物质掺入与模板分子的拷贝结合的每个新生分子中时产生更强的信号。本领域已知许多用于产生核酸分子拷贝的技术，例如，使用所谓的细菌载体的扩增、“滚环”扩增（描述在美国专利号6,274,320和7,211,390中，通过上述引用并入）和聚合酶链式反应（PCR）方法，每种技术适合与本文所述的发明一起使用。特别适合高处理量用途的一种PCR技术包括所谓的乳状液PCR方法（也称作emPCR^TM方法）。

乳状液PCR方法的典型实施方案包括：建立2种不混溶物质的稳定乳状液，从而建立可以在其中发生反应的水性微滴。具体地，适合用于PCR方法中的乳状液的水性微滴可以包括：第一流体诸如基于水的流体，其作为微滴（也称作不连续相）悬浮或分散在另一种流体诸如疏水流体（也称作连续相）内，所述疏水流体通常包括某些类型的油。可以采用的油的实例包括、但不限于：矿物油、基于有机硅的油或氟化的油。

此外，有些乳状液实施方案可以采用表面活性剂，所述表面活性剂起稳定乳状液的作用，它们可能特别有助于特定加工方法诸如PCR。表面活性剂的一些实施方案可以包括：有机硅或氟化的表面活性剂中的一种或多种。例如，可以采用一种或多种非离子型表面活性剂，包括、但不限于：脱水山梨糖醇单油酸酯（也称作Span^TM 80）, 聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（也称作吐温^TM 80），或在有些优选的实施方案中，采用聚二甲基硅氧烷共聚醇（也称作Abil? EM90）、聚硅氧烷、聚烷基聚醚共聚物、聚甘油酯、泊洛沙姆和PVP/十六烷共聚物（也称作Unimer U-151），或在更优选的实施方案中，采用在环戊硅氧烷中的高分子量有机硅聚醚（也称作DC 5225C，可从Dow Corning得到）。

乳状液的微滴也可以称作隔室、微胶囊、微反应器、微环境或相关领域常用的其它名称。水性微滴的大小可以随乳状液组分或组合物的组成、其中含有的内容物和采用的形成技术而变化。所述的乳状液会建立微环境，在所述微环境中可以进行化学反应，诸如PCR。例如，进行希望的PCR反应所需的模板核酸和所有试剂可以包囊在乳状液的微滴中，并化学地分离。在一些实施方案中可以采用额外的表面活性剂或其它稳定剂，以促进如上所述的微滴的额外稳定性。使用微滴可以执行PCR方法的典型热循环操作，以扩增包囊的核酸模板，导致包含模板核酸的许多基本上相同的拷贝的群体的产生。在有些实施方案中，在微滴内的群体可以称作“克隆地分离的”、“隔室化的”、“隔离的”、“包囊的”或“局部化的”群体。也在本实施例中，一些或所有所述的微滴可以另外包囊固体基质诸如珠子，所述珠子用于连接模板和扩增的模板拷贝、扩增的与模板互补的拷贝或它们的组合。此外，所述固体基质可以能够用于连接其它类型的核酸、试剂、标记或其它目标分子。

可以与本文所述的发明一起使用的乳状液的实施方案可以包括：非常高密度的微滴或微胶囊，它们使所述的化学反应能够以整体平行的方式来实现。用于扩增的乳状液的额外实施例和它们用于测序用途的应用，描述在美国专利号7,638,276、7,622,280和公开为US-2005-0079510-A1的美国专利申请和公开为US-2005-0227264-A1的美国专利申请中，它们各自为了所有目的特此通过引用整体并入本文。

有时称作超深测序（Ultra-Deep Sequencing）的实施方案也会产生可以与本文所述的发明一起使用的用于测序的靶物特异性的扩增子，其包括使用特异性的核酸引物集合来从包含靶核酸的样品扩增选择的一个或多个靶区域。此外，所述样品可以包括核酸分子群体，所述群体已知或疑似含有这样的序列变体：所述序列变体包含与研究或诊断用途有关的序列组成，其中可以采用引物来扩增样品中的序列变体并提供关于所述序列变体的分布的洞察。例如，可以执行这样的方法，所述方法通过核酸样品中的多个等位基因的特异性扩增和测序来鉴别序列变体。首先用一对PCR引物扩增核酸，所述引物设计成扩增在目标区域周围的区域或核酸群体共有的区段。随后在单独的反应器（诸如上述的基于乳状液的容器）中单个地进一步扩增PCR反应的每种产物（第一扩增子）。对得到的扩增子（在本文中称作第二扩增子，各自源自第一扩增子群体的一个成员）测序，并使用序列集合来测定存在的一个或多个变体的等位基因频率。重要的是，所述方法不需要事先知道存在的变体，且通常可以鉴别出以<1%频率存在于核酸分子群体中的变体。

所述的靶物特异性的扩增和测序方法的一些优点包括：比以前实现的更高水平的灵敏度。此外，采用高处理量测序工具的实施方案，诸如采用由454 Life Sciences Corporation提供的孔的所谓的PicoTiterPlate^?阵列（有时也称作PTP^TM平板或阵列）的实施方案，所述方法可以用于产生每次运行或实验超过100,000、超过300,000、超过500,000或超过1,000,000个核酸区域的序列组成，且可能至少部分地取决于用户选择，诸如通过使用衬垫实现的泳道构型等。另外，所述方法会提供低丰度等位基因（其可能占等位基因变体的1%或更少）的检测灵敏度。所述方法的另一个优点包括：产生包括分析的区域的序列的数据。重要的是，不需要具有待分析的基因座的序列的现有知识。

用于测序的靶物特异性的扩增子的额外实例描述在：美国专利申请系列号11/104,781，标题为“Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing”，提交日为2005年4月12日；WO 2008/115427，标题为“System and Method for Detection of HIV Drug Resistant Variants”，提交日为2008年3月14日；和公开为US- 2010-0003687的美国专利申请系列号，标题为“System and Method for Detection of HIV Tropism Variants”，提交日为2009年6月17日，它们各自为了所有目的特此通过引用整体并入本文。

此外，测序的实施方案可以包括Sanger型技术、通常称作杂交测序（SBH）、连接测序（SBL）或掺入测序（SBI）技术的技术。此外，所述测序技术可以包括所谓的polony测序技术；纳米孔、波导和其它单分子检测技术；或可逆的终止子技术。如上所述，一种优选的技术可以包括合成测序方法。例如，有些SBS实施方案测序基本上相同的核酸模板拷贝的群体，且通常采用一种或多种寡核苷酸引物，所述引物被设计成与样品模板分子的预定互补位置或与模板分子相连的一个或多个接头对合。在有核酸聚合酶存在下，给引物/模板复合物提供核苷酸物质。如果核苷酸物质与核酸物质（其与样品模板分子上的直接邻近寡核苷酸引物的3’末端的序列位置相对应）互补，则所述聚合酶会用核苷酸物质延伸引物。或者，在一些实施方案中，给引物/模板复合物一次性提供许多目标核苷酸物质（通常A、G、C和T），与在样品模板分子上的直接邻近寡核苷酸引物的3’末端的对应序列位置处互补的核苷酸物质被掺入。在所述实施方案中的任一个中，可以化学地阻断核苷酸物质（诸如在3’-O位置），以防止进一步延伸，并需要在下一轮合成之前去阻断。还应当理解，向新生分子的末端添加核苷酸物质的过程，与上面关于向引物末端添加所述的过程基本上相同。

如上所述，通过本领域已知的多种方法，可以检测核苷酸物质的掺入，所述方法例如：通过检测焦磷酸盐（PPi）的释放，其中使用酶反应方法来生成光，或通过检测PH变化（在美国专利号6,210,891、6,258,568和6,828,100中所述的实施例，它们各自为了所有目的特此通过引用整体并入本文），或通过结合到核苷酸上的可检测标记。可检测标记的一些实例包括、但不限于：质量标签和荧光的或化学发光的标记。在典型的实施方案中，通过例如洗涤，去除未掺入的核苷酸。此外，在一些实施方案中，可以对未掺入的核苷酸进行酶降解，例如，使用腺苷三磷酸双磷酸酶或焦磷酸酶的降解，这描述在：公开为US 2009/0053724的美国专利申请，标题为“System and Method for Adaptive Reagent Control in Nucleic Acid Sequencing”，提交日为2008年6月27日；和公开为US-2009-0203086-A1的美国专利申请，标题为“System and Method for Improved Signal Detection in Nucleic Acid Sequencing”，提交日为2009年1月29日，它们各自为了所有目的特此通过引用整体并入本文。

在使用可检测标记的实施方案中，它们通常必须在下一个合成循环之前灭活（例如通过化学裂解或光漂白）。然后可以如上所述，用另一个核苷酸物质或多个目标核苷酸物质查询模板/聚合酶复合物中的下一个序列位置。核苷酸添加、延伸、信号获取和洗涤的重复循环会导致模板链的核苷酸序列的测定。续接本实施例，通常可以在任一个测序反应中同时地分析大数目或大群体的基本上相同的模板分子（例如10³、10⁴、10⁵、10⁶或10⁷分子），从而实现对于可靠检测而言足够强的信号。

另外，在一些实施方案中，可能有利的是，通过采用所谓的“配对末端”测序策略，提高测序过程的读出长度能力和性质。例如，测序方法的一些实施方案对可以产生高质量和可靠读出的分子的总长度具有限制。换而言之，可靠读出长度的序列位置的总数可以不超过25、50、100或500个碱基，这取决于采用的测序实施方案。配对末端测序策略如下延长可靠读出长度：通过单独地测序分子的每个末端（有时称作“标签”末端），所述分子包括在每个末端处的原始模板核酸分子的片段，所述片段通过接头序列连接至中心。模板片段的原始位置关系是已知的，因而来自序列读出的数据可以重组成具有更长的高质量读出长度的单个读出。配对末端测序实施方案的其它实例描述在：美国专利号7,601,499，标题为“Paired end sequencing”；和公开为US-2009-0233291-A1的美国专利申请，标题为“Paired end sequencing”，提交日为2009年1月28日，它们各自为了所有目的特此通过引用整体并入本文。

SBS装置的一些实例可以实现上述的一些或所有方法，且可以包括一种或多种检测装置，例如电荷耦合装置（即，CCD照相机）或同焦型结构、微流体室或流动池、反应基质和/或泵和流量阀。作为基于焦磷酸盐的测序的实例，装置的实施方案可以采用化学发光的检测策略，该策略产生固有地低水平的背景噪音。

在有些实施方案中，用于测序的反应基质可以包括平面基质诸如载玻片型基质、离子敏感场效应晶体管（也称作“ISFET”）或波导型反应基质，在一些实施方案中，其可以包含孔型结构。此外，反应基质可以包括所谓的PTP^TM阵列，该阵列可从454 Life Sciences Corporation得到，如上所述，其由纤维光学面板形成，所述面板被酸蚀刻，以产生数十万个或更多个非常小的孔，每个孔能够容纳基本上相同的模板分子群体（即，有些优选的实施方案包含在70 x 75mm PTP^TM阵列上的约330万个孔，孔之间的间距为35 μm )。

在有些实施方案中，每个基本上相同的模板分子群体可以安置在固体基质（诸如珠子）上，每个固体基质可以安置在所述孔之一中。例如，装置可以包括：试剂递送元件（用于为PTP平板底座提供流体试剂），以及CCD型检测装置（其能够收集从PTP平板上的每个孔发生出的光的光子）。包含用于提高信号识别的特征的反应基质的实例描述在：美国专利号7,682,816，标题为“THIN-FILM COATED MICROWELL ARRAYS AND METHODS OF MAKING SAME”，提交日为2005年8月30日，其为了所有目的特此通过引用整体并入本文。用于执行SBS型测序和焦磷酸盐测序的装置和方法的其它实例描述在：美国专利号7,323,305和美国专利号7,575,865，它们二者通过上述引用并入。

另外，可以采用使一个或多个样品制备过程（诸如上述的emPCR^TM过程）自动化的系统和方法。例如，自动化的系统可以用于提供有效的溶液，所述溶液用于产生乳状液，所述乳状液用于emPCR加工、执行PCR热循环操作和富集成功地制备的核酸分子群体进行测序。自动化的样品制备系统的实例描述在：公开为US-2005-0227264-A1的美国专利申请，标题为“Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion”，提交日为2005年1月28日，其为了所有目的特此通过引用整体并入本文。

另外，本文所述的本发明实施方案的系统和方法可以包括：实现某些设计、分析或其它操作，所述操作使用为了执行计算机系统而储存的计算机可读介质。例如，下面详细描述了几个实施方案，它们用于加工检测到的信号和/或分析使用SBS系统和方法产生的数据，其中所述加工和分析实施方案可在计算机系统上实现。

用于与本文所述的发明一起使用的计算机系统的一个示例性实施方案可以包括任意类型的计算机平台，诸如工作站、个人计算机、服务器或任意其它现有的或将来的计算机。但是，本领域普通技术人员会理解，如本文所述的前述计算机平台特别地构造成执行所述发明的专门化操作，且不视作一般目的计算机。

计算机通常包括已知的部件如处理器、操作系统、系统内存、存储器存储装置、输入输出控制器、输入输出装置、和显示装置。相关领域中的普通技术人员还应当理解，计算机可能会有很多可能的配置和部件，并也可能包括高速缓冲存储器、数据备份单元、和很多其它装置。

显示装置可以包括提供可视信息的显示装置，此信息通常可以被逻辑地和/或物理性地组织为像素阵列。也可以包括界面控制器，界面控制器可以包括任何类型的用于提供输入输出界面的已知或未来的软件程序。例如，界面可以包括通常被定义为“图形用户界面”（通常称作GUI）的界面，图形用户界面提供给用户一个或多个图形表示。界面通常能够接受用户使用本领域中普通技术人员已知的选择或输入装置进行的输入。

在相同或可替换的实施方案中，计算机上的应用程序可以采用包括被称为“命令行界面”（经常称为CLI）的界面。在应用程序和用户之间，CLI通常提供基于文本的交互。通常，命令行界面通过显示装置显示输出和接收输入作为文本行。例如，一些实现方法可以包括所谓的“壳(shell)”，如相关领域的普通技术人员已知的Unix Shells，或Microsoft Windows Powershell，其采用面向对象类型的编程体系结构例如Microsoft .NET framework。

相关领域的普通技术人员会明白，界面可以包括一个或多个GUI、CLI或它们的组合。

处理器可以包括可商业得到的处理器，如Intel Corporation生产的Celeron?、Core^TM或Pentium?处理器，Sun Microsystems公司生产的SPARC?处理器，AMD公司生产的Athlon^TM、Sempron^TM、Phenom^TM或Opteron^TM处理器，或它可以是正在或将要变成可以使用的其它处理器之一。处理器的一些实施方案可以包括所谓的多核处理器，和/或能够在单核或多核配置中采用并行处理技术。例如，多核结构通常包括两个或更多个处理器“执行核”。在本实施例中，每个执行核可以以作为能够并行执行多个线程的独立处理器执行。另外，相关领域中的普通技术人员会理解，处理器可以被设置成通常所谓的32位或64位结构，或现在已知或将来可能开发出的其它体系结构。

处理器通常运行操作系统，所述操作系统可以是例如微软公司的WINDOWS?型操作系统（诸如Windows?XP、Windows Vista?或Windows?_7）；苹果电脑公司的Mac OS X操作系统（诸如Mac OS X v10.6“Snow Leopard”操作系统）；可以从很多卖主或所谓的公开渠道得到的Unix?或Linux-型操作系统；其它或未来的操作系统；或它们的一些组合。操作系统通过公知方式与固件和硬件接口，并且帮助处理器调整和执行各种可以用多种编程语言书写的计算机程序的功能。操作系统通常与处理器协作地协调和执行计算机的其它部件的功能。操作系统也会提供进度表、输入-输出控制、文件和数据管理、存储管理、以及通信控制及相关服务，所有的都依照已知的技术。

系统存储器可以包括任何类型的已知或未来的存储器存储设备。例子包括任何通常可以获得的随机存取存储器（RAM），磁介质例如驻存硬盘或磁带，光学介质例如读和写光盘，或其它存储器存储设备。存储器存储设备可以包括任何类型已知的或未来的设备，包括光盘驱动、磁带驱动、可移动硬盘驱动、USB或闪存、或磁盘设备。这种类型的存储器存储设备通常读自和/或写入到程序存储介质中（未示出）例如，分别为光盘、磁带、可移动硬盘、USB或闪存或软盘。这些程序存储介质中的任何一个或其它现在使用的或也许以后会开发的可以视为计算机程序产品。如所希望的，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，同样称为计算机控制逻辑，通常被存储在系统存储器中和/或用于连接存储器存储设备的程序存储设备中。

在有些实施方案中，计算机程序产品被描述为包括计算机可用介质，该计算机可用介质具有存储在其中的控制逻辑（计算机软件程序，包括程序代码）。当由处理器执行时，该控制逻辑使得处理器执行这里所述的功能。在其它实施方案中，一些功能主要由使用例如硬件状态机的硬件实行。执行硬件状态机以便执行这里所述的功能对于本领域相关技术人员来说将是显而易见的。

输入-输出控制器可以包括任何类型的已知的用于接收和处理来自用户信息的设备，该用户无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的。这样的设备包括，例如调制解调器卡、无线卡、网络接口卡、声卡、或用于任何类型已知输入设备的其它类型的控制器。输出控制器可以包括用于向用户显示信息的任何类型的已知显示设备的控制器，该用户无论是人还是机器，无论是本地还是远程。在当前描述的实施方案中，计算机的功能元件通过系统总线彼此相互通信。计算机的一些实施方案可以利用网络或其它类型的远程通信与一些功能性的元件互相通信。

正如相关领域的技术人员显然得知的，工具控制和/或数据处理应用，如果用软件执行，则可以被载入并从系统内存和/或存储器存储设备中执行。所有或部分工具控制和/或数据处理应用同样可以驻留在只读存储器中或类似于存储器存储设备的设备中，这样的设备不要求工具控制和/或数据处理应用通过输入-输出控制器被首先加载。相关领域技术人员会理解，工具控制和/或数据处理应用或它们的一部分可以由处理器以公知的方式被载入到系统内存中，或高速缓冲存储器中，或二者中，作为执行的优势。

另外，计算机可以包括存储在系统内存中的一个或多个库文件、试验数据文件、以及因特网客户。例如，试验数据可以包括与一个或多个试验或分析相关的数据比如检测信号值，或其它与一个或多个SBS试验或处理相关联的值。此外，因特网客户可以包括能利用网络访问另一个计算机上的远程服务的应用，例如可以包括通常所谓的“网络浏览器”。在本实施例中，一些通常使用的网络浏览器包括：可从微软公司得到的Microsoft?Internet Explorer 8，可从Mozilla公司得到的Mozilla Firefox? 3.6，可从苹果计算机公司得到的Safari 4，来自Google^TM公司的Google Chrome，或现在已知的或将来要开发的其它类型的网络浏览器。此外，在同一实施方案或其它实施方案中，因特网客户可以包括专用软件应用程序（或可能成为它的一个元件），该专用软件应用程序使得能经由网络（例如用于生物学用途的数据处理应用程序）来访问远程信息。

网络可以包括本领域普通技术人员所熟知的许多不同类型网络中的一个或多个。例如，网络可以包括局域网或广域网，其使用通常所谓的TCP/IP协议组进行通信。网络可以包括具有互连的计算机网络的全球系统的网络（其通常称为因特网），或还可以包括各种内联网结构。相关领域的普通技术人员还会理解，一些用户在网络化的环境中可能偏好使用通常所说的“防火墙”（有时候也称为包过滤器或边界保护设备）来控制去往和来自硬件和/或软件系统的信息交换。例如，防火墙可以包括硬件或软件元件或它们的一些组合，并且通常设计成强化用户设置的安全规则，例如用于即时的网络管理等。

b. 本文所述的发明的实施方案

如上所述，所述发明的实施方案涉及用于加工乳状液以安全地且有效地提取其中含有的生物制品的改良的系统、方法和试剂盒。所述的实施方案可以用于从乳状液系统回收水相（或非水相），所述乳状液系统使用异丙醇或其它有机溶剂通过所谓的“盐析”效应来破碎。应当理解，所述的实施方案会提供胜过传统方法的实质性加工改进，因为它们是高度有效的，会维持生物学完整性，且适合由自动化的平台/机器人型平台来执行。

在一个典型的测序实施方案中，可以采用一个或多个仪器元件来执行一个或多个过程步骤。例如，使用仪器来自动化和实现一些或所有过程步骤，可以实现测序方法的实施方案。图1提供了用于需要捕获光信号的测序过程的测序仪器100的一个例证实施例，其通常包括光学子系统和流体子系统，它们用于执行在反应基质105上发生的测序反应和数据捕获。但是，应当理解，对于需要其它数据捕获模式（即PH、温度、电化学的等）的测序过程，可以采用数据捕获模式的子系统，它们是相关领域的普通技术人员已知的。用于执行测序过程的测序仪器100的实施方案可以另外包括在图1中未图解的不同额外组件，诸如用于一些功能的局部控制的微处理器和/或微控制器组件。

在一些实施方案中，使用样品制备仪器180，可以任选地以自动化的或部分自动化的方式制备用于测序的样品，所述仪器构造成使用仪器100来执行测序必需的一些或所有制备。样品制备仪器的实例可以包括机器人平台，诸如可从Hamilton Robotics、Beckman Coulter或Caliper Life Sciences得到的那些。此外，如图1所示，测序仪器100可以可操作地连接至一个或多个外部计算机组件诸如计算机130，后者可以例如执行系统软件或固件诸如应用程序135，后者可以提供一个或多个仪器（诸如测序仪器100或样品制备仪器180）的指令控制和/或数据分析功能。计算机130可以另外经由网络150可操作地连接至其它计算机或服务器，所述网络可以实现仪器系统的远程操作和大量数据向存储和处理系统的输出。在本实施例中，测序仪器100和/或计算机130可以包括上面一般地描述的实施方案的一些或所有组件和特征。

用于破碎含有生物物质的乳状液的传统方法通常已经采用异丙醇或其它无毒溶剂的应用，以破坏在生物相容的油中乳化的水性微滴的完整性，从而将每个微滴的内容物释放到溶液中，该过程通常称作乳状液“破碎”。应当理解，如果没有以某种方式隔离所述生物物质（即通过结合到基质上或其它隔离方式），结果是，所有生物物质在整个体积中混合。因而，在优选的实施方案中，在释放之前，将生物物质隔离至微滴内的基质上，其中所述基质（诸如珠子基质）然后可以与进一步应用不再需要或对其有害的乳状液组分（即油、表面活性剂等）分离。在所述的传统实施方案中，高速离心已经普遍地用于从乳状液中提取出珠子。通常，该步骤需要重复数次，以分离油和表面活性剂物质离开珠子，随后进行缓冲液冲洗和其它离心步骤，以去除溶剂。因而，应当理解，传统的方法是非常耗时的，对离心步骤的需要会限制采用低成本的实验室自动化平台的能力。

所述发明的实施方案提供了容易的、快速的、且节省成本的方法，其中在用异丙醇或同样有效的溶剂破碎以后，从油相分离出水相，用于通过普通技术人员所说的盐析效应，从水相萃取溶剂。结果是完全相分离，其能够有效地分离核酸结合的基质。例如，本发明的一些实施方案采用亲水珠子，所述珠子在相分离步骤以后优先保留在水相中，可以用过滤管和真空泵装置回收。在本实施例中，使用可商业得到的平台的实验室自动化变得可行。

相关领域的普通技术人员会理解，从水性溶液中盐析异丙醇的过程通常被接受为分离和浓缩异丙醇的方法。一个实例描述在Zhigang等人, J. Chemical Technology & Biotechnology 76（2001）757-763，其为了所有目的特此通过引用整体并入本文。但是，在所述发明中采用的盐析过程不同于现有方法，因为它用于从水相强制分离溶剂、表面活性剂和油，目的是回收生物物质。例如，一旦已经在乳状液中完成了生物加工步骤，加入异丙醇或其它相容的溶剂来破碎微滴和释放生物物质。在本实施例中，将无机盐加入破碎的乳状液混合物中，造成油相和水相的分离。在有些实施方案中，可以采用颗粒状的无机盐，但是，在替代实施方案中，可能优选的是，将盐加入溶液相中（即溶解在水中），这会提高盐在破碎的乳状液混合物中的扩散，并增加相分离的速率。通常还合乎需要的是，在盐加入以后，通过诸如涡旋或摇动，机械地混合溶液，以将盐彻底地分布在溶液中。在所述的实施方案中，可以采用多种生物学上相容的溶剂，诸如异丙醇、乙醇等。此外，任意类型的无机盐是有效的，这至少部分地取决于使用的溶剂的类型，所述无机盐包括、但不限于：NaCl、KCl、LiCl、Na₂SO₄、碳酸钾、硫酸铵等。

续接上面的实施例，当将无机盐加入破碎的乳状液混合物中时，水分子被盐离子吸引，因而更少地与溶剂相互作用，导致清楚地确定的溶剂和油/表面活性剂（即油相）从水性相/盐（即水相）分离。在优选的实施方案中，亲水珠子停留在水相中，这是由于珠子的表面性质。重要地是，发现水相的密度低于油相的密度，因而导致水相成为上层，油相成为下层。此外，在许多实施方案中，珠子的密度通常高于水相并低于油相，因而在相分离以后，珠子通常位于上层和下层之间的相界面处或附近，其中相对容易地随后回收珠子。在一些实施方案中，可以使用真空泵和过滤管来去除水相并捕集珠子到允许流体穿过的滤芯中，这可以在自动化的处理平台上实现，所述平台例如可商业得到的机器人平台，包括可从Beckman Coulter, Inc.得到的Biomek?FX实验室自动化工作站、可从Caliper Life Sciences得到的Sciclone ALH 3000液体处理工作站或其它相容的实验室自动化平台。另外，因为存在水相的完全回收，珠子和有价值的生物资源的损失机会较小。

在一些实施方案中，可以添加提高水相的提取的额外步骤。例如，在水相和油相分离以后，可以在第一水相和第二油相之间导入第三相层，以产生额外的相“间隙”。重要的是，为了产生“间隙”相而导入的物质应当不会与水相或油相混合，以产生那些相之间的清楚地确定的分离。在本实施例中，在盐析过程已经分离水相和油相以后，可以使用本领域已知的方法（诸如吸液），在水相和非水相之间缓慢地导入一定体积的高粘度硅油。这会使在水相中的珠子与油相进一步分离，并提供珠子的更容易提取，其中有些间隙相可以与珠子一起可接受地回收，它们中的大部分可以容易地穿过滤芯。为了形成间隙相而导入的物质的体积可以取决于希望的间隙相对于容器容积的大小或程度。在有些实施方案中，作为间隙相导入的油的组成可以与用于生产乳状液的油（已知其是生物学上相容的，且通常适合与可得到的过滤装置一起使用）相同，但是，由于乳状液油相中的额外组分（即溶剂和表面活性剂），在油相和间隙相之间仍然存在密度差，因而第三间隙和第二油相之间的混合受到抑制。类似地，由于密度差，第一水相和第三间隙相之间的混合受到抑制，且珠子基质通常保留在水相中。在一些实施方案中，还可能合乎需要的是，额外地冲洗回收的核酸结合的基质，以去除任何不希望的残余组分。例如，如果使用间隙相，可能合乎需要的是，用缓冲溶液冲洗回收的基质，以去除任何残余的油。在一些实施方案中，还可能合乎需要的是，将缓冲剂与表面活性剂（诸如在乳状液中使用的表面活性剂类型）相组合，以辅助去除残余的油和/或其它残余组分。

例如，图2提供了使用盐析方法从乳状液中提取核酸珠子的方法的一个例证实施例。如步骤210所示，以约1:1体积比，将PCR后的乳状液（其具有含有亲水珠子的单独微滴，所述亲水珠子具有固定化的从单个模板分子扩增的核酸分子群体）与异丙醇彻底混合。在已经破碎乳状液的大部分水性微滴以后，加入一定体积的无机盐溶液诸如5M NaCl，并如步骤230所示，混合整个体积，并静置以发生相分离过程（~5 min）。必需的无机盐溶液的浓度和/或体积可以随破碎的乳状液组分的体积而变化，其中组合的混合物中的无机盐的终浓度是完全相分离（即水相不具有“乳状”外观）所指示的重要因素。步骤250解释了下述任选的步骤：将20 cst（cst或厘沲是运动粘度的量度）硅油缓慢地导入分离的水相和油相中，以建立在水相和油相之间希望的距离的间隙相。接着，如步骤270所示，萃取整个水相，且在有些情况下，萃取间隙相的一部分。然后可以如步骤290所述如下收集生物物质：通过加入去离子（也称作DI）水来稀释萃取的水溶液，并使用真空泵用5 μm过滤器捕获珠子基质。

实施例1: 乳状液破碎和通过盐析效应去除溶剂

富集: （对照：传统的离心方法；新方法：盐析方法）

与用传统方法回收的珠子相比，用盐析方法回收的珠子同样好地或更好地富集。

* 富集比表示加入emPCR过程中的珠子的总数与用扩增的核酸产物回收的珠子的数目之比。

测序来自回收的珠子的扩增的核酸群体：

用盐析方法和传统方法回收的珠子表现出可比较的测序结果。

样品1和4是使用对照方法，样品2、3、5和6是使用新方法，其使用已知序列组成的片段，其中新方法的样品表现出与对照方法的样品相当的测序准确度，这至少如下证实：从样品测得的序列组成相对于已知组成的准确度为≥95%和≥98%。

已经描述了不同的实施方案和实现，相关领域的技术人员会明白，前述内容仅仅是例证性的，而不是限制性的，仅作为实施例提供。许多用于在例证的实施方案的不同功能元件中分配功能的其它方案是可行的。在替代实施方案中，可以以不同的方式实现任意元件的功能。

Claims (16)

1.一种用于从乳状液中提取生物物质的方法，所述方法包括下述步骤：

a）使用溶剂破碎乳状液，所述乳状液包含多个在油连续相中的水性微滴，以生产混合的水-油混合物，其中所述溶剂破裂水性微滴，所述水性微滴释放出多个生物学成分到混合的水-油混合物中，所述生物学成分各自固定化在基质上；

b）将无机盐导入混合的水-油混合物中，造成所述混合物相分离成包含水性溶液和生物学成分的第一相与包含溶剂和油的第二相；

c）从所述第二相萃取所述第一相；和

d）从所述第一相收集基质固定化的生物学成分。

2.如权利要求1所述的方法，其中；

所述溶剂选自异丙醇和乙醇。

3.如权利要求1所述的方法，其中：

所述生物学成分固定化在珠基质上。

4.如权利要求3所述的方法，其中：

所述珠基质是亲水的。

5.如权利要求1所述的方法，其中；

所述生物学成分包括核酸。

6.如权利要求5所述的方法，其中：

多个所述基质各自包含从水性微滴之一内的单个核酸扩增的核酸群体。

7.如权利要求5所述的方法，所述方法另外包括下述步骤：

e）测序多个所述的核酸。

8.如权利要求1所述的方法，其中：

所述无机盐选自：NaCl、KCl、LiCl、Na₂SO₄、碳酸钾和硫酸铵。

9.如权利要求1所述的方法，其中：

所述无机盐以颗粒形式导入。

10.如权利要求1所述的方法，其中：

所述无机盐以溶液形式导入。

11.如权利要求1所述的方法，其中：

步骤b)另外包括：混合无机盐和混合的水-油混合物。

12.如权利要求1所述的方法，所述方法另外包括：

在所述第一相和所述第二相之间导入物质，以产生间隙相。

13.如权利要求12所述的方法，其中：

所述物质包括油。

14.如权利要求13所述的方法，其中：

所述油包括硅油。

15.如权利要求1所述的方法，其中：

使用滤芯收集基质固定化的生物学成分。

16.一种用于从乳状液回收生物物质的系统，所述系统包括：

用于执行如权利要求1所述的方法的实验室自动化平台。

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