CN102703497B - 水稻矮杆株系创制的方法及其用途、恢复矮杆性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物工程技术领域中的水稻矮杆株系创制的方法及其用途、恢复矮杆性状的方法；所述创制的方法(a)采用常规基因工程方法，敲除或者改变编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列发生缺失或变异，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的活性水平下降或丧失；或者(b)采用常规基因工程方法，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。本发明获得的水稻突变体进入生殖生长阶段后分蘖发育迟缓，抽穗期分蘖茎节高度相比于主茎高度有不同程度下降，产量并无显著下降，在农业生产上具有重要的应用。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域中的水稻株系创制的方法，具体是一种水稻矮杆株系创制的方法及其用途、恢复矮杆性状的方法。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物之一，我国有60%以上人口以稻米为主食，是世界上最大的稻米生产国和消费国。我国水稻年播种面积3000万公顷，占世界的20%；产量1.85亿吨，占世界的近1/3，单位面积产量6.35吨/公顷。比全球平均产量3.85吨/公顷高65%。水稻在我国谷物产量中始终保持在总量的40%左右，占据了近半壁江山。
株型建立是高等植物发育过程中的重要事件，对于植物更好地适应外界环境、充分吸收光能具有重要意义。高等植物的株型建成主要取决于株高、分支数目和分支角度等几个方面，涉及多种植物器官的发生和形态建成过程。在农业生产中，合理株型是作物丰产的基础，其中矮生性状是理想株型性状的一个重要方面。矮杆作物品种耐肥，抗倒伏，适宜密植，能够充分利用土地和光照资源。上世纪60年代，水稻、玉米、小麦等作物矮杆品种的选育和推广，引发了全球作物育种史上著名的绿色革命。
自从1922年印度学者Parnell等首次报道了一个水稻自然矮杆突变株系后，迄今已筛选到70多个不等位的矮杆和半矮杆株系，但目前在生产中广泛应用的主要是含sd-1血缘的半矮杆株系。根据对1980-1985年间南方稻区育成的313个籼稻品种的系谱分析结果，发现含sd-1血缘的品种占总品种数的75.6%。其他矮源难以应用的原因在于所携带突变基因不仅对株高有作用，通常还对构成水稻产量的穗数、粒数和粒重3个因素中的某1个或某几个性状产生不良的多效影响。矮源的单一化造成潜在的遗传背景单一的风险，也限制了由此育成品种产量的进一步提高。因此，研究选育新型水稻矮杆株系并对其调控机理进行深入研究，是进一步发掘水稻优质矮源的必要前提和基础。
现有的转基因工程技术是建立在对植物正常发育过程分子调控机制充分研究和认识的基础上加以应用的，因此，深入研究水稻株型建立特别是水稻矮秆的机理及调控网络并加以应用是在生产上研发新型优良株型的基础。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种水稻矮杆株系创制的方法及其用途、恢复矮杆性状的方法，利用DWT1基因及其蛋白参与调控水稻株型特别是控制水稻茎杆高度的特点，及其利用转基因技术控制水稻株型上的特性，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻矮杆株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
第一方面，本发明涉及一种水稻矮杆株系创制的方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻矮杆株系，所述处理为，
(a)采用常规基因工程方法，敲除或者改变编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列发生缺失或变异，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的活性水平下降或丧失；
或者(b)采用常规基因工程方法，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。
优选地，所述水稻品种为粳稻品种武育粳7号、龙特浦B或者9311。
优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述水稻矮杆株系创制的方法包括如下步骤：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.4，培育，进而获得所述水稻矮杆株系，即dwt1突变体。
优选地，所述水稻矮杆株系创制的方法包括如下步骤：构建所述基因的RNA干扰植物表达载体，转化水稻植株，进而获得所述水稻矮杆株系。
第二方面，本发明还涉及前述方法获得的水稻矮杆株系在水稻制种中的用途，其特征是，所述用途为：
(a)以所述水稻矮杆株系做为常规育种的矮杆材料，进行育种；
或者(b)以所述水稻矮杆株系作为母本，进行杂交育种。
第三方面，本发明还涉及恢复前述方法获得的水稻矮杆株系的矮杆性状的方法，将根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819转入所述水稻矮杆株系，培育，即得；其中CGMCC No.4819含有编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸；具体包括如下步骤：
(a)提供携带表达载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819；
(b)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；
(c)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得水稻植株。
优选地，所述编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。
第四方面，本发明还涉及一种根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819。
本发明具有如下的有益效果：本发明通过控制水稻Homeobox结构域的转录因子DWT1基因及其编码蛋白获得水稻茎节矮化和株型变化的变异株，实现控制水稻茎节高度和株型建成；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后分蘖发育迟缓，抽穗期分蘖茎节高度相比于主茎高度有不同程度下降，虽然分蘖穗粒数略低于来源亲本，但主穗粒数和粒重都有大幅提高，因此产量并无显著下降，在农业生产上具有十分重要的应用。
本发明涉及的根癌土壤杆菌EHA105已经于2011年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.4819，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。
附图说明
图1为pHB载体及DWT1 RNAi构建示意图。
图2为dwt1突变体植株的形态学观察示意图。
图3为dwt1突变体分蘖矮化类型统计图。
图4为DWT1基因表达模式图。
图5为互补突变体得到野生型表型示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
所述DWT1基因为编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。
实施例1、水稻矮杆株系创制的方法
1.1通过基因工程或其他手段创制dwt1水稻矮杆株系
本实施例中DWT1基因的编码区序列如SEQ ID NO.3所示。本实施例的dwt1突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号（又名9522）经过对DWT1基因的RNA干扰或者序列变异获得。
1.2水稻分蘖株高控制蛋白基因的克隆
利用发明人构建的包含分蘖株高控制蛋白基因DWT1及其突变基因dwt1组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组片段内，例如50Kb内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经酶切和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻的茎杆伸长蛋白DWT1。
经全核苷酸序列分析结果表明：水稻茎杆伸长基因全长为6766bp（SEQ ID NO.1，包含调控区和内含子）。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO.2所示，编码全长为533个氨基酸的水稻分蘖株高控制蛋白，其序列如SEQ ID NO.3所示。
1.3水稻分蘖株高控制蛋白基因的点突变
本实施例的dwt1突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号（又名9522）经过对DWT1基因的序列变异获得，经过对DWT1突变基因dwt1的序列比较，分蘖株高控制蛋白的移码和提前终止可以消除野生分蘖株高控制蛋白的功能；本实施例DWT1突变基因是在编码区的1个碱基对缺失（其序列如SEQ ID NO.4所示）引起水稻分蘖株高控制蛋白功能丧失。
1.4通过RNAi手段降低水稻品种中的DWT1的表达水平
为了对DWT1蛋白进行应用，构建了DWT1基因RNAi的载体，并转化野生型9522植株，以期降低DWT1的表达，从而达到改变水稻植株形态的目的。
从水稻cDNA克隆（DWT1_EST clone）中用引物
DWT-Ri-F:5’GGCAAGCTTTCTAGACACCAGCAGATGCTCTATCA 3’和
DWT-Ri-R:5’GGCGAATTCGGATCCGCTCCAGGCGCAGCTCTTGT 3’
扩增出DWT1基因编码区序列的第688位至第975位共288bp的特异性片段；将这个片段分别通过BamHI/XbaI和HindIII/EcoRI正反向插入连入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用HindIII和SacI酶切切下含有DWT1正反向特异性片段和Intron和片段，连入经同样酶切的pHB载体中(图1)。再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pHB-DWT1-RNAi质粒。
将含有DWT1基因RNA干扰构建的农杆菌在含有Kan（50μg/μl）的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1%接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD600为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的9522未成熟种子经70%乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中（与水1:3混合，加2-3滴吐温20）消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种月N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有25mg/L Hyg的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。
获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。RT-PCR分析阳性植株中DWT1基因的表达水平，表达水平降低到野生型50%以下为有效RNA干扰植株。
1.5DWT1蛋白活性丧失或表达水平降低水稻分蘖株高
对dwt1突变体植株的形态学观察。如图2，野生型和突变型dwt1的表型对比显示野生型主茎及分蘖高度一致（左）（A，B，C），而dwt1突变型分蘖比主茎矮化，茎节节间缩短（右）（A，B，C）；突变体中缩短的茎节处着生的叶鞘被拉伸撕裂（D）；突变体中茎节有不同程度的缩短（E）；野生型茎节处的细胞伸长正常（F），而突变体的茎节的细胞扁平无法正常纵向伸长(G)。
dwt1突变体中主茎高度为73.2cm，与野生型的主茎（76.16）无明显高度差异，而突变体的分蘖平均为45.86cm远低于正常野生型分蘖的74.16cm。突变体中节间由正常发育的10cm-20cm缩短至0.5cm左右。在dwt1突变体中主茎和分蘖都存在不同程度的茎节缩短，主要分为以下三种缩短模式：类型一，第二节间特异缩短；类型二，第二三节间特异缩短；类型三，第二三四节间特异缩短（图3）。在主茎中茎节缩短的比例较低只有约25.93%的第二茎节特异缩短，其他几乎全部发育正常。绝大部分的分蘖（98.60%）出现了不同程度的茎节缩短现象，其中15.38%为类型一，35.66%为类型二，37.06为类型三，这三种缩短模式占全部缩短模式的88%以上。
1.6DWT1表达特征
利用dwt1突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定DWT1基因的表达模式（如图4），发现DWT1基因在水稻胚芽鞘，根尖，幼穗，幼胚和愈伤中有显著表达。
1.7DWT1基因在创制其他水稻品系矮杆株系中的应用
将dwt1突变体与籼稻品种龙特浦B或者9311水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了分蘖矮杆株系，符合3:1分离规律，进而证明DWT1基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生矮杆植株；选择其中为分蘖特异矮化的植株为定位群体。
实施例2、dwt1突变体在水稻制种中的用途
将dwt1突变体作为父本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有矮杆及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有矮杆及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的矮杆不育系，适宜作为杂交组合中的母本。在水稻杂交育种实践中，在授粉季节前需对父本喷施赤霉素，促使父本穗高于母本穗，这样可以提高花粉传送和杂交的效率。dwt1突变体分蘖矮杆特性，使母本大部分穗比父本矮，可以省略父本喷施赤霉素步骤。
实施例3、恢复dwt1突变体矮杆性状的方法
将编码DWT1基因的基因组核苷酸序列转入突变体dwt1植株，能够使突变体恢复到野生型表型。
从水稻日本晴BAC克隆(OsJNBb0063g05)中用引物：
DWT-COM-F:5’GCATGGGAATTCCGGTTTGACGCTTA CTGTGGT 3’和
DWT-COM-R:5’CCTTAAGGTCACCTGGCGTTAAGCAAAATGATC AG 3’
扩增出DWT1基因如SEQ ID NO.3所示的6766bp的基因组序列片段。
将该片段通过EcoRI和BstEII插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆菌EHA105，得到根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819，所述的根癌土壤杆菌EHA105已经于2011年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号CGMCC No.4819，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。使用遗传转化手段转化突变体dwt1和野生型9522成熟胚愈伤，以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。T0代获得互补植株，图4显示T0代互补植株表现出的野生型表型。
综上所述，本发明通过控制水稻Homeobox结构域的转录因子DWT1基因及其编码蛋白获得水稻茎节矮化和株型变化的变异株，实现控制水稻茎节高度和株型建成；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后分蘖发育迟缓，抽穗期分蘖茎节高度相比于主茎高度有不同程度下降，虽然分蘖穗粒数略低于来源亲本，但主穗粒数和粒重都有大幅提高，因此产量并无显著下降，在农业生产上具有十分重要的应用。
Claims (9)
1.一种水稻矮杆株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻矮杆株系，所述处理为，
(a)采用常规基因工程方法，将SEQ ID NO.2突变为如SEQ ID NO.4所示序列；
或者（b）采用RNA干扰技术，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。
2.如权利要求1所述的水稻矮杆株系创制的方法，其特征在于，所述RNA干扰技术中RNAi的构建方法为：
从水稻cDNA克隆中用引物
DWT-Ri-F:5'GGCAAGCTTTCTAGACACCAGCAGATGCTCTATCA3'和
DWT-Ri-R:5'GGCGAATTCGGATCCGCTCCAGGCGCAGCTCTTGT3'；
扩增出DWT1基因编码区序列的第688位至第975位共288bp的特异性片段；将这个片段分别通过BamHI/XbaI和HindIII/EcoRI正反向插入连入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用HindIII和SacI酶切切下含有DWT1正反向特异性片段和Intron的片段，连入经同样酶切的pHB载体中；再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pHB-DWT1-RNAi质粒。
3.如权利要求1所述的水稻矮杆株系创制的方法，其特征是，所述水稻品种为粳稻品种武育粳7号、龙特浦B或者9311。
4.如权利要求1所述的水稻矮杆株系创制的方法，其特征是，所述水稻矮杆株系创制的方法包括如下步骤：构建所述基因的RNA干扰植物表达载体，转化水稻植株，进而获得所述水稻矮杆株系。
5.一种如权利要求1所述方法获得的水稻矮杆株系在水稻制种中的用途，其特征是，所述用途为：
(a)以所述水稻矮杆株系做为常规育种的矮杆材料，进行育种；
或者(b)以所述水稻矮杆株系作为母本，进行杂交育种。
6.一种恢复如权利要求1所述方法获得的水稻矮杆株系的矮杆性状的方法，其特征在于，包括如下步骤，将根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819转入所述水稻矮杆株系，培育，即得；其中CGMCC No.4819含有编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸。
7.如权利要求6所述的恢复水稻矮杆株系的矮杆性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)提供携带表达载体的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819；
(b)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的根癌土壤杆菌接触，从而使编码如SEQID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；
(c)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得水稻植株。
8.如权利要求6所述的恢复水稻矮杆株系的矮杆性状的方法，其特征是，所述编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。
9.一种根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105(DWT-COM)CGMCC No.4819。
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