CN102703459A - 一种Exendin9-39基因及其多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Exendin9-39基因及其多肽的制备方法。所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的exendin9-39多肽可用于制备毛皮动物增肥产品。采用本发明方法，使Exendin9-39多肽在原核细胞中表达，比人工合成价廉、方便，更加适用于动物生产领域，可显著降低应用成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种Exendin9-39基因及其多肽的制备方法。
背景技术
Exendin9-39基因是含有31个氨基酸残基的小肽，它是由Exendin-4的39个氨基酸残基缺失N端的前8个氨基酸残基后得到的。Exendin-4发现与美国毒蜥蜴分泌的毒液中。其作用主要是动物体内的类胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体的激活剂，促进GLP-1与受体结合，诱导cAMP的产生，从而发挥出类似GLP-1的作用：增加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，加速葡萄糖清除，延缓胃排空和诱发饱腹感、抑制食欲；还可以改善外周胰岛素抵抗等。而缺少8个氨基酸的exendin9-39却是GLP-1受体的抑制剂，其作用也与exendin-4完全相反：降低胰岛素的分泌、增加胰高血糖素的分泌、增加食欲等（
R et al.Exendin-4is a high potency agonist and truncated exendin-(9-39)-amide anantagonist at the glucagon-like peptide 1-(7-36)-amide receptor ofinsulin-secreting beta-cells.J Biol Chem.1993Sep 15,268(26):19650-5.Schepp W et al.Exendin-4and exendin-(9-39)NH2:agonist andantagonist,respectively,at the rat parietal cell receptor for glucagon-likepeptide-1-(7-36)NH2.Eur J Pharmacol.1994Oct 14,269(2):183-91.Thorens B et al.Cloning and functional expression of the human isletGLP-1receptor.Demonstration that exendin-4is an agonist andexendin-(9-39)an antagonist of the receptor.Diabetes.1993Nov,42(11):1678-82.）
早在1999年，Karim Meeran等用大鼠的实验证明，exendin9-39能够提高动物食欲，并能增加动物的体重。每天注射30nmol的exendin9-39于大鼠的侧脑室中，连续注射3天，与注射生理盐水的对照组相比，实验组大鼠平均每天的饲料消耗是21.9±0.5vs.19.5±0.4g P<0.001,最终体重增加7±2vs.2±1g;P<0.02（Meeran K,etal.Repeated Intracerebroventricular Administration of Glucagon-LikePeptide-1-(7-36)Amide or Exendin-(9-39)Alters Body Weight in theRat.Endocrinology.1999Jan;140(1):244-50.）。
目前，exendin9-39主要采用化学合成，成本高（对原料氨基酸及仪器设备要求极高）、产量少。利用基因工程生产exendin9-39，不仅可以实现工业化的大规模生产、有效地降低生产成本，而且终产品污染各种有害化合物的机会绩效，产品更加安全。但关于exendin9-39的原核表达和提取纯化尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种Exendin9-39基因用于原核表达生产Exendin9-39多肽。
本发明另一目的是提供制备Exendin9-39多肽的方法。
根据遗传密码表，并考虑到大肠杆菌密码子的偏爱性，进行选择性优化，设计推导出exendin9-39基因的原核表达编码序列如SEQID NO.1所示。Exendin9-39基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
exendin-4失去N端的前8个氨基酸后的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。（Chen YE,Drucker DJ.Tissue-specific expression ofunique mRNAs that encode proglucagon-derived peptides or exendin 4in the lizard.J Biol Chem.1997Feb 14;272(7):4108-15.）相比之下，本发明设计的exendin9-39的核苷酸序列与exendin-4失去N端的前8个氨基酸后的核苷酸序列显著不同，二者的同源性为75%。
其中，所述Exendin9-39基因通过基因克隆可得到重组载体。
其中，所述Exendin9-39基因或所述重组载体可导入宿主细胞。
其中，所述Exendin9-39基因可应用于制备Exendin9-39多肽。
将人工设计好的exendin9-39基因序列（携带BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点）进行人工合成，插入到原核表达载体pET-28b(+)中，构建高效原核表达载体，转化到大肠杆菌BL-21(DE3-plyss)中，通过诱导表达，获得表达产物并提取纯化。
本发明所述Exendin9-39多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）用Exendin9-39基因构建表达载体；
2）将表达载体导入宿主菌中，筛选得到表达Exendin9-39多肽的工程菌；
3）培养所述工程菌，并诱导Exendin9-39多肽的表达。
其中，所述表达载体为原核表达载体。
其中，所述宿主菌为大肠杆菌。
其中，所述Exendin9-39多肽利用组氨酸标签进行亲和层析纯化，可得到目的蛋白。
所述exendin9-39基因可应用于制备动物增肥产品。
本发明的有益效果：
1)本发明利用大肠杆菌的密码子的偏爱性，人工合成了exendin9-39的核苷酸序列，并构建成原核表达载体，进行原核表达，比人工合成价廉、方便，更加适用于动物生产领域，可显著降低应用成本。
2）本发明的exendin9-39多肽能提高动物的食欲、抑制胰岛素的分泌，可用于毛皮动物增肥。
3）本发明的exendin9-39多肽用于水貂、狐狸等毛皮动物，仅利用动物的毛皮，动物尸体进行销毁，或用于生产工业用油，不存在生物安全的问题。
附图说明
图1为Exendin9-39多肽Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中1泳道：Marker，2、3、4泳道为纯化后的样品。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。pET-28b（+）表达载体购自Novagen公司；BL21(DE3)pLysS宿主菌购自北京百泰克生物技术有限公司；基因序列由上海生工生物工程公司合成。DH5α感受态细菌购自天根生物技术有限公司。
实施例1人工设计合成exendin9-39的核苷酸序列
根据已发表的exendin-4的核苷酸序列和大肠杆菌的密码子的偏爱性特点，人工设计合成exendin9-39的核苷酸序列。完整的表达框序列如SEQ ID NO.1所示。在exendin9-39基因N端加上BamH Ⅰ酶切位点ggatcc和C端加上HindⅢ酶切位点aagctt。加入酶切位点的序列如下：
GGATCCATGGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTCATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGTCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGCCGAGCAAGCTT
实施例2构建原核表达载体
将合成的核苷酸序列经BamH Ⅰ和HindⅢ酶切并回收，同时将空载体pET-28b（+）也用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切，回收大片段，再按摩尔比（1：5）加入回收的合成序列，同时添加T4连接酶，16℃连接4小时以上。将连接产物转化DH5α感受态细菌，铺氨苄青霉素平板，37℃过夜培养后，挑选单菌落进行筛选，鉴定大小和方向，最后测序确定所得质粒为含有exendin9-39基因的原核表达载体。命名为pET-EX9-39。
测序结果如下：
GATCCATGGATCTGAGCAAACAGATGGAAGAAGAAGCGGTGCGTCTGTTCATTGAATGGCTGAAAAACGGCGGTCCGAGCAGCGGCGCGCCGCCGCCGAGCAAGCT
证实插入序列为人工合成的exendin9-39的核苷酸序列，所得质粒正确。
实施例3exendin9-39的原核表达
将上述pET-EX9-39转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌中：取1μl质粒DNA加入到200μl冰浴融化的大肠杆菌感受态细胞DH5α中，继续冰浴40分钟，42℃热冲击120秒，迅速取出返回到冰水浴中10分钟，然后加入800μl的LB培养基37℃培养1小时，取100μl铺氨苄青霉素平板进行筛选，挑单菌落加入到10ml的含工作浓度的氨苄青霉素的LB培养基中，培养过夜，然后取过夜培养物，按1%体积接种到500ml LB培养基中，待OD600=0.5-0.7左右时，加入工作浓度为1mmol/L的IPTG诱导，约5-7小时后收菌，提取纯化。
实施例4exendin9-39多肽的纯化及鉴定
诱导后收集菌体，利用超声处理，破坏菌壁，可得粗制品，然后利用组氨酸标签进行Ni+-NTA亲和层析柱(北京慧德易科技有限责任公司，BIO-RAD产品；Ni+-NTA agarose，QIAGEN公司产品)纯化，得到目的蛋白，经Tricine-SDS-PAGE得到单一条带。电泳结果如图1所示。得到的目的蛋白约占菌体总蛋白的28%，纯化后的蛋白纯度达到93%。
实施例5exendin9-39多肽生物活性测定
取20只健康成年Wistar大鼠（10周龄），公母各半，实验组和对照组各10只。每天注射30nmol的exendin9-39于实验组大鼠的侧脑室中，连续注射3天，实验组大鼠与注射生理盐水的对照组大鼠相比，平均每天的饲料消耗是22±0.5vs.18±0.4g（P<0.001），最终体重增加8±2vs.3±1g（P<0.02）。
Claims (9)
1.Exendin9-39基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的重组载体。
3.含有权利要求1所述基因或权利要求2所述重组载体的宿主细胞。
4.权利要求1所述基因在制备Exendin9-39多肽中的应用。
5.权利要求1所述基因在制备动物增肥产品中的应用。
6.一种制备Exendin9-39多肽的方法，包括以下步骤：
1）用权利要求1所述的基因构建表达载体；
2）将表达载体导入宿主菌中，筛选得到表达Exendin9-39多肽的工程菌；
3）培养所述工程菌，并诱导Exendin9-39多肽的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述Exendin9-39多肽进行分离纯化。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017192449A1 (en) * | 2016-05-06 | 2017-11-09 | Phasebio Pharmaceuticals, Inc. | Elp fusion proteins for controlled and sustained release |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586104A (zh) * | 2008-05-19 | 2009-11-25 | 河南农业大学 | Exendin-4高产工程菌株的构建方法 |
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 20081015 孙向宇 Exendin-4（9-39）毕赤酵母工程菌的克隆及发酵研究 7，16-24 1-9 , 第10期 * |
| YUQING E. CHEN等: "Tissue-specific Expression of Unique mRNAs That Encode Proglucagon-derived Peptides or Exendin 4 in the Lizard", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| 孙向宇: "Exendin-4（9—39）毕赤酵母工程菌的克隆及发酵研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
| 祖向阳: "Exendin-4的生物合成及其生物活性", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017192449A1 (en) * | 2016-05-06 | 2017-11-09 | Phasebio Pharmaceuticals, Inc. | Elp fusion proteins for controlled and sustained release |
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