CN102703421A - 利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法及其装置 - Google Patents

利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法及其装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法，诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min。所述的方法中采用的高压电晕电场装置，针尖间距为20mm，针板间距是25mm，针尖直径d＜0.01mm。黄霉素产生菌08-28对电场很敏感，随着诱变剂量的增大菌种致死率也随之增大，诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min时是最佳诱变剂量。经过电场诱变处理、筛选及传代培养得到了“诱变3号”菌株，其产黄霉素的能力相对原始菌株最高提高了1.92倍。说明高压电晕电场处理黄霉素产生菌有较好的诱变效果。

Description

利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法及其装置
技术领域
本发明涉及的是一种利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法及其装置。
背景技术
黄霉素(Flavomycin)又名默诺霉素(Moeno-mycin)、黄磷酯素(Flavophospolipl）、斑伯霉素(Bam-bermycin)，是德国赫斯特公司在20世纪70年代初期开发的一种新型抗生素类促生长剂。黄霉素主要由五个微生物活性物质组成，其中默诺霉素A为主要成分，此种抗生素通过真菌的厌氧发酵形成，存在于菌丝体中，可通过提取分离。对纯化后的抗生素进行理化分析表明，它是一种含磷的糖酯，不同于现有的任何一种抗生素。具有用量小、促生长效果显著，性能稳定，不与其它添加剂产生拮抗作用，不易产生耐药性，无污染、无残留、安全性高等特点。黄霉素在国外畜牧水产养殖业已得到普遍应用，而在我国的应用刚刚起步，科技工作者将紫外(UV)、微波物、离子注入剂和化学[9]诱变技术引进了诱变育种领域。为了提高黄霉素等微生物菌种的生产能力，应用合理的筛选程序及适当的筛选办法把优良的菌种选育出来，开发新的诱变方法为一个有益的尝试，我们用高压电晕电场作为新的诱变源对黄霉素产生菌进行了研究。
自从人们发现电场生物效应后，电场对生物体的影响成为了研究的热点，并且在许多领域得到了应用，电子束辐照可以对食物进行保鲜。电场处理能明显提高植物愈伤组织诱导率和分化率。而利用高压电晕电场对微生物进行诱变的方法尚未见报道。本试验用我们研究设计的针-板高压电晕电场处理装置，以出发菌08-28菌种进行电场诱变处理，以期得到性能稳定、优良高产的黄霉素生产菌种，从而证实高压电晕电场装置可以对微生物进行诱变。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法及其装置。
本发明的技术方案如下：
一种利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法，诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min。
所述的方法中采用的高压电晕电场装置，针尖间距为20mm，针板间距是25mm，针尖直径d＜0.01mm。
黄霉素产生菌08-28对电场很敏感，随着诱变剂量的增大菌种致死率也随之增大，诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min时是最佳诱变剂量。经过电场诱变处理、筛选及传代培养得到了“诱变3号”菌株，其产黄霉素的能力相对原始菌株最高提高了1.92倍。说明高压电晕电场处理黄霉素产生菌有较好的诱变效果。
附图说明
图1为高压电晕电场实验装置；a：针尖间距；d：针板间距；A：电流表；V：电压表；
图2为负电晕放电的伏安特性；
图3为正电晕放电的伏安特性；
图4为极板间温度与电压的关系；
图5为诱变致死率曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1.材料和方法
1.1材料
1.1.1菌种 出发菌种：08-28(斑驳链霉菌S.bambergiensis)内蒙古中牧生物药业有限公司提供。
1.1.2试剂 黄霉素标准品(1mg相当于1395黄霉素单位)，中国兽医药品监察所；硫酸链霉素(650μg/mg)，进口；Ager，Japan；糊精、K2HPO43H2O，天津市风船化学试剂科技有限公司；FeSO4·7H2O、葡萄糖、MgSO4·7H2O，天津市四通化工厂；甲酸铵、蛋白胨、天津市光复精细化工研究所；酵母浸粉，北京奥博星生物技术责任有限公司；抗坏血酸，天津市化学试剂三厂；牛肉浸膏，天津市英博生化试剂有限公司；淀粉酶，北京双旋微生物培养基制品厂；Tris-Base，Sigma；以上试剂均为分析纯。甲醇(色谱纯)，天津市光复精细化工研究所；乙腈(色谱纯)，天津市永大化学试剂有限公司；大豆粉、玉米浆、玉米淀粉，市售。
1.1.3色谱柱 选用Agilent HC-C18色谱柱(250×4.6mm)。
1.1.4仪器AKTA Purifier 10蛋白纯化仪(通用电气中国医疗集团)；JY92-II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；数显恒温水浴锅(苏州威尔实验用品有限公司)；KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；G154DWS型高温灭菌锅(美国独资致微厦门仪器有限公司)；BSllOS型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；高速冷冻离心机(USA)；恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)；生化培养箱(湖北省黄石市恒丰医疗机械有限公司)。
1.1.5培养基 斜面及平板分离培养基(g/100mL)：糊精1.5g，K2HPO4·3H2O 0.05g，蔗糖0.3g，MgSO4·7H2O 0.04g，酵母浸粉0.3g，FeSO4·7H2O 0.01g，大豆蛋白胨0.5g，NaCl 0.05g，牛肉浸膏0.1g，琼脂粉1.2g。使用超纯水配制，定容至配制体积，用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节pH至6.8-7.0。
种子摇瓶培养基(g/100mL)：玉米浆0.3g，K2HPO4 0.1g，大豆粉3.0g，轻质CaCO30.25g，葡萄糖4.0g。注：超纯水配制，配制时，先将玉米浆和大豆粉加水混合，在100℃下加热糊化30min；再加入其他成分，定容至配制体积调节pH至6.8-7.0，CaCO3单独称量且分装到每个摇瓶中。
发酵摇瓶培养基(g/100mL)：玉米浆0.9g，FeSO4·7H2O 0.00004g，大豆粉3.4g，CoSO4·7H2O 0.0001g，玉米淀粉3.2g，ZnSO4·7H2O 0.0002g，大豆色拉油4.0g，CuSO4·5H2O 0.0005g，(NH4)2SO4 0.3g，CaCO3 0.5g，K2HPO4 0.01g，淀粉酶，0.0000064g，MgSO4·7H2O 0.05g，消泡剂0.02ml/100ml。
以上均为121℃灭菌30min。
1.1.6培养条件
斜面及平板分离培养基：37℃恒温培养72h-96h，单菌落直径在3-5mm。
种子摇瓶培养基：37℃恒温培养24h，摇床转速250-260r/min。
发酵摇瓶培养基：37℃恒温培养170h，摇床转速250-260r/min。
1.1.7菌悬液的制备
取平板分离培养基上生产良好的单菌落，在无菌状态下接至种子药瓶中。待培养完成后，将已灭菌的玻璃珠和碎玻璃片倒入三角瓶中，包扎好，放在摇床上(250-260r/min)振荡30分钟后，梯度稀释平板计数，菌丝段浓度约为8*107个/ml，封口待用。
1.2方法
1.2.1平板分离 取一定量出发菌液08-28进行梯度稀释并涂布在平板分离培养基上，37℃恒温培养3-4d，以去除杂菌。
1.2.2抗性菌株的筛选 挑选单菌落制成菌悬液并分别涂布于含有链霉素(浓度为0-1.0u/ml)的平板培养基上37℃恒温培养3-4d。观察不同平板上的菌落生长情况，记录链霉素的最低作用浓度，即为菌株对链霉素的最小抑制浓度，此浓度下生长的菌株即为抗性菌株。
1.2.3高压电晕电场的设计 实验装置示意图如图1所示。直流高压电源分正、负，电压从0到30kV连续可调，针尖间距a＝20mm，针-板间距d＝25mm，用分辨率为10μA、精度为0.8％的μA表检测放电电流，Q-3V型电压表用来检测外加电压。放电介质为常压空气，相对湿度为30％，温度为20～25℃。
1.2.4诱变处理 将筛选出的链霉素抗性菌株接于种子摇瓶培养基中，在37℃，260rpm条件下培养24h。培养完成后，加适量灭菌后的的玻璃珠于种子摇瓶中，摇床中振荡30min后，在无菌工作台中向半径为3.5cm且已灭好菌的培养皿中加入3ml振荡好的菌液。将菌液置于电场针尖下，调节电压使针尖放电。取相同量的原始菌液与诱变后的菌液按梯度涂布于平板分离培养基中，记录菌落个数。在同一梯度下计算致死率：致死率＝(原始菌落数-诱变后菌落数)*100％/原始菌落数。诱变后进行培养并测定效价。
1.2.5效价检测
(1)样品处理
黄霉素标准品：取标准品适量用50％的甲醇溶液稀释至不同浓度，0.22um有机滤膜过滤，超声脱气10min。
原始菌及诱变菌发酵液：取适量发酵液，用50％甲醇溶液稀释，加抗坏血酸80mg，用三羟甲基氨基甲烷约100mg调节pH至8.1±0.1，用细胞粉碎机超声萃取15min，放置室温约30min，用离心机以12000RPM高速离心20min，取上清液用0.22um有机滤膜过滤并收集样品。
(2)BufferA的配制
制备0.2％的甲酸铵溶液(10％的磷酸调节pH至4.9)-乙腈(体积比55∶45)，用0.22um有机滤膜过滤，低频超声脱气约10min。
(3)检测方法
平衡分析柱后，设置流速为0.5mL/min，检测波长为258nm。取样品适量(大于2倍样品环体积)注入至100ul的样品环中，用蛋白纯化仪记录色谱图至黄霉素A组分峰保留时间的2倍。
2结果与分析
2.1高压电晕电场的特性
多次实验结果表明：当针尖间距是20mm，针-板间距是25mm时不影响放电的稳定性，此时放电能量密度较高，所以一般选择针尖间距为20mm，针-板间距是25mm，针尖直径d＜0.01mm。为得到较高的突变率，对微生物进行诱变处理时可根据具体菌种设置针-板间距。本次诱变经多次试验，确定针-板间距为8mm为合适的间距。
外加电压为0到30kv连续可调，实验测得正负电晕放电伏安特性如图2和图3所示。从图中可以看出：无论是正电晕还是负电晕，针对板电晕放电的放电电流随外加电压升高而增加，正电晕放电的电压范围较窄，负电晕放电的电压范围较宽，在相同外加电压下负电晕的放电电流大，曲线平滑，且负电晕放电的稳定性好。
由于极板间存在微小电流，会使极板间空气温度逐渐上升。为了确定极板间空气的温度，我们使用DALI 700B红外热像仪进行了测量。用22℃室温进行调零，每隔1kv测量一次温度，每次调整好电压之后，等待一分钟的时间，以使极板间达到热平衡，拍照并储存照片。根据软件测出图像上所选区域的中值温度，其电压与温度的曲线如图4所示。电压在20kv之前温度随电压的增加而线性升高，电压在20kv之后温度基本趋于稳定，此时温度大约比室温高10℃左右。
2.2菌株对链霉素的耐受性实验
将出发菌种的菌液涂布在含不同浓度链霉素的平板培养基上，观察不同平板上的生长情况如表1所示。
表1出发菌株在含不同浓度链霉素平板培养基上的生长情况
Figure BSA00000735958400061
注：+生长良好，±微弱生长，-不生长
结果表明，在链霉素浓为度0～0.60u/ml的范围内，与不加链霉素的平板相比，菌株基本不受影响。随着浓度增加，菌株逐渐减少，且菌落相对较小，当链霉素浓度达到0.75u/ml时，平板上基本无菌落生长。由此表明，0.75u/ml是黄霉素产生菌08-28对链霉素的最小抑制浓度。在此浓度下生长出来的菌落，具有抗性高，生产代谢能力强等特点。因此，选用此浓度下生长的菌株进行诱变处理。
2.3诱变处理的致死率及最佳诱变条件的确定
不同电场处理剂量下的致死率如图5所示。
参考文献表明：通过致死率曲线可以找到诱变剂量-致死率-突变率三者最佳结合点，致死率达到75％～85％时为较合适的诱变剂量。因此确定电场处理条件为电压21kV时间4min。
2.4黄霉素产量检测结果
2.4.1标准品色谱图及标准曲线 将黄霉素标准品经过处理后注入到蛋白纯化仪中，得到的色谱图。由于不同质量浓度的黄霉素，其色谱图峰面积大小不同，且在一定范围内，峰面积(x)随黄霉素浓度(y)的增减而增减。由此，可以得到一条直线，拟合直线方程为y＝0.5113x+73.678。
2.4.2发酵筛选和高产菌株的稳定性试验 通过对黄霉素标准品的检测，确定黄霉素出峰位置。将每个原始菌株和诱变菌株分别用3个发酵摇瓶进行发酵培养，经过170h后，用蛋白纯化仪进行黄霉素色谱检测，对图像积分得出峰面积，并计算出峰面积的平均值，由标准曲线方程得到对应的效价值。通过进行发酵摇瓶验证，其中原始菌4株，正突变8株，负突变18株，除原始菌外，其它诱变条件均为：诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min。部分结果如表2所示。
表2筛选结果
Figure BSA00000735958400071
注：↓代表负突变
从筛选结果中可以看出，诱变3号的平均效价提高最多，为原始菌的1.92倍，即产黄霉素能力为原始菌的1.92倍，所以选用高产诱变菌株“诱变3号”作为今后试验的菌种。由此可以说明黄霉素产生菌对高压电晕电场是敏感的，而且高压电压电晕电场对黄霉素产生菌有较好的诱变效果。
用群体传代法考察筛选到突变株的斜面稳定性。将诱变3号突变菌株在斜面上连续培养5代，对各代菌株进行发酵培养，结果如表3所示，菌株诱变3号具有较好的遗传稳定性。
表3高产突变株遗传稳定性试验
黄霉素产生菌08-28对电场很敏感，随着诱变剂量的增大菌种致死率也随之增大，诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min时是最佳诱变剂量。经过电场诱变处理、筛选及传代培养得到了“诱变3号”菌株，其产黄霉素的能力相对原始菌株最高提高了1.92倍。说明高压电晕电场处理黄霉素产生菌有较好的诱变效果。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用高压电晕电场对黄霉素产生菌进行诱变的方法，其特征在于，诱变电压为21kV，针尖距离为8mm，诱变时间为4min。
2.权利要求1所述的方法中采用的高压电晕电场装置，其特征在于，针尖间距为20mm，针板间距是25mm，针尖直径d＜0.01mm。
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