CN102697721B - 一种红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种供静脉注射用的红景天苷嵌段聚合物脂质纳米粒制剂及其制备方法，以及该制剂在制备抗癌药物中的用途；其包含红景天苷、嵌段共聚物、脂质、表面活性剂等。

Description

一种红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒制剂

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒制剂及其制备方法和应用。

背景技术

目前，肿瘤治疗是目前世界医学难题之一，治疗方法主要有手术、化疗、放疗、免疫、生物、中药等综合措施。由于肿瘤患者具有病死率高、治愈率低的特点，肿瘤治疗成为当前医学研究中最受重视的领域之一。尽管肿瘤生物治疗应用于临床试验已有10余多年的时间，但还存在着不良反应较大及临床疗效不够显著等主要问题。一些肿瘤化疗药物不但具有心血管系统毒性，而且还可引起静脉炎、恶心呕吐、腹泻、黏膜坏死、脱发、过敏、骨髓抑制等不良反应。

红景天苷(Salidroside)是蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)植物的主要有效成分，结构如下：

红景天苷具有：抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗疲劳等作用。据研究显示，红景天苷具有广泛的抗肿瘤活性，其对乳腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、以及血癌、唾液腺腺样囊性癌等均表现出优异的杀伤性能。通过恶性肿瘤的研究表明，红景天苷可通过诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡等机制抑制Levis肺癌细胞、HL60白血病细胞、肝癌细胞和小鼠移植性肝癌等肿瘤细胞的生长增殖。

然而，临床应用的红景天苷注射剂存在半衰期短、代谢快、血药浓度不稳定、生物利用度低等缺点；因此，研发具有缓释功能的红景天苷的新型载药系统对于推进其临床应用具有重要意义。

近年来，各种可控的载药系统相继被研发，它们可以增加药物的溶解度、降低毒副作用、例如聚合物纳米微球、脂质体、胶束、乳剂、环糊精和前体药物等。其中，脂质体和聚合物纳米粒的研究最为深入，已经得到临床的认可。

脂质体是将药物包埋在类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾等处蓄积，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物毒副作用。由于脂质体的天然类细胞膜结构具有细胞亲和性与组织相容性，因此可以提高药效，但是由于脂质体的疏水性，用其包载亲水性药物会出现包封率低的问题，因而大大限制了其在亲水性药物载药领域的运用。

目前，粒径为100纳米尺度的可生物降解的聚合物纳米粒也已成为学术和产业研究的热点，显示出其显著的疗效。嵌段共聚物纳米粒是由具有亲水性片段和疏水性片段的两亲性嵌段共聚物在水溶液中自发形成的一种自组装结构，具有粒径小、粒度分布窄、载药范围广、结构稳定、体内滞留时间长、可降解等特点。最常用的就是脂肪族聚酯类poly(d，l-lactic-co-glycolicacid)(PLGA)与聚乙二醇(PEG)形成的衍生物如PEG-PLGA和PLGA-PEG-PLGA等。PLGA在体内降解成乳酸和羟基乙酸，最终代谢成水和二氧化碳，无毒性及免疫原性，已被美国FDA批准应用于临床研究。

虽然，用PLGA或PLGA衍生物的纳米粒包载药物已有文献报道，但是实际使用中表明，此类纳米粒对水溶性药物的包封率较低。

综上，研发适于水溶性药物尤其是红景天苷的具有缓释功能的新型载药系统成为目前临场的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种红景天苷脂质纳米粒的新型制剂，引入脂质材料在纳米粒表面形成脂质体包裹，防止纳米粒内层水溶性药物泄露，实现PLGA及其衍生物纳米粒对更多难于包封的水溶性药物的高效包载。

迄今为止，国内外尚未见有关于红景天苷缓释脂质纳米粒制备的报道。在添加脂质成分磷脂和/或胆固醇的前提下，制备PLGA及PLGA衍生嵌段共聚的物脂质纳米粒。

所述脂质纳米粒兼有脂质体和聚合物纳米粒的优点，不但可以提高纳米粒对水溶性药物红景天苷的包封率，且可使红景天苷在体内实现缓释，实现组织靶向，并能提高红景天苷与细胞的亲和性，达到更高的抗癌效果。

为了提高红景天苷的抗癌效果，本发明的目的之一是提供：一种红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒。

本发明所述的一种红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒，即，全文所述的红景天苷脂质纳米粒。

本发明所述的一种红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒，主要由磷脂和/或胆固醇，以及嵌段聚合物制成。。

本发明所述的嵌段聚合物选自PLGA及其衍生物；例如PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA等。

本发明所述的磷脂选自大豆磷脂、卵磷脂、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰三甲基铵丙烷(DOTAP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

本发明的目的之一是提供：一种红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒，基于重量份计，其包含红景天苷0.5～10份，磷脂0.25～20份，胆固醇0.25～5份，嵌段聚合物20～100份；优选地，包含红景天苷0.5～6.25份，磷脂0.25～10份，胆固醇0.25～2份，嵌段聚合物20～80份。

本发明的进一步目的，是提供了一种制备红景天苷嵌段共聚物脂质纳米粒的方法，包括如下步骤：

(1)取上述嵌段聚合物、磷脂和胆固醇，溶于适量有机溶剂溶液中，加入红景天苷，超声混匀；

(2)探头超声，形成油包水初乳(W/O)；

(3)再加入3～8倍体积的表面活性剂溶液，探头超声，形成复乳(W/O/W)，在约30～45℃下旋转蒸发挥去有机溶剂，即得。

作为具体的实施方案之一，嵌段聚合物采用有机溶剂溶解，使嵌段聚合物的浓度为5～100mg/ml；

优选地，有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯以及上述三者与丙酮的混合液。

进一步优选地，水相/二氯甲烷体积比为1/4～1/10，油相/外水相为1/4～1/10。

作为本发明的具体实施方案之一，制备本发明的红景天苷纳米粒采用W/O/W复乳法制备，常用的表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)、泊洛沙姆188(F68)、维生素E1000聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。

现有技术中，虽然存在采用磷脂、胆固醇和嵌段聚合物制备的制剂的技术方案，例如CN1326525A(10-羟基喜树碱长循环脂质体及其冻干制剂)：虽然也用了脂质和PEG-PLGA，但其采用薄膜法，该方法最终形成的是一个表面由PEG-PLGA修饰了的脂质体：即PLGA潜入脂质体结构中，而PEG暴露在脂质体表面。

本申请采用的是复乳法，制成的脂质纳米粒是有核膜结构形成：即内核为PEG-PLGA等嵌段聚合物包载红景天苷形成的纳米球，外部被脂质体双层膜包覆(见说明书附图的脂质纳米粒的结构)。本申请的制备工艺、成型原理及最终形成的产品结构与CN1326525A截然不同，因此，此制备工艺才能用于水溶性极高的红景天苷的高效包载。

CN101836961A(复合载药微球、盐酸米诺环素纳米缓释复合载药微球体系及其制备方法)：虽然也是形成的由PLGA为核，脂质为外壳的结构，但是存在多个技术问题未解决：1)该法首先制得载药PLGA微球，冻干以后再次复溶，再采用薄膜分散法在微球外层修饰脂质体，该方法不仅制备工艺复杂，且存在微球冻干及复溶过程中的稳定性差的问题，并且该法所制备的微球粒径较大，且该方法不适于用来包载水溶性极高的药物；而本申请采用复乳法，一次性制备出脂质纳米粒，方法简便，产物稳定，且粒径较小；2)CN101836961A的终产物微球表面带正电荷，静脉注射会导致血管内壁静电吸附，带来过敏等副作用，甚至会引起休克等严重不良反应，而本申请制备的产物不带正电荷，不存在此种安全隐患，具有更好的临床应用前景。

CN.1733298A(血红蛋白为基础的微囊型血液代用品及其制备方法)：制备的微囊结构是脂质体与PEG-PLGA等聚合物混合作为外壳、大分子量的蛋白和酶作为芯材。尽管该微囊所用载体材料与本申请的相近，但从该微囊的透射照片可见其结构与本申请所制备的脂质纳米粒的双层结构截然不同，该微囊的制备工艺不适于高效包载水溶性极高的小分子药物。本申请制备的脂质纳米粒是用嵌段共聚物包载药物形成内核，脂质作为外壳的双层结构，内核中的PEG主要是提高材料的亲水性，增加水溶性药物与材料的相互作用，脂质体包裹以后，可进一步防止泄露，从而提高包封率。且CN.1733298A中的微囊制备工艺较为复杂，在复乳制备以后尚需分散在含有聚乙烯醇或明胶的溶液中，不利于质量控制。另外，CN.1733298A中的微囊采用聚乙烯醇或明胶硬化表面，该种表面不利于与肿瘤细胞的亲和；而本申请中的脂质纳米粒采用具有天然类细胞膜结构的脂质为外壳，具有极好的细胞亲和性与组织相容性，易于被肿瘤细胞内化，从而发挥更高的抗癌效力。

本发明有益效果

1、红景天苷是中药提取物，本发明的上述制备方法可以应用于载小分子中药提取物或水溶性药物的PLGA嵌段共聚物的制备。

2、本发明制备的载红景天苷的PLGA嵌段共聚物脂质纳米粒，表面光滑圆整，无粘连，粒径在100～300nm，粒度分布均匀，适合静脉注射，能有效到达肿瘤生长部位。

3、使用PLGA嵌段共聚物脂质纳米粒作为载体材料，包封率较高，可达到70～90％，使得转载药物的能力增强，载药量高。

4、缓释效果好，采用W/O/W复乳法制备的载红景天苷的PLGA、PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA脂质纳米粒在体外条件下可缓释1天以上，能够稳定的释放药物。

5、该方法制备的PLGA、PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物脂质纳米粒能缓慢的释放药物，同时可促进肿瘤细胞的内吞，更有利于红景天苷发挥其抗癌作用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1红景天苷-PLGA脂质纳米粒的扫描电镜图。

图2红景天苷-PEG-PLGA脂质纳米粒的扫描电镜图。

图3红景天苷-PLGA-PEG-PLGA脂质纳米粒的扫描电镜图。

图4红景天苷脂质纳米粒的实施例和及对比例样品的体外释放曲线。

图5红景天苷脂质纳米粒的实施例和对比例样品对小鼠乳腺癌4T1细胞的体外生长抑制活性。

图6红景天苷脂质纳米粒的实施例和对比例样品对人乳腺癌MCF-7细胞的体外生长抑制活性。

图7红景天苷脂质纳米粒的实施例和对比例样品对小鼠黑色素瘤B16细胞的体外生长抑制活性。

图8红景天苷脂质纳米粒的实施例和对比例样品对人黑色素瘤A375细胞的体外生长抑制活性。

图9红景天苷脂质纳米粒的实施例和对比例样品对人肺癌A549细胞的体外生长抑制活性。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

一、红景天苷脂质纳米粒的粒径测定

采用激光散射粒径分析仪或透射电子显微镜测定或观察红景天苷脂质纳米粒的粒径。取红景天苷脂质纳米粒胶体溶液用纯化水稀释100倍，于25℃用激光散射粒径分析仪测定(Zetsizer Nano ZS90)，重复测定三次，记录粒径均值。将红景天苷脂质纳米粒胶体溶液稀释5倍以后，滴在铜网上，2％磷钨酸钠染色后，HITACHI H-600透射电子显微镜观察粒子形态。

二、红景天苷脂质纳米粒的包封率测定

采用离心法测定红景天苷脂质纳米粒的包封率。取红景天苷-PLGA脂质纳米粒胶体溶液，4℃条件下超速冷冻离心1h(离心机转速45000rpm)，得纳米粒沉淀。取纳米粒沉淀，加一定量DMSO消解至澄明，离心，取上清液20μl注入HPLC，用甲醇-水(25∶75，v/v)作为流动相，流速为1ml/min，柱温为30℃，检查波长为278nm，采用外标法计算红景天苷的浓度。并按下式计算包封率：

包封率(％)＝纳米粒沉淀中的红景天苷量/红景天苷的投料量×100％。

三、红景天苷脂质纳米粒的缓释特性测定

采用体外释放试验研究红景天苷脂质纳米粒的缓释特性。依据中国药典，分别配制pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，并以此作为游离红景天苷和红景天苷脂质纳米粒的体外释放试验的介质。取红景天苷游离药物水溶液或红景天苷脂质纳米粒胶体溶液，转入经纯化水浸泡煮沸处理过的透析袋中，将透析袋两端扎紧，悬置于盛有10ml不同pH PBS的具塞锥形瓶中，保持漏槽状态，37±1℃恒速振荡(70r/min)。定时取样0.5ml，同时补加相同体积的PBS。HPLC测定，计算累积释药百分率，绘制红景天苷的体外释药曲线。

四、红景天苷脂质纳米粒对肿瘤细胞体外生长抑制活性的测定

通过体外细胞毒实验考察红景天苷脂质纳米粒对多种肿瘤细胞的体外生长抑制活性。

于-150℃冰箱取出肿瘤细胞，37℃水浴迅速解冻，转入离心管中，加RPMI-1640培养液10ml，1500rpm离心洗涤两次。然后转入培养瓶中，加入含青链霉素和10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃，5％CO2的孵箱中培养，细胞密度达70～80％时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化，收集对数生长期的细胞，制成适宜浓度的细胞悬液，取100μl接种于96孔培养板中，培养24h，细胞贴壁后，分成多个试验组。加入游离红景天苷和红景天苷脂质纳米粒，每个试验点设置6个复孔。37℃、5％CO2培育一定时间后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl继续培养4h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，置振荡器振荡10min后，于酶标仪测定570nm波长处的吸光值(A)。每株细胞重复试验三次。按下式计算细胞抑制率。

实施例1

取PLGA20mg、大豆磷脂0.25mg和胆固醇0.25mg溶于2ml二氯甲烷中，超声溶解。加入含有2.5mg/ml红景天苷的内水相200μl，探头超声处理2分钟。再加入1％PVA溶液8ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为138nm，包封率为81％。透射电镜照片见附图1。

实施例2

取PEG-PLGA 50mg、DOPC 0.5mg和胆固醇0.25mg溶于2ml二氯甲烷中，超声溶解。加入含有2.5mg/ml红景天苷的内水相200μl，探头超声处理2分钟。再加入1％PVA溶液16ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为115nm，包封率为89％。透射电镜照片见附图2。

实施例3

取PLGA-PEG-PLGA 80mg、卵磷脂5mg和胆固醇1mg溶于1ml氯仿中，超声溶解。加入含有25mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入1％ TPGS溶液20ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷-PLGA-PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为148nm，包封率为84％。透射电镜照片见附图3。

实施例4

取PEG-PLGA 100mg、DOPE 1mg和胆固醇0.5mg溶于1ml乙酸乙酯中，超声溶解。加入含有40mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入3％ F68溶液10ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为258nm，包封率为71％。

实施例5

取PLGA 10mg、DOTAP 1mg和胆固醇0.25mg溶于2ml乙酸乙酯中，超声溶解。加入含有2.5mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入1％ TPGS溶液10ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为168nm，包封率为70％。

实施例6

取PLGA 20mg、DSPE 2mg和胆固醇1mg溶于1ml氯仿中，超声溶解。加入含有2.5mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入0.5％ PVA溶液10ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为159nm，包封率为78％。

实施例7

取PLGA-PEG-PLGA40mg、大豆磷脂4mg和胆固醇2mg溶于1ml二氯甲烷中，超声溶解。加入含有25mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入1％PVA溶液20ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷-PLGA-PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为139nm，包封率为77％。

实施例8

取PLGA-PEG-PLGA 50mg、卵磷脂10mg和胆固醇2mg溶于2ml乙酸乙酯中，超声溶解。加入含有25mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入1％ F68溶液20ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷-PLGA-PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为118nm，包封率为75％。

实施例9

取PEG-PLGA 100mg、大豆磷脂20mg和胆固醇5mg溶于2ml氯仿中，超声溶解。加入含有2.5mg/ml红景天苷的内水相200μl，探头超声处理2分钟。再加入4％PVA溶液12ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为108nm，包封率为82％。

实施例10

取PLGA-PEG-PLGA20mg、大豆磷脂1mg和胆固醇0.25mg溶于1ml二氯甲烷中，超声溶解。加入含有2.5mg/ml红景天苷的内水相250μl，探头超声处理2分钟。再加入2％PVA溶液5ml，探头超声处理5分钟。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得红景天苷-PLGA-PEG-PLGA脂质纳米粒胶体溶液。平均粒径为135nm，包封率为78％。

对比例制备

对比例1

采用CN1326525A的实施例3的工艺制备红景天苷长循环脂质体。

对比例2

采用CN101836961A的实施例1的工艺制备红景天苷缓释复合载药微球。

对比例3

采用CN.1733298A的实施例2的工艺制备红景天苷微囊。

I、实施例1-3和对比例1-3的包封率与粒径的比较

分别采用离心法和激光散射粒径分析仪测定实施例1-3制备的红景天苷脂质纳米粒和对比例1-3样品的包封率与粒径，结果见下表：

由上表可见，实施例1-3所制备的红景天苷脂质纳米粒包封率较高，均达80％以上，且粒径小；而对比例1-3包封率较低，在50％～70％之间，且粒径较大。

II、实施例1-3和对比例1-3的缓释性质的比较

分别采用体外释放试验考察实施例1-3制备的红景天苷脂质纳米粒和对比例1-3样品的体外释放特性，结果见附图4。

由附图4可见，按照实施例1-3制备的红景天苷脂质纳米粒具有良好的缓释性能；对比例1与对比例3几乎无缓释性。而采用CN101836961A工艺制备的对比例2虽然有较好的缓释性，但是释药速率过低，60h尚不能释药达50％，这将导致给药后血药浓度过低，因而不适用于需要全身给药的抗肿瘤治疗，仅可进行局部外用给药，这是因为CN101836961A所设计的是用于牙周袋局部低浓度抗菌的外用剂型。

III、实施例1-3和对比例1-3对多种肿瘤细胞的体外生长抑制活性的 比较

分别采用体外细胞毒实验考察实施例1-3制备的红景天苷脂质纳米粒和对比例1-3样品对小鼠乳腺癌4T1细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞、人黑色素瘤A375细胞、人肺癌A549细胞的体外生长抑制活性，结果见附图5-9。

Claims (6)

1.一种红景天苷嵌段聚合物脂质纳米粒制剂，其特征在于主要由磷脂、胆固醇以及嵌段聚合物通过采用W／O／W复乳法制成；基于重量份计，红景天苷0.5～10份，磷脂0.25～20份，胆固醇0.25～5份，嵌段聚合物20～100份； 

所述嵌段聚合物选自PLGA及其衍生物，所述PLGA衍生物选自PEG-PLGA或PLGA-PEG-PLGA； 

所述磷脂选自大豆磷脂、卵磷脂、二油酰基卵磷脂、DOPE、DOTAP、DSPE。 

2.根据权利要求1所述的红景天苷嵌段聚合物脂质纳米粒制剂，其特征在于基于重量份计，红景天苷0.5～6.25份，磷脂0.25～10份，胆固醇0.25～2份，嵌段聚合物20～80份。 

3.一种制备权利要求1所述红景天苷嵌段聚合物脂质纳米粒制剂的方法，其特征在于包括如下步骤： 

(1)取上述嵌段聚合物、磷脂和胆固醇，溶于适量有机溶剂溶液中，加入红景天苷，超声混匀； 

(2)探头超声，形成油包水初乳W／O； 

(3)再加入3～8倍体积的表面活性剂溶液，探头超声，形成复乳W／O／W，在30～45℃下旋转蒸发挥去有机溶剂，即得。 

4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯以及上述三者与丙酮的混合液。 

5.根据权利要求3的方法，其特征在于所述表面活性剂为聚乙烯醇、泊洛沙姆188或维生素E1000聚乙二醇琥珀酸酯。 

6.权利要求书1所述的红景天苷嵌段聚合物脂质纳米粒制剂在制备静脉注射的红景天苷的缓释制剂中的用途。 

Images