CN102695520A - 调节间隙压力与溶瘤病毒的递送和分布 - Google Patents

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Abstract

本文中提供在受试者中治疗增生性疾病的方法，该方法包括在受试者中降低间隙压力和/或增加血管渗透性，以及向所述受试者施用溶瘤病毒。这些方法改善了溶瘤病毒的递送和分布。

Description

调节间隙压力与溶瘤病毒的递送和分布
背景技术
尽管其是大分子并且依赖于溶剂牵引来帮助有效递送，但是溶瘤病毒治疗在下列方面的意义上是独特的：这些试剂能够在肿瘤靶中自身复制并传播，溶胞靶细胞，释放子代并重新靶向邻近的细胞。因此，溶瘤病毒减轻对用于在整个肿瘤团块中递送的传送的总依赖性。 
发明内容
本文中提供在受试者中治疗增生性疾病的方法，该方法包括在受试者中降低间隙压力和/或增加血管渗透性，以及向受试者施用溶瘤病毒。这些方法改善了溶瘤病毒的递送和分布。 
一个或多个方面的细节将在下面的附图和描述中给出。其他特征、目的和优点将从说明书、附图、以及权利要求书中清楚看出。 
附图简述 
图1A、1B和1C是示出呼肠孤病毒和雷帕霉素在体外对于B16.F10细胞的效果的图。将细胞(5x103/孔)接种到96孔板中并且允许贴壁过夜。将培养基用雷帕霉素和/或呼肠孤病毒的两倍稀释液代替，分别对应于之前测定的ED50的2、1、0.5和0.25倍，在新鲜培养基中稀释，持续温育48h。然后除去培养基，并使用MTS测试法来测定相对于未处理的细胞的细胞存活百分率。 
图2A和2B是示出呼肠孤病毒和雷帕霉素在体内协同作用的图。将B16.F10肿瘤皮下接种到C57Bl/6鼠中，并且单独或联合在第1天和第4天瘤内呼肠孤病毒T3D 5x 108TCID50处理、以及在第1、4、8和12天腹腔内雷帕霉素5mg/kg处理，或对照处理(瘤内PBS，腹腔内PBS)。图2A是示出在C57Bl/g用呼肠孤病毒和雷帕霉素处理的鼠中B16.F10肿瘤的平均肿瘤直径的图。图2B是示出C57Bl/g用呼肠孤病毒和雷帕霉素处理的具有B16.F10肿瘤的鼠的存活数据的图。 
图3是示出Treg缺失+IL-2增强呼肠孤病毒系统地递送至皮下肿瘤的图。使C57Bl/6鼠接种皮下B16肿瘤。9天后，使鼠接受腹腔内注射抗CD25抗体PC-61或对照IgG。24小时后，使鼠腹腔内注射PBS或以75,000单位/注射的剂量腹腔内注射重组人IL-2，一天三次，共3天。在第4天，给予单次另外注射IL-2。在该最后注射IL-2/PBS两小时后，使鼠接受静脉注射呼肠孤病毒(3.75x109TCID50)，24h小时后进行又一次类似的病毒注射。72h后，将肿瘤外植和解离，并且测定从所示处理的鼠(3只鼠/组)的肿瘤的冻融裂解物中回收的病毒滴度。 
图4A和4B是示出CPA-介导的Treg修饰(IL-2和低剂量呼肠孤病毒)针对建立的肿瘤有治疗性的图。对于图4A，使C57Bl/6鼠接种皮下B16肿瘤。9天后，使鼠接受腹腔内注射CPA(100mg/kg)或者抗CD25抗体PC-61或PBS。24小时后，使鼠腹腔内注射PBS或以75,000单位/注射的剂量腹腔内注射重组人IL-2，一天三次，共3天。在第4天，给予单次另外注射IL-2。在该最后注射IL-2/PBS两小时后，使鼠接受静脉注射呼肠孤病毒(以低于最大可实现的剂量1x108 TCID50的剂量)，24h小时后进行又一次类似的病毒注射。示出在肿瘤接种后随时间变化的鼠的存活(肿瘤的任何直径＜1.0cm)(n＝7/组)。只用呼肠孤病毒处理(半数存活时间21d)、CPA/IL-2(23d)处理、PC-61/呼肠孤病毒(22d)处理或CPA/呼肠孤病毒(21d)处理的组的半数存活时间彼此之间没有显著性差异，并且这些处理中没有一个产生任何长期存活者。用IL-2/呼肠孤病毒(25d)、PC-61/IL-2/呼肠孤病毒(24d)或CPA/IL-2/呼肠孤病毒(25d)处理的组的半数存活时间比那些其他组的半数存活时间明显更长(P＝0.04)。用PC-61/IL-2/呼肠孤病毒或CPA/IL-2/呼肠孤病毒处理导致产生长期存活者，并且这两种情况明显更具有治疗性**，P＜0.01。图4B是示出在如图4A中所示最后病毒注射鼠7至10天后，针对从鼠回收的血清中的呼肠孤病毒的中和抗体的图。 
发明详述 
用于治疗肿瘤形成的大的生物试剂可能受到瘤内间隙压力和/或降低的血管渗透性的限制。另外，扩散看起来是小分子(即，MW 4000Da)在组织中被动运输的最重要的模式，而传送或溶剂牵引典型地是大蛋白(MW＞40,000Da)运动的主要机理。 
肿瘤团块内的间隙压力可源自增加的毛细血管压力(MVP)，其依赖于动静脉压力差与对血流的几何学和粘性抗性(即，血管直径减小的结果，其是由于实体瘤的生长而减小血管直径、从而导致产生在血管上的物理应力的函数)。同样地，瘤内环境是导致 增加的间隙压力和/或降低的血管渗透性的环境，并且可抑制大分子的递送。 
降低肿瘤中静水压力的试剂产生这样的情况，其中肿瘤团块外的静水压力将大于肿瘤本身的静水压力。该情况有助于大分子(例如溶瘤病毒)的递送。因此，本文中提供在受试者中治疗增生性疾病的方法，该方法包括在需要治疗的受试者中降低间隙压力和/或增加血管渗透性，以及向需要治疗的受试者施用溶瘤病毒。任选地，在受试者中降低间隙压力和/或增加血管渗透性的同时、之前或之后施用溶瘤病毒。 
任选地，受试者中的间隙压力通过降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂而降低。因此，任选地，降低间隙压力的试剂也增加血管渗透性。可选择地，降低间隙压力的试剂可和增加血管渗透性的试剂联合使用。 
适用于提供的方法中的试剂包括紫杉烷。在提供的方法中使用的合适的紫杉烷包括但不限于taxol(紫杉醇)、莱龙泰素(larotaxel)和taxotere(多西他赛)。其他试剂包括但不限于：加压素；TNF；白细胞间介素-1(IL-1)；干扰素-(IFN-K)；P物质；蛋白酶抑制剂，例如N-α-甲苯磺酰基-L-赖氨酰基-氯甲酮(TLCK)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)和亮抑酶肽；血管内皮生长因子(VEGF)；硝化甘油；5-羟色胺；血浆激肽，例如缓激肽；血小板激活因子(PAF)；前列腺素E1(PGE1)；组织胺；伊马替尼；封闭带毒素(ZOT)；白细胞间介素-2；一氧化氮抑制剂，例如L-N-单甲基精氨酸(L-NMMA)和L-N-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)；以及人生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼。至少对于本文中所述的试剂和所述试剂的制备方法与使用方法，参见Martin et al.，Immunology 64(2)：301-5(1988)；Zhou et al.，Radiat.Res.168(3)：299-307(2007)；Watanabe et al.，Inflammation Research 17(5-6)：472-79(1986)；美国公开No.2005/0101559；Moasser et al.，J.Magn.Reson.Imaging 26(6)：1618-25(2007)；和Vlahovic et al.，Br.J.Cancer 97(6)：735-40(2007)，其全部通过引用的方式并入本文中。 
任选地，受试者中的间隙压力通过降低细胞外钙离子浓度而降低。低的细胞外钙离子浓度条件也可以用于增强血管渗透性。例如，低钙离子浓度流体可灌流通过施用溶瘤病毒的组织的脉管系统。合适的灌流物的钙离子浓度可为约40或50Tmol/L至约500Tmol/L，更优选为约50Tmol/L至约200Tmol/L。提供约50Tmol/L的灌流物的钙浓度。钙离子(例如Ca2+)浓度还可以通过(例如)使用合适的缓冲剂来降低，例如螯合剂，如乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)或1，2-双-(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)。参见美国公开No.2005/0101559，其全部通过引用的方式并入本文中。因此，本文中提供在受试者中治疗增生性疾病的方法，该方法包 括向受试者施用降低间隙压力的低钙离子浓度流体和溶瘤病毒。任选地，所述方法还包括施用增加血管渗透性的试剂。 
任选地，肿瘤的间隙压力可通过除去过量的间隙液来除去。过量的间隙液的除去通过任何已知的方法来完成，例如包括人工淋巴系统(ALS)。这些方法在(例如)美国公开No.2001/0047152、美国专利No.5,484,399、美国公开No.2005/0165342和美国公开No.2003/0149407中有所描述，其全部通过引用的方式并入本文中。因此，本文中提供在受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括在受试者中降低肿瘤的过量的间隙液，以及向受试者施用溶瘤病毒。任选地，在施用溶瘤病毒之前除去过量的间隙液。任选地，所述方法还包括施用增加血管渗透性的试剂。 
如果系统地施用溶瘤病毒，渗透性光动力学治疗(P-PDT)可用于通过增强血管渗透性而增强溶瘤病毒的递送。P-PDT诱导的血管渗漏允许治疗剂离开脉管系统，并且以比不使用现有的渗透性PDT而获得的浓度更高的浓度分布到过度增生性组织(例如瘤床)中。参见美国公开No.2004/0010218，其全部通过引用的方式并入本文中。因此，本文中提供在受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用渗透性光动力学治疗剂和溶瘤病毒。任选地，渗透性光动力学治疗剂在施用溶瘤病毒之前施用。任选地，该方法还包括施用降低间隙压力的试剂。 
任选地，提供的方法还包括向受试者施用免疫抑制剂。任选地，免疫抑制剂是抑制促炎细胞因子的试剂。如本文中所使用的，促炎细胞因子是指直接或间接刺激免疫系统的细胞因子。促炎细胞因子包括但不限于IL-lI、IL-3、IL-6、IL-12 p70、IL-17、MIP-lI和RANTES。因此，本文中提供在受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用降低间隙压力的试剂、抑制促炎细胞因子的试剂和溶瘤病毒。任选地，首先向受试者施用降低间隙压力的试剂，接着施用抑制促炎细胞因子的试剂和溶瘤病毒。任选地，在抑制促炎细胞因子的试剂之后施用溶瘤病毒。任选地，抑制促炎细胞因子的试剂抑制促炎细胞因子的表达或活性。任选地，所述试剂阻断T-细胞应答，同时对于B-细胞活性具有很小或没有影响。因此，所述试剂抑制促炎细胞因子，但不抑制或最低程度地抑制NARA的产生。任选地，所述试剂是铂化合物。合适的铂化合物也包括但不限于顺铂、卡铂、metaplatin和奥沙利铂。任选地，降低间隙压力的试剂是紫杉醇，抑制促炎细胞因子的试剂是卡铂，并且溶瘤病毒是呼肠孤病毒。 
抑制促炎细胞因子的其他试剂包括但不限于：TNF-I抗体，例如英夫利西单抗、CDP571、CDP870和阿达木单抗；重组人可溶性p55TNF受体，例如奥那西普；可溶 性TNF受体和Fc片段融合蛋白，例如依那西普；聚乙二醇化TNF的人源化抗体的Fab片段，例如赛妥珠单抗；IL-2受体的抗I链的嵌合抗体，例如巴利昔单抗或达利珠单抗；IL-12p40抗体，例如ABT-874；IL-6受体抗体，例如MRA或托珠单抗；IFN-K抗体，例如芳妥珠单抗；抑制IL-1结合至IL-1受体的抗体，例如AMG108；抑制细胞因子释放的半胱天冬酶-1抑制剂，例如diarylsulphonylurene；IL-15抗体，例如美泊珠单抗；IL-8抗体，例如ABX-IL-8；IL-9抗体，包括IL-9单克隆抗体；重组人IL-21，也称为494C10；TNF-I、IL-1 
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、IL-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达的抑制剂，例如biophylum sensitivum；抑制促炎细胞因子表达的NF-PB信号阻断剂，例如辛伐他汀；以及IL-6表达和NF-PB激活的抑制剂，例如(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)。 
抑制促炎细胞因子的其他试剂包括人重组乳铁蛋白，其抑制促炎细胞因子和促转移细胞因子(包括IL-6、IL-8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和TNF-α)的细胞释放。树突细胞衍生的IL-12和IL-18的抑制剂(例如雷帕霉素和sanglifehrin)也适用于所提供的方法中。雷帕霉素是抑制T细胞mTOR激酶激活的免疫抑制剂，并且Sanglifehrin A是也抑制IL-2依赖性T-细胞增生的亲环蛋白-结合免疫抑制剂。食用芦丁(dietary rutin)也适用于所提供的方法中，其抑制促炎细胞因子(例如IL-1β、IL-6和GM-CS)的诱导。 
任选地，提供的方法还包括选择患有增生性疾病的受试者的步骤。因此，提供在受试者中治疗增生性疾病的方法，该方法包括选择患有增生性疾病的受试者，向需要治疗的受试者施用降低间隙压力的试剂和溶瘤病毒。任选地，增生性疾病是ras-介导的增生性疾病。因此，任选地，提供的方法还包括选择患有ras-介导的增生性疾病的受试者的步骤。任选地，增生性疾病是特征为干扰素-抗性、p53-缺乏或Rb-缺乏的增生性疾病。 
任选地，受试者需要增强溶瘤病毒的递送。因此，本文中提供向患有增生性疾病的受试者增强溶瘤病毒的递送的方法，该方法包括向受试者施用降低间隙压力的试剂和向受试者施用溶瘤病毒。这些方法还可包括选择患有增生性疾病的受试者的步骤。 
任选地，提供的方法还包括下列步骤：例如通过确定增生性疾病是否是ras-介导的增生性疾病来诊断增生性疾病的显型。通过另外的例子的方式提供这样的方法，该方法包括确定增生性疾病是否是干扰素抗性肿瘤、p53缺乏肿瘤或Rb缺乏肿瘤的步骤。确定增生性疾病是否具有某些显型的方法是已知的，例如参见美国专利No.7,306,902，其全部通过引用的方式并入本文中。 
能够用于实施所提供的方法的溶瘤病毒包括但不限于肌尾噬菌体科、长尾噬菌体 科、短尾噬菌体科、复层噬菌体科、覆盖噬菌体科、芽生噬菌体科、脂毛噬菌体科、微小纺锤形噬菌体科、痘病毒科、虹彩病毒科、藻类DNA病毒科、杆状病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、乳多空病毒科、多分体DNA病毒科、丝状噬菌体科、微小噬菌体科、双生病毒科、圆环病毒科、细小病毒科、嗜肝DNA病毒科、逆转录病毒科、囊状噬菌体科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、副粘液病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘液病毒科、布尼安病毒科、沙粒病毒科、光滑噬菌体科、小RNA病毒科、伴生病毒科、豇豆花叶病毒科、马铃薯Y病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、野田病毒科、四病毒科、番茄丛矮病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科和杆状RNA病毒科家族中成员的溶瘤病毒。这些和其他溶瘤病毒的免疫保护病毒、和重配或重组病毒也包括在所提供的方法中。此外，至少两种溶瘤病毒的组合也同样可以用于实施所提供的方法。一些溶瘤病毒在后面有所讨论，并且本领域普通技术人员也可以根据本文中公开的和本领域可获知的知识来使用另外的溶瘤病毒实施本发明的方法。 
通常，当病毒进入细胞时，双链RNA激酶(PKR)被激活并阻断蛋白合成，病毒不能够在此细胞中进行复制。一些病毒已经生成了系统来抑制PKR，从而有助于病毒蛋白合成和病毒复制。例如，腺病毒产生大量的小RNA-VA1 RNA。VA1 RNA具有广泛的二级结构，与通常情况下激活PKR的双链RNA(dsRNA)相竞争结合PKR。由于其需要最小长度的dsRNA来激活PKR，因此VA1 RNA不会激活PKR。相反，VA1 RNA能够依赖其量多的特征来隔离PKR。因此，蛋白合成不会被阻断，并且腺病毒可以在细胞内进行复制。 
Ras-激活的瘤细胞不会由于PKR而受到蛋白合成的抑制，因为ras使PKR失活。因此这些细胞容易被病毒感染，即使病毒不具有PKR-抑制系统。因此，如果在腺病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒或副痘病毒属羊口疮病毒(parapoxvirus orf virus)中PKR抑制剂突变，以至于再也不能够阻断PKR的功能，那么所得病毒就会由于PKR抑制蛋白合成而无法感染正常细胞，但是它们可以在缺乏PKR活性的ras-激活的瘤细胞中进行复制。通过例子的方式，呼肠孤病毒选择性地复制和溶胞ras-激活的瘤细胞。 
因此，经过修饰或突变使得不会抑制PKR功能的病毒选择性地在ras-激活的瘤细胞中进行复制，而正常细胞是抵抗性的。优选地，溶瘤病毒为在VA1区域有突变的腺病毒、在K3L和/或E3L区域有突变的牛痘病毒、在胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因中有突变的牛痘病毒、在牛痘生长因子(VGF)基因中有突变的牛痘病毒、在γ134.5基因中有突变的疱疹病毒、在OV20.0L基因中有突变的副痘病毒属羊口疮病毒、或在NS-1 基因中有突变的流感病毒。 
在病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因中有突变的牛痘病毒不能制备DNA复制所需要的核苷酸。在正常的细胞中，细胞TK水平通常非常低，并且病毒不能复制。在肿瘤中，肿瘤抑制剂Rb的损失或细胞周期蛋白活性的增加导致E2F途径激活和高水平的TK表达。因此，癌细胞具有高的TK水平，并且突变的牛痘病毒可以复制和扩散。 
牛痘生长因子(VGF)基因是哺乳动物表皮生长因子(EGF)的同系物，并且可结合和激活EGF受体(EGFR)。在VGF基因中有突变的牛痘病毒对于具有激活的EGF途径的细胞是生长抑制的，其在癌症中通常是突变的。 
根据已知的病毒PKR抑制剂的结构-功能关系，病毒可以被修饰或突变。例如，由于E3蛋白的氨基酸末端区域与PKR的羧基-末端区域的结构域相互作用，因此这个结构域的缺失或点突变会阻止抗PKR功能(Chang et al.，PNAS 89：4825-4829(1992)；Chang，H.W.et al.，Virology 194：537-547(1993)；Chang et al.，J.Virol.69：6605-6608(1995)；Sharp et al.，Virol.250：301-315(1998)；和Romano et al.，Mol.and Cell.Bio.18：7304-7316(1998))。牛痘病毒的K3L基因编码pK3，pK3是PKR的伪底物(pseudosubstrate)。与eIF-2的79至83残基同源的K3L蛋白的C-末端部分的截短或点突变破坏了PKR的抑制活性(Kawagishi-Kobayashi，M.，et al.，Mol.Cell.Biology 17：4146-4158(1997))。 
另一个例子是Delta24病毒，它是在E1A区域携带24个碱基对的缺失的突变腺病毒(Fueyo，J.，et al.，Oncogene 19(1)：2-12(2000))。这个区域负责与细胞的肿瘤抑制剂Rb结合以及抑制Rb功能，从而允许细胞的增殖机能以及因此允许病毒的复制，进而以非控制的形式进行。Delta24在Rb结合区域有缺失，并且不能与Rb相结合。因此，在正常细胞内，突变病毒的复制被Rb抑制。然而，如果Rb失活并且细胞变成瘤细胞，Delta24将不再被抑制。相反，突变病毒高效地进行复制以及溶胞Rb缺陷性细胞。 
另外，水泡性口炎病毒(VSV)选择性地杀死瘤细胞(并且可加入干扰素)。核糖核苷酸还原酶表达有缺陷的单纯疱疹病毒1(HSV-1)的突变体hrR3在结肠癌细胞中进行复制，但是不能在正常的肝细胞内进行复制(Yoon，S.S.，et al.，FASEB J.14：301-311(2000))。新城疫病毒(NDV)优选在恶性细胞内进行复制，最常使用的株为73-T(Reichard，K.W.，et al.，J.of Surgical Research 52：448-453(1992)；Zorn，U.et al.，Cancer Biotherapy 9(3)：22-235(1994)；Bar-Eli，N.，et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.122：409-415(1996))。牛痘病毒在一些恶性肿瘤细胞系中可以进行传播。脑炎病毒在小鼠肉 瘤肿瘤中具有溶瘤作用，但是为了减少其在正常细胞中的传染性，可要求减少其剂量。已经描述了在感染带状疱疹、肝炎病毒、流感、水痘和麻疹病毒的肿瘤患者中出现肿瘤的退化(评论参见Nemunaitis，J.，Invest.New Drugs 17：375-386(1999))。 
任选地，溶瘤病毒是呼肠孤病毒。呼肠孤病毒是指任何被分类于呼肠孤病毒属的病毒，不管是天然产生的、经修饰过的或者是重组的。呼肠孤病毒是具有分节段的双链RNA基因组的病毒。病毒粒子的直径为60-80nm，并具有两个同心的、均为20面体的衣壳外壳。基因组包括10-12个离散节段的双链RNA，总的基因组大小为16-27kbp。每个RNA节段的大小不同。三个独特的、但是相关的呼肠孤病毒类型在许多物种中被发现。所有三种类型都共享共同的补体固定抗原。
人类呼肠孤病毒三种血清型：类型1(Lang株或T1L)、类型2(Jones株，T2J)以及类型3(Dearing株或Abney株，T3D)。基于中和及血凝抑制试验，可以容易地识别这三种血清型。根据本公开的呼肠孤病毒可以是类型3哺乳动物正呼肠孤病毒。类型3哺乳动物正呼肠孤病毒包括但不限于Dearing株和Abney株(分别为T3D或T3A)。例如参见ATCC登陆No.VR-232和VR-824。如上所述，呼肠孤病毒使用宿主细胞的ras途径机能来下调双链RNA-激活的蛋白激酶(PKR)，以及因此在细胞中的复制。例如参见美国专利No.6,110,461、6,136,307、6,261,555、6,344,195、6,576,234和6,811,775，其全部通过引用的方式并入本文中。 
呼肠孤病毒可以为天然产生的或修饰的。当呼肠孤病毒可以从天然来源中分离出来、并且没有在实验室中被人类有意地进行修饰时，其是天然产生的。例如，呼肠孤病毒可以来源于野生来源(field source)，即来源于感染呼肠孤病毒的人类。呼肠孤病毒还可以被选择或者被诱变以提高溶瘤活性。 
呼肠孤病毒可以被修饰，但是仍然能够可胞解地感染具有活性ras途径的哺乳动物细胞。在施用至增殖细胞之前，可以对呼肠孤病毒进行化学或生物化学预处理(例如使用蛋白酶进行处理，例如使用胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)。使用蛋白酶进行的预处理除去病毒的外层或衣壳，并且可能增加病毒的感染性。呼肠孤病毒可以被包裹在脂质体或微团(micelle)中(Chandran and Niben，J.of Virology 72(1)：467-751998)。例如，可以在存在形成微团浓度的烷基硫酸盐去垢剂时使用胰凝乳蛋白酶处理病毒粒子，从而产生新的传染性亚病毒颗粒(ISVP)。 
呼肠孤病毒可以是重组呼肠孤病毒。例如重组呼肠孤病毒可以是重配呼肠孤病毒，其包括来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段。呼肠孤病毒基因 组节段的重组/重配可以发生在宿主生物体被至少两种遗传上不同的呼肠孤病毒感染之后。重组/重配病毒还可以在细胞培养基中产生，例如，通过以遗传上不同的呼肠孤病毒同时感染批准的宿主细胞。因此，提供的方法包括使用通过对来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段重配而形成的重组呼肠孤病毒，所述呼肠孤病毒包括但不限于人类呼肠孤病毒，例如类型1(例如Lang株)、类型2(例如Jones株)和类型3(例如Dearing株或Abney株)，非人类哺乳动物呼肠孤病毒，或禽类呼肠孤病毒。任选地，提供的方法包括使用通过对来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段重配而形成的重组呼肠孤病毒，其中至少一种亲本病毒是遗传上改造的，包含一个或多个化学合成的基因组节段，经化学或物理诱变剂处理过，或者本身是重组事件的结果。任选地，提供的方法包括使用在化学诱变剂的存在下或者在物理诱导剂的存在下发生重组的重组呼肠孤病毒，该化学诱变剂包括但不限于硫酸二甲酯和澳化乙锭，该物理诱导剂包括但不限于紫外光和其他形式的辐射。 
任选地，提供的方法包括使用这样的呼肠孤病毒，其在一个或多个基因组节段中具有突变，包括插入、替换、缺失或复制。这些突变可包括由于与宿主细胞基因组发生重组所得的额外遗传信息，或可包括合成的基因。例如，如本文中所描述的突变呼肠孤病毒可含有减少或基本上消除sigma3多肽表达的突变或导致不存在功能性sigma3多肽的突变，如U.S.Serial No.12/124,522中所述，其全部通过引用的方式并入本文中。消除sigma3多肽表达的突变或导致不存在功能性sigma3多肽的突变可在编码sigma3多肽的核酸(即，S4基因)中或在编码调节sigma3多肽的表达或功能的多肽的核酸中。 
如本文中所使用的，减少sigma3多肽表达的突变是指和表达呼肠孤病毒的野生型水平的sigma3多肽相比，导致sigma3多肽的量减少至少30％(例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)的突变。如本文中所使用的，基本上消除sigma3多肽表达的突变是指相对于由野生型呼肠孤病毒产生的sigma3多肽的量，导致sigma3多肽的量减少至少95％(例如96％、97％、98％、99％或100％)的突变。如本文中所使用的，导致减少或不存在功能性sigma3多肽的突变是指允许sigma3多肽表达、但导致形成不能够在装配或引入病毒衣壳中的sigma3多肽的突变。应该理解，可期望或需要sigma3多肽保持其他功能(例如结合RNA的能力)，以使突变呼肠孤病毒保持传播的能力。 
如本文中所描述的sigma3多肽中的突变可导致以这样的水平引入衣壳中的sigma3多肽，该水平相对于不合突变的sigma3多肽(例如野生型sigma3多肽)是降低的。如本文中所描述的sigma3多肽中的突变还可导致不能引入病毒衣壳中的sigma3多肽。 不受任何特定机理的束缚，例如由于sigma3多肽和mu1多肽不能合适地结合，或由于减少或抑制sigma3多肽引入衣壳中的构象改变，因此sigma3多肽可已经降低功能或缺少功能。 
除了破坏或减少sigma3多肽的表达或者导致不具有功能或功能降低的sigma3多肽的突变，如本文中所描述的突变呼肠孤病毒还可在其他呼肠孤病毒衣壳多肽(例如mu1、lambda2和/或sigma1)中的一者中含有一个或多个进一步的突变(例如第二、第三或第四突变)。含有影响sigma3多肽的突变、和任选地在其他外衣壳蛋白中的任一者或全部中含有进一步的突变的呼肠孤病毒可以被筛选这种突变呼肠孤病毒感染并引起细胞溶胞的能力。例如，抗野生型呼肠孤病毒溶胞的瘤细胞可用于筛选本文中所述的有效的突变呼肠孤病毒。 
例如，进一步的突变可减少或基本上消除mu1多肽表达，或导致不存在功能性mu1多肽。由M2基因编码的mu1多肽可能涉及细胞渗透，并且可在转录酶激活中发挥作用。各病毒粒子含有约600个mu1多肽的副本，其和sigma3多肽以1∶1复合物的形式存在。mu1多肽在其N-末端上是肉豆蔻酰化的，然后肉豆蔻酰化的N-末端42个残基被切割下来，从而导致C-末端片段(mu1C)。另外或可选择地，进一步的突变可减少或基本上消除lambda2多肽表达，或导致不存在功能性lambda2多肽，和/或进一步的突变可减少或基本上消除sigma1多肽表达，或导致不存在功能性sigma1多肽。由L2基因编码的lambda2多肽涉及颗粒装配，并且表现出鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性。由S1基因编码的sigma1多肽涉及细胞附着，并且起到病毒血凝素的作用。 
例如，呼肠孤病毒具有：具有一个或多个氨基酸修饰的lambda-3多肽；具有一个或多个氨基酸修饰的sigma-3多肽；具有一个或多个氨基酸修饰的mu-1多肽；和/或具有一个或多个氨基酸修饰的mu-2多肽，如U.S.Serial No.12/046,095中所述，其全部通过引用的方式并入本文中。通过例子的方式，lambda-3多肽中的一个或多个氨基酸修饰是残基214处的Val、残基267处的Ala、残基557处的Thr、残基755处的Lys、残基756处的Met、残基926处的Pro、残基963处的Pro、残基979处的Leu、残基1045处的Arg、残基1071处的Val、或其任意组合，其相对于GenBank登陆No.M24734.1进行编号。应该注意，当氨基酸序列是残基214处的Val或残基1071处的Val时，氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列中的至少一个另外的改变。任选地，lambda-3多肽包括SEQ ID NO：18中示出的序列。进一步通过例子的方式，sigma-3多肽中的一个或多个氨基酸修饰是残基14处的Leu、残基198处的Lys、或其任意组合，其相对于 GenBank登陆No.K02739进行编号。应该注意，当氨基酸序列是残基14处的Leu时，氨基酸序列还包括在所述氨基酸序列中的至少一个另外的改变。任选地，sigma-3多肽包括SEQ ID NO：14中示出的序列。进一步通过例子的方式，mu-1多肽中的一个或多个氨基酸修饰是残基73处的Asp，其相对于GenBank登陆No.M20161.1进行编号。任选地，mu-1多肽包括SEQ ID NO：16中示出的序列。还通过例子的方式，mu-2多肽中的氨基酸修饰是残基528处的Ser，其相对于GenBank登陆No.AF461684.1进行编号。任选地，mu-1多肽包括SEQ ID NO：15中示出的序列。如本文中所描述的具有一个或多个修饰的呼肠孤病毒还可包括呼肠孤病毒sigma-2多肽。这种sigma-2多肽在70、127、195、241、255、294、296或340位中的一共或多个具有Cys，其相对于GenBank登陆No.NP 694684.1进行编号。任选地，sigma-2多肽包括SEQ ID NO：12中示出的序列。 
任选地，呼肠孤病毒具有：具有一个或多个核酸修饰的L1基因组节段；具有一个或多个核酸修饰的S4基因组节段；具有一个或多个核酸修饰的M1基因组节段；和/或具有一个或多个核酸修饰的M2基因组节段，如U.S.Serial No.12/046,095中所述，其全部通过引用的方式并入本文中。通过例子的方式，L1基因组节段中的一个或多个核酸修饰是660位的T、817位的G、1687位的A、2283位的G、2284-2286位的ATG、2794位的C、2905位的C、2953位的C、3153位的A、或3231位的G，其相对于GenBank登陆No.M24734.1进行编号。任选地，L1基因组节段包括SEQ ID NO：8中示出的序列。进一步通过例子的方式，S4基因组节段中的一个或多个核酸修饰是74位的A和624位的A，其相对于GenBank登陆No.K02739进行编号。任选地，S4基因组节段包括SEQ ID NO：4中示出的序列。进一步通过例子的方式，M2基因组节段中的核酸修饰可以是248位的C，其相对于GenBank登陆No.M20161.1进行编号。例如，M2基因组节段包括SEQ ID NO：6中示出的序列。还通过例子的方式，M1基因组节段中的核酸修饰是1595位的T，其相对于GenBank登陆No.AF461684.1进行编号。任选地，M1基因组节段包括SEQ ID NO：5中所示的序列。如本文中所描述的呼肠孤病毒可包括本文中公开的任意修饰或修饰的组合。任选地，如本文中所描述的呼肠孤病毒包括具有SEQ ID NO：1-10中所示的序列的基因组节段或SEQ ID NO：11、12和16-21、以及SEQ ID NO：13和/或14中所示的多肽。任选地，如本文中所公开的呼肠孤病毒被确定为IDAC登陆No.190907-01，保藏时间为2007年9月19日，保藏机构为加拿大国际微生物保藏中心(IDAC)，保藏单位地址为R3E 3R2加拿大马尼托巴省温尼伯市阿灵顿街1015号。 
辛德毕斯病毒(SIN)可被用于本文中所述的方法之中。辛德毕斯病毒是披衣病毒科 家族中的阿尔法病毒属中的成员。辛德毕斯病毒基因组为11703个核苷酸的单链RNA，在5’末端带帽，在3’末端多聚腺苷酸化。基因组包括49S不翻译区(UT)、非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4，然后是启动子。启动子之后是26S UT、结构蛋白C、E3、E2、6K和E1，最后是3’-UT和多聚腺苷酸化末端。基因组49S RNA是正义的，有传染性的，并且在被感染的细胞内起mRNA作用。 
辛德毕斯载体在体内系统地和特异性地感染/检测以及杀死转移性肿瘤，从而导致了对于肿瘤生长的显著抑制，并提高了存活机会(Hurtado et al.，Rejuvenation Res.9(1)：36-44(2006))。辛德毕斯病毒通过使用Mr 67,000昆布氨酸受体感染哺乳动物细胞，该受体水平在肿瘤中比在正常细胞有所提高。肿瘤昆布氨酸受体的过表达可以解释辛德毕斯载体在体内对于肿瘤细胞所展示的特异性和有效性。辛德毕斯不一定需要经过遗传处理来靶向癌细胞或被直接注射到肿瘤中。辛德毕斯可被注射到受试者的任何地方，并通过血流到达靶点区域(Tseng et al.，Cancer Res.64(18)：6684-92(2004)。辛德毕斯还可以被遗传改造从而携带一种或多种抑制针对病毒的免疫应答的基因、和/或促进针对肿瘤的免疫应答的基因，例如抗肿瘤细胞因子基因，如白细胞间介素-12和白细胞间介素-15基因。 
溶瘤病毒可以是天然产生的或经修饰的。在施用到瘤细胞之前，病毒可以经过化学或生物化学的预处理(例如使用蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶进行处理)。使用蛋白酶进行预处理除去病毒的外层或衣壳，可以增加病毒的感染性。病毒可以被包裹在脂质体或微团中，以降低或预防来自已针对该病毒产生了免疫性的哺乳动物的免疫应答(Chandran and Nibert，J.of Virology 72(1)：467-75(1998))。例如，在存在能够形成微团的浓度的烷基硫酸盐去垢剂时使用胰凝乳蛋白酶处理病毒粒子，从而产生新的传染性亚病毒颗粒。溶瘤病毒还可以为重配病毒或ISVP。 
本发明的方法包括根据本文中所公开的和本领域中获知的知识来使用任何溶瘤病毒。溶瘤病毒可以是天然产生的或经修饰的。当溶瘤病毒可以从天然来源中被分离出来并且没有被人类在实验室有意进行修饰过的时候，其是天然产生的。例如，溶瘤病毒可以来源于野生来源，即来源于被溶瘤病毒感染的人类。 
溶瘤病毒可以是重组溶瘤病毒。例如，重组溶瘤病毒源自对来自两种或多种遗传上不同的溶瘤病毒的基因组节段重配(本文中也称为重配体)而形成的重组溶瘤病毒。溶瘤病毒基因组节段的重配可以发生在宿主生物体被至少两种遗传上不同的溶瘤病毒感染之后。重组病毒还可以在细胞培养基中产生，例如，通过以遗传上不同的溶瘤病毒 同时感染批准的宿主细胞。任选地，所述方法包括使用通过对来自两种或多种遗传上不同的溶瘤病毒的基因组节段重配而形成的重组溶瘤病毒，其中至少一种亲本病毒是遗传上改造的，包含一个或多个化学合成的基因组节段，经化学或物理诱变剂处理过，或者本身是重组事件的结果。任选地，所述方法包括使用在化学诱变剂的存在下或者在物理诱导剂的存在下发生重组的重组溶瘤病毒，该化学诱变剂包括但不限于硫酸二甲酯和澳化乙锭，该物理诱导剂包括但不限于紫外光和其他形式的辐射。 
任选地，所述方法包括使用这样的溶瘤病毒，其在一个或多个基因组节段中具有突变，包括插入、替换、缺失或复制。这些突变可包括由于与宿主细胞基因组发生重组所得的额外遗传信息，或可包括合成的基因，例如编码抑制抗病毒免疫应答的试剂的基因。 
任选地，溶瘤病毒是突变溶瘤病毒。例如，可以通过例如向病毒粒子外衣壳中引入突变的外壳蛋白来对溶瘤病毒进行修饰。任选地，突变溶瘤病毒是突变呼肠孤病毒。如本文中所描述的突变呼肠孤病毒可含有减少或基本上消除sigma3多肽表达的突变或导致不存在功能性sigma3多肽的突变，如U.S.Serial No.12/124,522中所述，其全部通过引用的方式并入本文中。任选地。提供的方法中使用的突变呼肠孤病毒是如U.S.Serial No.12/046,095中所述的那样突变的，其全部通过引用的方式并入本文中。 
本文中所称的突变可以是替换、插入或缺失一个或多个核苷酸。例如点突变包括单核苷酸转变(single nucleotide transition)(嘌呤至嘌呤或嘧啶至嘧啶)或颠换(嘌呤至嘧啶或嘧啶至嘌呤)、和单或多核苷酸缺失或插入。核酸中的突变可导致：在编码的多肽中产生一个或多个保守或非保守氨基酸替换，这可导致构象改变或者损失或部分损失功能；翻译的阅读框的偏移(框偏移)，这导致从该点编码的完全不同的多肽；早熟的终止密码子，这导致截短的多肽(截短)，或病毒核酸中的突变根本不可改变编码的多肽(沉默的或无义的)。对于保守和非保守氨基酸替换的公开，例如参见Johnson和Ovenngton，1993，J.Mol.Biol.233：716-38；Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-19；和美国专利No.4,554,101。 
可使用本领域中已知的任何方法来在溶瘤病毒的核酸产生突变。例如，定点诱变法可用于修饰呼肠孤病毒核酸序列。定点诱变法的一种最普通的方法是寡核苷酸定点诱变法。在寡核苷酸定点诱变法中，将编码序列中的期望改变的寡核苷酸退火到目标DNA的一条链中，并起到引发DNA合成的引物的作用的。以这种方式，含有序列改变的寡核苷酸引入新合成的链中。例如参见Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  82：488；Kunkel et al.，1987，Meth.Enzymol.154：367；Lewis and Thompson，1990，Nucl.Acids Res.18：3439；Bohnsack，1996，Meth.Mol.Biol.57：1；Deng和Nickoloff，1992，Anal.Biochem.200：81；以及Shimada，1996，Meth.Mol.Biol.57：157。其他方法在本领域中惯例地用于修饰蛋白或多肽的序列。例如，含有突变的核酸可使用PCR或化学合成法来产生，或可化学合成氨基酸序列中具有期望改变的多肽。例如参见Bang and Kent，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5014-9并且并入本文中。 
病毒可使用标准方法来纯化。例如参见Schiff et al.，“Orthoreoviruses and Their Replication，”Ch 52，in Fields Virology，Knipe和Howley，eds.，2006，Lippincott Williams和Wilkins；Smith et al.，1969，Virology 39(4)：791-810；和美国专利No.7,186,542、7,049,127、6,808,916和6,528,305，其全部通过引用的方式并入本文中。如本文中所使用的，纯化的病毒是指从天然地伴随它们的细胞组分中分离出来的病毒。典型地，当它们是至少70干重％(例如至少75干重％、80干重％、85干重％、90干重％、95干重％或99干重％)、并且不含和它们天然地缔合的蛋白与其他细胞组分时，病毒被认为是纯化的。 
本文中提供包含溶瘤病毒的药物组合物。本文中还提供包含治疗剂(例如降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂)的药物组合物。任选地，药物组合物包含溶瘤病毒和降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂。任选地，药物组合物包含溶瘤病毒、降低间隙压力和/或血管渗透性的试剂、和抑制促炎细胞因子的试剂。因此，提供的药物组合物可包含一种试剂或多于一种的试剂。例如，独立的药物组合物或相同的组合物中可含有溶瘤病毒、降低间隙压力和/或血管渗透性的试剂、和抑制促炎细胞因子的试剂中的每一种。如果独立的药物组合物中含有溶瘤病毒和所述试剂，所述组合物可伴随或连续施用。 
本文中提供的组合物在药学上可接受的载体中在体外或体内施用。药学上可接受的载体可以是可起到呼肠孤病毒的媒介、载体或介质的作用的固体、半固体或液体材料，因此，含有呼肠孤病毒和/或一种或多种提供的试剂的组合物可以为片剂、丸剂、粉末、锭剂、香袋剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、例如包含最多10重量％的活性化合物的药膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射用溶液、和无菌密封粉末的形式。 
任选地，所述组合物含有适于输注的溶瘤病毒。对于静脉输注，有两种类型的通常使用的流体：类晶体流体和胶体。类晶体流体是无机盐或其他水溶性分子的水溶液。胶体含有更大的不溶性分子，例如明胶；血液本身是胶体。最通常使用的类晶体流体 是生理盐水，其是浓度为0.9％的氯化钠溶液，并且接近血液中的浓度(等渗)。林格氏乳酸盐溶液或林格氏乙酸盐溶液是另外的通常用于大体积流体置换的等渗溶液。如果患者处于低血糖或高钠的风险中，经常使用有时称为D5W的在水中的5％的葡萄糖溶液代替。 
合适的载体的一些例子包括磷酸盐-缓冲盐水或另外的生理学上可接受的缓冲液、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄耆胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。药物组合物还另外包括但不限于：润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如甲基和丙基羟基苯甲酸酯；甜味剂；和调味剂。药物组合物可以被配制为在通过采用本领域已知的程序施用后，提供迅速的、持续的或延长的突变呼肠孤病毒释放。除了下面所述的代表性制剂，在药物组合物中使用的其他合适的制剂可在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(21th ed.)ed.David B.Troy，Lippincott Williams & Wilkins，2005中找到。为了制备固体组合物例如片剂，突变呼肠孤病毒可与药物载体混合以形成固体组合物。任选地，片剂或丸剂可以被包衣或混合起来以提供获得延长作用时间优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量成分，后者以外壳的形式包裹前者。两种成分可以通过肠溶衣层分开，肠溶衣在胃部可以抵抗崩解，使得内部组分完整地进入十二指肠或延缓其释放。可以使用不同的材料用于这种肠溶衣或包衣层，这些材料包括许多聚合酸，以及聚合酸与诸如虫漆、十六烷醇和醋酸纤维素的这些材料的混合物。 
包含用于口服或注射的呼肠孤病毒和/或试剂的液体制剂通常包括水溶液、适宜口味的糖浆、水性或油性悬浮剂、以及含有例如玉米油、棉花子油、芝麻油、椰子油或花生油的食用油的经调味乳剂、以及酏剂和类似的药物媒介物。 
用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可以接受的水或有机溶剂或它们的混合物中的溶液和悬浮液、以及粉末。这些液体或固体组合物可以含有如本文中所描述的合适的药学上可接受的赋形剂。这种组合物可经过口服或鼻呼吸途径施用于局部或全身作用。药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用惰性气体喷雾给药。喷雾溶液可以从喷雾装置直接吸入，或者喷雾装置可以与面罩吸入器或间歇性正压呼吸机相连。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置中通过口或鼻施用。 
任选地在本公开的方法中使用的另外的制剂包括经皮递送装置(例如贴剂)。这种经皮贴剂可用于提供如本文中所描述的病毒和试剂的连续或间断注入。用于递送药剂 的经皮贴剂的构造和用途是本领域公知的。例如参见美国专利No.5,023,252。这种贴剂可以被构建用于连续的、脉动的或按要求递送突变呼肠孤病毒。 
如上所述，如果需要，病毒和/或其他试剂可以被包裹在脂质体或微团中，以降低或预防针对所述病毒或试剂产生了免疫性的哺乳动物的免疫应答。这些组合物被称为免疫保护病毒或试剂。例如参见美国专利No.6,565,831和7,014,847。 
在提供的方法中，溶瘤病毒例如以这样的方式系统地施用，该方式为使得其可最终解除靶肿瘤或肿瘤细胞。使用病毒的途径、以及制剂、载体或媒介，取决于靶细胞的位置和类型。可以采用多种施用途径。例如，对于易接近的实体瘤，可通过直接注射到肿瘤中来施用病毒。对于造血瘤，例如，可静脉或血管内施用病毒。对于体内不易接近的肿瘤，例如转移瘤(metastases)，病毒以这样的方式施用，该方式为使得其可系统地输送通过哺乳动物的机体，从而导致到底(例如静脉或肌肉内)。可选择地，病毒直接施用至单个实体瘤，其中然后其被携带系统地通过机体至转移瘤。病毒也可以皮下、腹腔内、鞘内或室内(例如对于脑瘤)、局部(例如对于黑素瘤)、口腔(例如对于口腔或食道癌)、直肠(例如对于结肠直肠癌)、阴道(例如对于子宫癌或阴道癌)、通过吸入喷雾或气雾剂经鼻(例如对于肺癌)施用。 
任选地，病毒至少一日一次连续地施用至受试者、或最多间歇地或连续地整天连续数日施用至受试者一段时间。因此，例如病毒通过静脉施用的方式在任何药理学上可接受的溶液中施用至受试者，或以输注的方式在一段时间内施用至受试者。例如，物质可通过注射(例如IM或皮下)系统地施用或每日口服至少一日一次。或通过输注以这样的方式施用，该方式为使得导致每日递送到受试者的组织或血流中。当病毒通过输注在一段时间内施用时，所述时间例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或24小时，或1至24小时之间的任何时间(包括1和24小时)，或更多。任选地，所述时间为5、15、30、60、90、120、150或180分钟，或5至180分钟之间的任何时间(包括5和180分钟)，或更多。因此，例如，病毒通过输注施用60分钟。施用可每日重复，共2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、28天，或2至28天之间的任何时间(包括2和28天)，或更多。 
提供的方法的降低间隙压力和/或血管渗透性的试剂或其他治疗剂(即，抑制促炎细胞因子的试剂)也通过多种施用途径来施用。因此，所述试剂通过多种施用途径中的任一种来施用，包括局部、口腔、胃肠外、静脉、腹腔内、肌肉内、皮下、腔内、透皮、肝内、颅内、雾化/吸入、或通过支气管镜检查法滴注来施用。任选地，治疗剂以 上面涉及溶瘤病毒所述的方式连续地施用。因此，例如，所述试剂通过静脉施用的方式在任何药理学上可接受的溶液中施用至受试者，或以输注的方式在一段时间内施用至受试者。任选地，所述试剂在治疗位点处或其附近局部施用。可选择地，所述试剂系统地施用。降低间隙压力和/或血管渗透性的试剂的施用的量(即，有效量)为足以降低间隙压力和/或增加血管渗透性。抑制促炎细胞因子的试剂的施用的量(即，有效量)为足以抑制一种或多种促炎细胞因子。通过例子的方式，紫杉烷的有效量包括约40-300mg/m2的肿瘤体积，或40至300mg/m2之间的任何量(包括40和300mg/m2)。因此，有效量的紫杉烷包括130-225mg/m2。通过另外的例子的方式，铂化合物的有效量包括约5-1000mg/m2或5至1000mg/m2之间的任何量(包括5和1000mg/m2)。因此，例如顺铂的有效量包括约175-200mg/m2，卡铂的有效量包括约200-600mg/m2。其他试剂的有效量为0.001-10,000mg/kg体重，或0.001至10,000mg/kg体重之间的任何量(包括0.001和10,000mg/kg体重)。任选地，铂化合物的有效量包括约2至7mg/mL分钟(AUC)，其通过Calvert式来计算。任选地，铂化合物的有效量包括约5或6mg/mL分钟(AUC)，其通过Calvert式来计算。任选地，铂化合物以静脉输注的方式施用30分钟的时间。 
本文中公开的病毒的施用的量(即，有效量)为足以治疗增生性疾病。当施用至增殖细胞的病毒影响受到影响的细胞的溶胞(例如溶瘤)，从而导致异常增殖细胞的数量减少、癌的尺寸降低和/或与增生性疾病相关的症状(例如疼痛)减轻或消除时，增生性疾病被治疗。如本文中所使用的，术语溶瘤是指至少10％的增殖细胞溶胞(例如至少约20％、30％、40％、50％或75％的细胞溶胞)。溶胞百分率可(例如)通过测定哺乳动物中癌的尺寸降低或增殖细胞的数量的减少来确定，或通过测定体外细胞溶胞的量来确定(例如来自增殖细胞的活组织切片检查)。有效量的病毒将在个体基础上来确定，并且可至少部分基于使用的特定病毒、个体的尺寸、年龄、性别、以及异常增殖细胞的尺寸和其他特征。例如，对于人类的治疗，使用约103至1012空斑形成单位(PFU)的病毒，这取决于存在的增殖细胞或癌的类型、尺寸和数量。例如，有效量可以是约1.0PFU/kg体重至约1015PFU/kg体重(例如约102PFU/kg体重至约1013PFU/kg体重)。任选地，有效量是约1x108至约1x1012TCID50。任选地，有效量是约1x1010TCID50。 
通过例子的方式，175mg/m2的降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂(例如紫杉醇)施用至受试者；以及3x1010TCID50或1x1010TCID50的呼肠孤病毒施用至受试者。任选地，200mg/m2的的降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂(例如紫杉醇)施用至 受试者；以及3x1010TCID50或1x1010TCID50的呼肠孤病毒施用至受试者。任选地，降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂以3小时静脉输注的形式施用。任选地，呼肠孤病毒以1小时静脉输注的形式施用。 
通过另外的例子的方式，175mg/m2的降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂(例如紫杉醇)施用至受试者；5mg/ml分钟(AUC，其通过Calvert式来计算)的抑制促炎细胞因子的试剂(例如卡铂)施用至受试者；以及3x1010TCID50或1x1010TCID50的呼肠孤病毒施用至受试者。任选地，200mg/m2的的降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂(例如紫杉醇)施用至受试者；6mg/ml分钟(AUC，其通过Calvert式来计算)的抑制促炎细胞因子的试剂(例如卡铂)施用至受试者；以及3x1010TCID50或1x1010TCID50的呼肠孤病毒施用至受试者。任选地，降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂以3小时静脉输注的形式施用。任选地，抑制促炎细胞因子的试剂以30分钟静脉输注的形式施用。任选地，呼肠孤病毒以1小时静脉输注的形式施用。 
病毒和治疗剂以及含有病毒和试剂的最佳剂量取决于多种因素。需要的确切剂量将随受试者的变化而变化，其取决于物种、年龄、体重和受试者的总体情况、接受治疗的疾病的严重性、使用的特定病毒或载体以及其施用方式。因此，不可能为每种组合物指定确切剂量。然而，仅仅通过本文中所提供的指导来使用日常试验，本领域普通技术人员就可确定合适的量。 
施用组合物的有效剂量和安排可根据经验来确定。例如，多种增生性疾病的动物模型可得自Jackson Laboratory，600 Main Street，Bar Harbor，Maine 04609 USA。直接测定(例如肿瘤组织学)和功能测定(例如受试者的存活或肿瘤的尺寸)都可用于监控对于治疗的应答。这些方法包括处理代表性动物以评价种群数，增加试验所必需的动物数量。肿瘤中荧光素酶活性的测定提供可选择的方法来评价肿瘤体积，而无需处理动物并且允许进行治疗的纵向群体基分析(longitudinal population-based analysis)。 
用于施用组合物的剂量范围大到足以提供所期望的效果，使得疾病的症状受到影响。剂量不应该大到会引发不良副作用，例如不希望的交叉反应和过敏性反应。如果发生任何禁忌症时，剂量可以由个人医师进行调节。 
剂量改变并且每日以一种或多种剂量施用来施用1天或数天。提供的病毒和治疗剂以单剂量或多剂量(例如2、3、4、6或更多剂量)来施用。例如，如果通过输注来施用，输注可以是单缓释剂量，或可以通过多次输注来递送。治疗可持续数天至数月，或直到实现疾病的减轻为止。 
提供的病毒和治疗剂伴随(例如作为混合物)、分开但同时(例如通过分开的静脉线进入相同受试者)、或依次(例如首先给予一种化合物或试剂，接着给予第二种)地联合施用。因此，术语联合用于指两种或多种试剂的伴随、同时或依次施用。通过例子的方式，降低间隙压力的试剂在溶瘤病毒之前或同时施用。通过另外的例子的方式，降低间隙压力的试剂第一或第二施用，抑制促炎细胞因子的试剂第一或第二施用，并且溶瘤病毒第三施用。任选地，降低间隙压力的试剂第一施用，抑制促炎细胞因子的试剂和溶瘤病毒同时施用。当一种化合物在另一种化合物之前施用时，第一化合物在第二化合物施用之前数分钟、数小时、数天或数周施用。例如，第一化合物可在第二化合物施用之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、36、48、60或72小时、或1至72小时之间的任何时间(包括1和72小时)施用。任选地，第一化合物在第二化合物之前多于72小时施用。通过另外的例子的方式，第一化合物可在第二化合物施用之前1、5、15、30、60、90、120、150或180分钟、或1至180分钟之间的任何时间(包括1和180分钟)施用。任选地，第一化合物在第二化合物施用之前1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天、或1至28天之间的任何时间(包括1和28天)施用。任选地，第一化合物在第二化合物之前多于28天施用。例如，降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂在溶瘤病毒施用之前约1至8小时施用。通过另外的例子的方式，降低间隙压力和/或增加血管渗透性在溶瘤病毒施用之前4、6、8或10小时第一施用，抑制促炎细胞因子的试剂在溶瘤病毒施用之前1小时第二施用，并且溶瘤病毒第三施用(即，在施用抑制促炎细胞因子的试剂1小时后施用)。 
溶瘤病毒或包含这种病毒的药物组合物任选地包装在试剂盒中。试剂盒还包含一种或多种试剂、或包含这种降低间隙压力和/或增加血管渗透性的试剂的药物组合物。任选地，试剂盒还包含一种或多种抑制促炎细胞因子的试剂、一种或多种化学治疗剂、一种或多种免疫抑制剂、和/或一种或多种抗-抗-病毒抗体。药物组合物可配制为单位剂量形式。术语“单位剂量形式”是指物理上不连续的单位，作为单元剂量用于人受试者和其他哺乳动物，每个单位含有与合适的药学上可接受的载体结合的、为了产生期望的治疗效果而计算出的突变呼肠孤病毒的预定量。 
提供的方法可以与其他肿瘤治疗法例如化学治疗法、放射性治疗法、手术法、激素治疗法和/或免疫治疗法相结合。因此，溶瘤病毒的施用可以与手术或去除瘤联合。因此，本文中提供治疗实体瘤的方法，该方法包括瘤的手术去除和在瘤位点或其附近施用溶瘤病毒。 
在提供的方法中所述组合物任选地与已知的抗癌化合物或化学治疗试剂联合施用或在其基础上附加施用。化学治疗试剂为可以抑制肿瘤生长的化合物。这些试剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶吟、羟基脲、环磷酰胺、氮烯唑胺、米托蒽醌、蒽环类(表柔比星和多柔比星)、受体抗体例如赫赛汀、依托泊苷、pregnasome、激素治疗剂如他莫西芬和抗雌激素、干扰素、芳香酶抑制剂、促孕剂和LHRH类似物。 
如本文中所使用的，术语增生性疾病是指任何这样的细胞疾病，其中和正常组织生长相比，细胞增生过快。增生性疾病包括但不限于癌，其叶称为肿瘤。癌可包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、脑瘤(例如成胶质细胞瘤)、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、神经性纤维瘤1和白血病。癌可以是实体癌(例如肉瘤或癌瘤)或影响造血系统的癌细胞生长(例如淋巴瘤或白血病)。其他增生性疾病包括但不限于神经性纤维瘤。 
通常，在使用溶瘤病毒进行治疗的增生性疾病中，和疾病相关的一种或多种增殖细胞可具有突变，其中Ras基因(或ras信号传导途径的元件)被直接(例如通过激活ras中的突变)或间接(例如通过激活ras途径中的上游元件或下游元件)激活。激活ras途径中的上游元件包括(例如)表皮生长因子受体(EGFR)或Sos的转化。例如参见Wiessmuller和Wittinghofer，1994，Cellular Signaling 6(3)：247-267；以及Barbacid，1987，Ann.Rev.Biochem.56，779-827。激活ras途径中的下游元件包括(例如)B-Raf内的突变。例如参见Brose et al.，2002，Cancer Res.62：6997-7000。至少部分源自ras、ras的上游元件、或ras信号传导途径中的元件的激活的增生性疾病在本文中被称为that r ras-介导的增生性疾病。另外，溶瘤病毒用于治疗由PKR的突变或失调引起的增生性疾病。例如参见Strong et al.，1998，EMBO J.17：3351-62。 
如本文中所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“改善(ameliorating)”是指能够减轻病症或者状况的作用、或者减轻病症或者状况的症状的方法。因此在公开的方法中，治疗可以是指减轻或改善已确立的病症或者状况的严重性的、或者病症或者状况的症状的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，在受试者中，与对照相比，治疗癌症的方法降低病症的一种或多种症状的10％，则该方法被认为是治疗。因此，与天然的或者对照的水平相比，降低可以为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或在10与100之间任何百分比的降低。应理解，治疗并不一定是指治愈或者完全消除病症、状况、或者病症或状况的症状。 
如本文中所使用的，术语受试者可以为脊推动物，更具体为哺乳动物(例如，人类、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼类、禽类或爬虫动物或两栖动物。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，成年和新生的受试者，无论雄性或雌性，都意欲包括在内。如本文中所使用的，患者或受试者可以互换使用，并且可以是指患有病症或疾病的受试者。术语患者或受试者包括人类和兽类受试者。 
本文中公开的材料、化合物、组合物和组分可以用于所公开的方法和组合物，可与它们结合使用，可用于制备所公开的方法和组合物，或者是所公开的方法的产物和组合物。本文中公开这些和其他的材料，应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可不明确公开对各单独和集合组合的具体参考以及这些化合物的排列，但是本文中都预期和描述上述内容。例如，如果抑制剂被公开和讨论，并且可对许多分子(包括抑制剂)进行的许多修改被讨论，除非具体指出有相反含义，则具体预期了抑制剂的可能的每一个和每一种组合和排列。同样，也具体设想并公开了上述的任何子集和组合。这种概念应用于本公开的所有方面，包括但不限于使用公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果可以进行各种附加步骤，应理解这些附加步骤的每一个步骤都可以与所公开的方法的任何具体的方法步骤或方法步骤的组合一起进行，并且每一个这样的组合或组合的子集都是具体设想的并应认为是公开的。 
在整个该申请中引用了多篇公开文献。这些公开文献的公开全部通过引用的方式并入本申请中。 
许多本发明的方面已经被描述。然而，将理解可以做出各种修改。另外，当描述一个特征或步骤时，其可结合本文中的任何其他特征或布置，即使所述结合并未明确地阐述。因此，其他方面也在权利要求书的范围内。 
实施例
实施例1.人用呼肠孤病毒、紫杉醇和卡铂方案 
这是每隔3周静脉给予呼肠孤病毒和紫杉醇与卡铂的研究设计。 
以175mg/m2或200mg/m2的剂量静脉输注3小时来施用紫杉醇。然后以通过Calvert式计算的剂量(AUC 5mg/mL分钟或6mg/mL分钟，GFR通过51Cr EDTA测定)静脉输注30分钟来施用卡铂。在施用紫杉醇和卡铂后，以1x1010或3x1010TCID50的剂量静脉输注1小时来施用呼肠孤病毒。 在第2至5天将只施用呼肠孤病毒，使用和第1天使用的相同的剂量和方法。 
表2-给药方法 
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实施例2.呼肠孤病毒和mTOR抑制剂 
基于Chou和Talalay的中效原理(Chou和Talalay，Trends Pharmacol.Sci.4：450-454(1983))，使用恒定比例联合设计和联合指数法，评价呼肠孤病毒联合雷帕霉素对于B16.F10细胞的影响。 
将细胞(5x103/孔)接种到96孔板中并且允许贴壁过夜。将培养基用雷帕霉素和/或呼肠孤病毒的两倍稀释液代替，分别对应于之前测定的ED50的2、1、0.5和0.25倍，在新鲜培养基中稀释，持续温育48h。然后除去培养基，并使用MTS测试法来测定相对于未处理的细胞的细胞存活百分率。数据使用CalcuSyn程序分析。 
通过在呼肠孤病毒之前或之后24小时加入雷帕霉素来评价改变顺序的影响。值得注意的是，在24小时，对于呼肠孤病毒观察到很少细胞死亡(如果有的话)。如果雷帕霉素在线给予或伴随呼肠孤病毒给予(分别为图1a和1b)，相互作用是对抗性的(联合指数值(CIV)大于1)。只有在雷帕霉素在呼肠孤病毒之后给予时(图1c)，在呼肠孤病毒和雷帕霉素之间才观察到协同性相互作用(CIV小于1)。 
在体内环境中，呼肠孤病毒和雷帕霉素联合处理降低了皮下移植的肿瘤的生长，并且延长了鼠的半数存活时间。将B16.F10肿瘤皮下接种到C57Bl/6鼠中，并且在第1和4天用瘤内呼肠孤病毒T3D 5x108 TCID50处理，在第1、4、8和12天以5mg/kg的剂量腹腔内给予雷帕霉素，单独或联合，或使用对照处理(瘤内PBS，腹腔内PBS)。 
对于各组测定各肿瘤的直径并计算平均值。和单一试剂处理或对照处理相比，呼 肠孤病毒T3D/雷帕霉素联合处理导致肿瘤生长显著地降低(图2A)。 
将存活率绘制成Kaplan-Meier曲线。对照处理的鼠的半数存活时间为7天。单独使用雷帕霉素的半数存活时间没有改善。单独使用呼肠孤病毒延长半数存活时间至9天。联合处理增加存活时间至＞15天(Logrank检验p＝0.0216)(图2B)。 
实施例3.呼肠孤病毒、环磷酰胺(CPA)和IL-2. 
预处理具有Treg缺失(PC-61)和/或IL-2的C57Bl/6鼠增强了静脉局部递送呼肠孤病毒至皮下，建立了B16肿瘤(图3)。然而，在该试验中使用的高剂量的呼肠孤病毒(3.75x109TCID50)导致产生毒性。因此，PC-61或CPA(其模拟PC-61的效果)+IL-2+呼肠孤病毒的处理效果被测试，其中呼肠孤病毒的病毒剂量减至1x108TCID50/注射。在这些条件下，使用PC-61+IL-2或CPA+IL-2在这样的水平下观察皮下B16肿瘤的等同处理，该水平明显好于任一种对照处理(P＜0.01；图4A)。用预处理方案和静脉呼肠孤病毒处理的鼠中均未表现毒性。尽管没有观察到毒性，然而呼肠孤病毒从用CPA+IL-2+呼肠孤病毒处理的鼠的肺部和心脏回收。这和用PC-61+IL-2+呼肠孤病毒处理的鼠相反，其中病毒只从肺部而不从心脏回收。因此，用CPA+IL-2预处理增强了静脉递送呼肠孤病毒至这样的水平的系统递送所产生的治疗，该水平和由PC-61+IL-2诱导的水平没有区别。 
之前表明高剂量的CPA(150mg/kg)可调节针对呼肠孤病毒的Nab的水平，从而允许重复施用病毒(Qiao et al.，Clin.Cancer Research 14：259-69(2008))。因此，尽管对于呼肠孤病毒的Nab并未表明在治疗效果上具有任何抑制作用(在图4A的病毒-幼C57Bl/6鼠中观察)，但是测试了它们的血清的Nab水平。如所期望的那样，只用呼肠孤病毒处理的鼠的血清含有针对呼肠孤病毒的高水平的中和活性(图4B)。用IL-2或PC-61预处理表明有在血清中增加中和活性水平的趋势，尽管这些值非常易变。在呼肠孤病毒施用前用CPA预处理明显地降低了该中和活性(P＜0.01)，其在CPA+IL-2联合时得以保持(图4B)。在只用呼肠孤病毒处理的鼠中观察到的那些，Treg缺失PC-61+IL-2的联合维持中和水平(图4B)。因此和IL-2+呼肠孤病毒联合使用CPA不仅增强抗肿瘤治疗(图4A)，而且调节抗呼肠孤病毒抗体的水平。 
概言之，这些数据表明和只用PBS/呼肠孤病毒处理的鼠相比，PC-61+IL-2使系统地递送的呼肠孤病毒的瘤内定位增加2至3个log值。这是由于在肿瘤位点IL-2诱导的血管渗漏，这增强了系统地递送的病毒定位到建立的肿瘤中的能力。另外，数据 表明CPA-介导的Treg修饰(IL-2和低剂量呼肠孤病毒)针对建立的肿瘤有治疗性。 
序列表
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Claims (43)

1.一种在受试者中治疗增生性疾病的方法，该方法包括下列步骤：
(a)在所述受试者中降低间隙压力；以及
(b)向所述受试者施用一种或多种溶瘤病毒。
2.权利要求1所述的方法，其中将约103至1012个空斑形成单位(PFU)的所述溶瘤病毒施用至所述受试者。
3.权利要求2所述的方法，其中将约108至1012的空斑形成单位(PFU)的所述溶瘤病毒施用至所述受试者。
4.权利要求1所述的方法，其中将约108至1012的TCID50的所述溶瘤病毒施用至所述受试者。
5.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)通过向所述受试者施用降低间隙压力的试剂来实施。
6.权利要求5所述的方法，其中将约5至1000mg/m2的所述降低间隙压力的试剂施加至所述受试者。
7.权利要求5所述的方法，其中将约0.001-10,000mg/kg体重的所述降低间隙压力的试剂施加至所述受试者。
8.权利要求5所述的方法，其中所述降低间隙压力的试剂增加血管渗透性。
9.权利要求5所述的方法，其中所述降低间隙压力的试剂是紫杉烷。
10.权利要求6所述的方法，其中所述紫杉烷选自由莱龙泰素、紫杉醇和多西他赛构成的组。
11.权利要求9所述的方法，其中将约40-300mg/m2的所述紫杉烷施用至所述受试者。
12.权利要求9所述的方法，其中将约130-225mg/m2的所述紫杉烷施用至所述受试者。
13.权利要求10所述的方法，其中将约175-200mg/m2的所述紫杉醇施用至所述受试者。
14.权利要求5所述的方法，其中所述试剂选自由下列物质构成的组：白细胞间介素-1(IL-1)、干扰素-K(IFN-K)、P物质、蛋白酶抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)、硝化甘油、5-羟色胺、血浆激肽、血小板激活因子(PAF)、前列腺素E1(PGE1)、组织胺、伊马替尼、封闭带毒素(ZOT)、白细胞间介素-2、一氧化氮抑制剂和人生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。
15.权利要求14所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是N-α-甲苯磺酰基-L-赖氨酰基-氯甲酮(TLCK)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)、或亮抑酶肽。
16.权利要求14所述的方法，其中所述血浆激肽是缓激肽。
17.权利要求14所述的方法，其中所述一氧化氮抑制剂是L-N-单甲基精氨酸(L-NMMA)或L-N-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)。
18.权利要求1所述的方法，其中所述(a)通过向所述受试者施用低钙离子浓度的流体来实施。
19.权利要求18所述的方法，其中所述流体包含50Tmol/L至200Tmol/L的钙离子浓度。
20.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)通过在所述增生性疾病的位点处或附近除去过量的间隙液来实施。
21.权利要求20所述的方法，其中所述过量的间隙液通过人工淋巴系统(ALS)除去。
22.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)通过向所述受试者施用渗透性光动力学治疗剂来实施。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)在所述步骤(b)的同时、之前或之后实施。
24.权利要求5所述的方法，其中所述降低间隙压力的试剂在所述溶瘤病毒之前施用。
25.权利要求24所述的方法，其中所述试剂在所述溶瘤病毒之前1至12小时施用。
26.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述病毒以多剂量施用。
27.权利要求5所述的方法，其中所述降低间隙压力的试剂以多剂量施用。
28.权利要求5所述的方法，还包括向所述受试者施用抑制促炎细胞因子的试剂的步骤。
29.权利要求28所述的方法，其中所述试剂抑制促炎细胞因子，但不抑制或最低程度地抑制NARA的产生。
30.权利要求28所述的方法，其中所述抑制促炎细胞因子的试剂是铂化合物。
31.权利要求30所述的方法，其中所述铂化合物选自由顺铂、卡铂和奥沙利铂构成的组。
32.权利要求30所述的方法，其中将约5-1000mg/m2的所述铂化合物施用至所述受试者。
33.权利要求31所述的方法，其中2至7mg/mL分钟(AUC)的所述卡铂施用至所述受试者。
34.权利要求31所述的方法，其中5或6mg/mL分钟(AUC)的所述卡铂施用至所述受试者。
35.权利要求28所述的方法，其中所述降低间隙压力的试剂是紫杉醇，所述抑制促炎细胞因子的试剂是卡铂，并且所述溶瘤病毒是呼肠孤病毒。
36.权利要求28所述的方法，其中所述降低间隙压力的试剂首先在施用所述溶瘤病毒之前4小时的时间施用，并且其中所述抑制促炎细胞因子的试剂其次在施用所述溶瘤病毒之前1小时的时间施用。
37.权利要求1所述的方法，其中所述病毒具有一个或多个突变或缺失，以不抑制所述双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)。
38.权利要求1所述的方法，其中所述溶瘤病毒选自由呼肠孤病毒、辛德毕斯病毒、Delta24、水泡性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、牛痘病毒、脑炎病毒、带状疱疹病毒、肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒和麻疹病毒构成的组。
39.权利要求38所述的方法，其中所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒。
40.权利要求38所述的方法，其中所述呼肠孤病毒是人类呼肠孤病毒。
41.权利要求40所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒选自由血清型1呼肠孤病毒、血清型2呼肠孤病毒和血清型3呼肠孤病毒构成的组。
42.权利要求40所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒是血清型3呼肠孤病毒。
43.权利要求38所述的方法，其中所述呼肠孤病毒具有IDAC登陆No.190907-01。
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