CN101378770A - 使用局部免疫抑制改善溶瘤病毒治疗 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于治疗或改善受试体中的实体肿瘤的方法，包括在肿瘤位点或其附近给予溶瘤病毒和免疫抑制试剂。

Description

使用局部免疫抑制改善溶瘤病毒治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2006年2月13日的美国序列号为No.60/773,068的申请以及于2006年4月3日提交的美国序列号为No.60/788,898的申请的优先权，上述两个申请的全部内容通过引用方式包含在本文中。

技术领域

本发明涉及在接受溶瘤病毒治疗的受试体中使用局部免疫抑制，以改善治疗效果。

背景技术

仅仅在美国，每年就有多于一百万人被诊断患有癌症。尽管在医学研究中获得了很多进展，但是在美国癌症仍然是导致死亡的第二大原因。在发达国家，大约有五分之一的人死于癌症。在寻找新策略过程中，溶瘤病毒治疗最近已经作为一种特异性杀死肿瘤细胞的可行方法出现。不同于传统的基因治疗，其使用可复制性病毒，所述可复制性病毒能够通过病毒复制和伴随的细胞溶解而穿过肿瘤组织进行扩散，因此提供了一种癌症的替代治疗方法。目前病毒已经被改造以用于选择性地复制和杀死癌细胞。

溶瘤病毒(oncolytic virus)可以使用多种作用机理来杀死癌细胞—细胞溶解，细胞凋亡，抗血管生成和细胞坏死。病毒感染肿瘤细胞，然后开始进行复制。病毒继续进行复制，直到当肿瘤细胞再也不能容纳病毒时，宿主细胞膜发生溶解(爆裂)。肿瘤细胞被毁坏，新生成的病毒扩散到临近的癌细胞继续进行该循环。溶瘤病毒仅会在癌细胞中复制，其穿过正常组织而不会造成损害。因此，一旦所有的肿瘤细胞都被清除，溶瘤病毒就不再具有复制的能力，免疫系统将其从体内清除。

在过去的几年中，对于病毒细胞毒性的分子学机理的新的理解已经提供了用于设计更加有效的溶瘤病毒的科学基本原理。最近的一些分子生物学上的进展，已经使得能设计出几种基因修饰的病毒，例如能够在肿瘤细胞中进行特异性复制并杀死肿瘤细胞的腺病毒和单纯疱疹病毒。另一方面，也正在对具有固有的溶瘤能力的病毒进行评估以用于治疗目的。尽管溶瘤病毒治疗的有效性大体上已经在临床前的研究中被证实，但是在临床试验中的治疗的有效性仍然没有达到最佳。因此，还要对能够进一步改善条件性复制病毒(conditionally replicating viruses)的治疗潜力的策略进行评估。

发明内容

此处所提供的方法用于治疗或者改善受试体的实体肿瘤，包括在肿瘤位点处或者临近该肿瘤位点处给予溶瘤病毒和免疫抑制试剂。

所提供方法的一个或多个具体实施方案的细节将在下面的附图和描述中给出。其它特征、目标和优点可以从描述、附图、以及权利要求书中清楚看出。

附图说明

图1示出了仅仅5戈雷(Gy)的辐射就能够增强呼肠孤病毒(reovirus)的细胞毒性。

图2示出了通过给予辐射和呼肠孤病毒在免疫缺陷和免疫活性动物模型中减小体内肿瘤体积。

图3示出了辐射能够防止对中和抗肿瘤抗体的诱导。

具体实施方式

本申请中所使用的术语定义如下，除非另有说明。注意，此处所使用的标题仅仅用于组织的目的，并不意于限制此处提供的描述或附于此说明书后的权利要求书。

定义

“瘤细胞(neoplastic cell)”、“肿瘤细胞(tumor cell)”或“增殖失调的细胞”是指以异常高的速率增殖的细胞。由瘤细胞构成的新的生长是瘤(neoplasm)，也叫做“肿瘤(tumor)”。肿瘤是一种异常的组织生长，通常形成一种独特的肿块(mass)，该肿块通过比正常组织生长更快的细胞增殖而生长。肿瘤可以显示为部分或完全地缺乏结构组织以及缺乏与正常组织间的功能协调。此处所用的肿瘤意于包括造血系统肿瘤以及实体肿瘤。

肿瘤可以为良性的(良性肿瘤)或恶性的(恶性肿瘤或癌症)。恶性肿瘤广义上可分为三个主要类型。起源于上皮结构的恶性肿瘤叫做癌；起源于结缔组织例如肌肉、软骨、脂肪或骨的恶性肿瘤叫做肉瘤；影响包括免疫系统组分在内的造血结构(与血细胞形成相关的结构)的恶性肿瘤叫做白血病和淋巴瘤。其它的肿瘤包括但不限于神经纤维瘤。

“病变(lesion)”是损伤、创伤、或结构性异常的区域。对携带肿瘤的受试体而言，除非另有说明，病变是指肿瘤肿块。

“Ras激活的瘤细胞”或“ras介导的瘤细胞”是指那些至少部分由于激活ras途径而导致的以异常高的速率进行增殖的细胞。Ras途径可以通过下述方式被激活:ras基因突变、升高的ras基因表达水平、升高的ras基因信息的稳定性、或导致ras或一种或多种在ras途径中的ras下游或上游的因子的激活从而增加ras途径的活性的任何突变或其它机理。例如，EGF受体、PDGF受体或SOS的激活导致ras途径的激活。Ras介导的瘤细胞包括但不限于ras介导的癌细胞，该癌细胞是由于ras途径的激活而引起的以恶性方式进行增殖的细胞。

“病毒感染”是指病毒进入细胞以及在其中复制。类似地，“病毒感染的肿瘤”是指病毒进入肿瘤细胞以及在其中复制。

“呼肠孤病毒”是指任何被分类于呼肠孤病毒属的病毒，不管是天然产生的、经修饰过的或者是重组的。呼肠孤病毒是具有分节段的双链RNA基因组的病毒。病毒粒子的直径为60-80纳米(nm)，并具有两个同心的、均为20面体的衣壳外壳(capsid shells)。基因组包括10-12个离散节段的双链RNA，总的基因组大小为16-27kbp。每个RNA节段的大小不同。三个独特的、但是相关的呼肠孤病毒类型在许多物种中被发现。三种类型都共享相同的补体结合抗原。

人类呼肠孤病毒包括三种血清型:类型1(Lang株或T1L)、类型2(Jones株，T2J)以及类型3(Dearing株或Abney株，T3D)。基于中和和血凝抑制(hemagglutinin-inhibition)试验，就可以容易地识别这三种血清型(例如参见Fields，B.N.et al.，1996)。

呼肠孤病毒可以为天然产生的或经过修饰的。当呼肠孤病毒可以从天然来源中被分离出来、并且没有在实验室中被人类有意地进行修饰的时候，其是“天然产生的”。例如，呼肠孤病毒可以来源于“野生来源(fieldsource)”，即来源于被呼肠孤病毒感染的人类。呼肠孤病毒还可以被选择或者被诱变用于提高溶瘤活性。

呼肠孤病毒可以被修饰，但是仍然能够可溶解地感染具有活性ras途径的哺乳动物细胞。在给予增殖细胞之前，可以对呼肠孤病毒进行化学或生物化学预处理(例如使用蛋白酶进行处理，例如使用胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)。使用蛋白酶进行的预处理可以除去病毒的外层或衣壳，并且可能增加病毒的感染性。呼肠孤病毒可以被包裹在脂质体或微团(micelle)中(Chandran和Nibert，1998)。例如，可以在存在形成微团浓度的烷基硫酸盐去垢剂时使用胰凝乳蛋白酶处理病毒粒子，从而产生新的传染性亚病毒颗粒(ISVP)。

呼肠孤病毒可以是通过来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段的重组/重配(reassortment)而形成的重组呼肠孤病毒。呼肠孤病毒基因组节段的重组/重配可以天然产生，发生在宿主生物体感染至少两种遗传上不同的呼肠孤病毒之后。重组病毒粒子还可以在细胞培养液中产生，例如，通过以遗传上不同的呼肠孤病毒的同时感染允许宿主细胞(permissive host cell)(Nibert et al.，1995)。

因此，本发明考虑使用如下的重组呼肠孤病毒，该重组呼肠孤病毒来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段的重配，包括但不限于人类呼肠孤病毒，例如类型1(例如Lang株)、类型2(例如Jones株)，以及类型3(例如Dearing株或Abney株)；非人类哺乳动物呼肠孤病毒；或鸟类呼肠孤病毒。本发明还考虑使用如下的重组呼肠孤病毒，该重组呼肠孤病毒来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段的重配，其中至少一种亲本病毒是经遗传改造的，包括一个或多个化学合成的基因组节段，经化学或物理诱变剂处理过，或者其本身是重组事件的结果。本发明还考虑使用如下的重组呼肠孤病毒，该重组呼肠孤病毒在化学诱变剂的存在下发生了重组，该化学诱变剂包括但不限于硫酸二甲酯和溴化乙锭，或者该重组呼肠孤病毒在物理诱变剂的存在下发生了重组，该物理诱导剂包括但不限于紫外线和其它形式的辐射。

本发明还考虑使用这样的重组呼肠孤病毒，其在一个或多个基因组节段中包括缺失或复制，包括由于与宿主细胞基因组重组而产生的额外的遗传信息，或包括合成基因。

可以通过例如向病毒粒子外层衣壳引入突变的外壳蛋白对呼肠孤病毒进行修饰。蛋白可以通过替换、插入或缺失进行突变。替换包括插入不同的氨基酸代替天然的氨基酸。插入包括在蛋白中的一个或多个位点插入额外的氨基酸残基。缺失包括在蛋白中一个或多个氨基酸残基的缺失。这些突变可以通过本领域已知的方法产生。例如，编码一种外壳蛋白的基因的寡核苷酸定点突变可能会导致产生希望的突变外壳蛋白。在呼肠孤病毒感染的哺乳动物细胞例如COS1细胞中，突变蛋白的体外表达可以导致将突变蛋白引入呼肠孤病毒的病毒粒子颗粒中(Turner和Duncan，1992；Duncan et al.，1991；Mah et al.，1990)。

呼肠孤病毒优选是经过修饰的呼肠孤病毒，以降低或消除针对呼肠孤病毒的免疫反应。这种经过修饰的呼肠孤病毒叫做“免疫保护呼肠孤病毒(immunoprotected reovirus)”。这种修饰可以包括将呼肠孤病毒包裹在脂质体、微团或其它媒介物(vehicle)中，以防被免疫系统识别。或者，呼肠孤病毒的病毒粒子颗粒的外层衣壳可以被除去，因为外层衣壳中所含的蛋白是宿主体液和细胞应答的主要决定因素。

此处所使用的将瘤细胞针对辐射“敏化(sensitizing)”是指用于改善肿瘤细胞对于辐射的敏感性的动作。

瘤细胞对于辐射的“敏感性”是瘤细胞对于辐射的抑制作用的易感性。例如，瘤细胞对于辐射的敏感性可以通过细胞应答辐射而生长速率下降显示出来。敏感性还可以通过瘤细胞导致的症状的减轻显现出来。

对辐射具有“抵抗性”的瘤细胞是指不被辐射杀死或者其生长不会被辐射抑制的瘤细胞。为了确定瘤细胞的生长是否被抑制，可以通过本领域已经建立的方法(例如细胞计数)来确定在有或无辐射的情况下的细胞生长速率。当生长速率在有或无辐射的情况下并无显著的不同的情况下，该瘤细胞的生长没有被辐射抑制。

对辐射具有“抵抗性”的肿瘤是指在有辐射情况下，其体积增加或体重增加的速率并不改变的肿瘤。或者，如果无论携带肿瘤的受试体在接受辐射或者不接受辐射时都显示出相似的肿瘤症状或指征，则肿瘤对辐射具有抵抗性。例如，白血球计数是普遍使用的白血病的指示。如果白血病病人在接受辐射以后，其白血球计数并没有显著改变的话，则该病人的白血病对辐射具有抵抗性。

对受试体“给予”病毒是指以能够接触靶点瘤细胞的方式将病毒给予受试体的动作。给予病毒的途径，以及制剂、载体或媒介物，都将依赖于靶点细胞的位点以及类型。多种给予途径可以被使用，并在后面更详细地被讨论。

“溶瘤病毒”是一种优先在瘤细胞上复制并杀死瘤细胞的病毒。溶瘤病毒可以是天然产生的病毒或改造的病毒。溶瘤病毒还包括免疫保护的和重配的病毒，正如对呼肠孤病毒详细地描述过。当病毒可以从天然来源分离出来，并且没有被人类在实验室中有意地修饰过，则该病毒为“天然产生的”。例如，病毒可以来源于“野生来源”，即来自感染的动物。当人类通过干预对病毒进行修饰的时候，该病毒为“改造的”病毒。

“转移性肿瘤”是在同一动物体内从另一处肿瘤转移而来的肿瘤。

“有效剂量”是足以达到预期效果的辐射试剂或呼肠孤病毒的剂量。对于用于治疗或改善肿瘤的辐射试剂而言，有效剂量为足以减轻或消除肿瘤症状或减缓肿瘤进展的辐射试剂的剂量。

此处使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“改善(ameliorating)”是指能够减轻疾病或者状况的作用、或者减轻疾病或者状况的症状的方法。因此在公开的方法中，治疗可以是指减轻或改善已确立的疾病或者状况的严重性的、或者疾病或者状况的症状的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，在受试体中，如果与对照相比，治疗癌症的方法能够降低疾病的一种或多种症状的10％，则该方法会被认为是治疗。因此，与天然的或者对照的水平相比，降低可以为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或在10与100之间任何百分比的降低。可以理解，治疗并不一定是指治愈或者完全消除疾病、状况、或者疾病或状况的症状。

此处使用的术语“受试体”可以为脊椎动物，更具体为哺乳动物(例如，人类、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼类、鸟类或爬虫动物或两栖动物。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，成体和新生的受试体以及胎儿，无论雄性或雌性，都希望包括在内。此处所使用的病人或受试体可以互换使用，可以是指患有疾病或失调的受试体。术语病人或受试体包括人类和兽类受试体。

通过复制溶瘤病毒杀死肿瘤细胞应提供了用于交叉致敏宿主免疫细胞的充足肿瘤抗原来源。但是，同时也会诱导抗病毒的免疫应答。因此，对于有效的抗肿瘤免疫的产生，溶瘤病毒局部杀死肿瘤是免疫治疗上有益的或是障碍，还是未知的。

进行了一些实验来调查当对肿瘤进行有效的溶瘤病毒治疗时病毒的复制、肿瘤细胞死亡和免疫反应性(包括对肿瘤和病毒抗原)之间的平衡如何。使用一种模型，在该模型内，对确立的B16黑素瘤进行直接地肿瘤内注射，注射4次呼肠孤病毒(5 x 10⁸pfu/注射)，大约治愈了50％的C57B1/6免疫活性小鼠(n＝8-10)，并产生了广泛的抗病毒免疫应答。但是，通过使用ELISPOT、分子内细胞因子和体内CFSE T细胞增殖分析，可以观察到肿瘤内病毒治疗确实可以针对确定的肿瘤抗原致敏初始T细胞( T cells)。而且，病毒治疗治愈的动物同时也对肿瘤形成了长期的免疫记忆。这些数据提示:设计用于增加针对肿瘤的活化T细胞的频率的其它方法将会增加溶瘤病毒治疗的有效性。因此，溶瘤病毒治疗与CD4+CD25+调节T细胞(Treg)的清除或与肿瘤抗原特异性的活化T细胞的过继性转移(adoptive transfer)相结合。结果显示，在没有Treg时治疗效果降低，并且在经过治疗的肿瘤细胞中，病毒复制的清除更加迅速。相反，与对照肿瘤相比相比，正在进行的局部病毒治疗增加了活化T细胞被吸引至肿瘤位点4倍以上，使得该治疗与单独使用病毒治疗或过继性T细胞转移治疗相比具有显著的改进。

因此，延长局部病毒复制和/或提高肿瘤特异性T细胞的频率的免疫干预应该对于局部、注射肿瘤以及不能够进行直接病毒注射的系统转移性疾病具有显著的治疗影响。

因此，本发明的一个方面提供了用于治疗或改善受试体中的实体肿瘤的方法，包括向实体肿瘤中或其附近注射有效剂量的溶瘤病毒，其中该溶瘤病毒能够选择性地杀死实体肿瘤细胞；以及抑制实体肿瘤位点处或临近该位点的局部免疫应答。为了改善或治疗受试体的实体肿瘤，给予溶瘤病毒和抑制局部免疫应答的步骤可以随意重复。这个方法通过拮抗抗病毒免疫应答而改善了实体肿瘤内的溶瘤病毒活性。溶瘤病毒介导肿瘤破坏的能力依赖于病毒在肿瘤肿块内的复制能力。肿瘤肿块内的抗病毒免疫通过抑制病毒在肿瘤内的扩散从而消除了溶瘤病毒治疗的有效性。1)病毒扩散和细胞溶解与2)抗病毒免疫应答之间的平衡可以通过在肿瘤内抑制免疫响答转而有利于病毒的复制和扩散。抗病毒免疫应答可以例如通过照射实体肿瘤或在肿瘤位点处或邻近该位点给予免疫抑制试剂而加以抑制。优选地，局部抗病毒免疫响答可以通过辐射加以抑制。在免疫抑制试剂能够充分地保留在实体肿瘤中的情况下，可以给予免疫抑制试剂。免疫抑制试剂可以通过多次剂量给予。免疫抑制试剂可以为抗抗病毒抗体。优选地，免疫抑制足以降低实体肿瘤中白细胞渗透的量，而不损害哺乳动物的免疫系统。这可以通过例如使用适当剂量的辐射或免疫抑制试剂来实现，和/或通过将免疫抑制试剂限制于实体肿瘤而实现。

放射性治疗也叫做辐射治疗，是一种通过典型为离子化辐射的辐射治疗癌症和其它疾病的治疗方式。放射性治疗可以被用于治疗局部实体肿瘤，例如皮肤、舌、喉、脑、乳腺或子宫颈的癌症。它还可以用于治疗白血病和淋巴瘤。

用于辐射治疗的辐射的剂量以戈瑞(Gy)为单位测量，随着所治疗的癌症的类型和阶段而不同。对于治疗性(基本的)的病例，用于实体上皮性肿瘤的典型剂量为50至70Gy，而使用20至40Gy治疗淋巴瘤。预防性(辅助的)剂量典型地大约在50至60Gy之间，每次2Gy。通常情况下，辐射的总体剂量随时间分成多个部分。典型的分割时间表包括但不仅限于每天1.5至2Gy。

正如此处所描述的，低剂量的辐射足以改善在实体肿瘤内的溶瘤病毒活性。具体地，仅仅5Gy的辐射就足以改善实体肿瘤内的溶瘤病毒活性。在提供的方法中所用的适当的辐射总剂量包括但不限于1、5、10、15、20、25、30、35、40和70Gy的辐射，或在1至70Gy之间的任何剂量的辐射。辐射的剂量可以被给予在肿瘤位点或者其附近，可以一次性给予或者在一段时间内分成多个部分给予。

通常使用的一种辐射治疗包括光子(电磁能量)。X射线是用于治疗癌症的光子辐射的第一种形式。取决于X射线所具有的能量数值，射线可以用于在身体表面或深层破坏癌细胞。线性加速器和电子感应加速器是能够产生能量不断增大的X射线的机器。使用该机器将辐射(例如X射线)聚焦在癌症位点称为“体外放射治疗(external beamradiotherapy)”。

伽马射线是用于放射治疗的另一种形式的光子。当特定的元素(例如镭、铀和钴60)衰减时释放辐射，就自发地产生了伽马射线。每种元素按照特定的速率进行衰减，以伽马射线和其它颗粒形式释放能量。X射线和伽马射线对于癌细胞具有相同的效果。

另外一种用于传递辐射到癌细胞的技术是将放射性的植入物直接放在肿瘤或体腔内。这种技术叫作“体内放射治疗(internalradiotherapy)”，近距放射治疗(brachytherapy)、间质内照射(interstitialirradiation)、和腔内照射(intracavitary irradiation)是几种体内放射类型。在这种治疗中，辐射剂量集中在小区域内。内放射经常被用于舌、子宫和子宫颈癌症。

几种新的放射治疗的方法正在被评估，以确定其治疗癌症的有效性。其中一种技术为手术中照射(intraoperative irradiation)，其中将大剂量的外部辐射在手术过程中直接引向肿瘤和周围组织。另一种研究的方法为粒子束辐射治疗。这种类型的治疗与光子放射治疗之间的不同在于:该治疗包括使用迅速移动的亚原子颗粒来治疗局部癌。需种非常精密的机器来产生和加速此过程需要的颗粒。相比于X射线或伽马射线，一些颗粒(中子、介子和重离子)在它们穿过组织的途中留下了更多的能量，因此对它们所撞击的细胞造成了损伤。这种类型的辐射经常被称作高线性能量转移(高LET)辐射。另一个最近的放射性治疗研究集中在使用带有放射性标记的抗体将辐射剂量直接输送到癌症位点(放射免疫治疗)。

一直在积极地寻找提高辐射治疗有效性的方法。正在研究两种类型的研究用药物，研究其对于接受辐射的细胞的作用。辐射敏化剂(radiosensitizers)使得肿瘤细胞更可能被损坏，辐射保护剂(radioprotectors)保护正常组织免受辐射的作用。利用高温加热使组织对辐射敏感化的有效性也正在研究当中。可以想到，本领域已知的任何辐射敏化剂或辐射保护剂能够以与本发明一致的方式与本发明共同使用。

本发明中有用的放射试剂可以为本领域已知的任何放射试剂，包括但不限于X射线、伽马射线(例如镭、铀或钴60所产生的伽马射线)、以及粒子束(例如电子、中子、介子和重离子)。辐射可以是体外放射治疗和体内放射治疗(包括近距放射治疗、间质内照射和腔内照射)的形式。放射试剂可以像在放射免疫治疗中一样与抗体相连，也可以像在手术放射性治疗中一样使用在手术过程中。

能够用于实施所提供的方法的溶瘤病毒包括但不限于:肌尾噬菌体科(myoviridae)、长尾噬菌体科(siphoviridae)、短尾噬菌体科(podpviridae)、复层噬菌体科(teciviridae)、覆盖噬菌体科(corticoviridae)、芽生噬菌体科(plasmaviridae)、脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)、微小纺锤形噬菌体科(fuselloviridae)、痘病毒科(poxyiridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、藻类DNA病毒科(phycodnaviridae)、杆状病毒科(baculoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、腺病毒科(adnoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、多分体DNA病毒科(polydnaviridae)、丝状噬菌体科(inoviridae)、微小噬菌体科(microviridae)、双生病毒科(geminiviridae)、圆环病毒科(circoviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、囊状噬菌体科(cyctoviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、双RNA病毒科(birnaviridae)、副粘液病毒科(paramyxoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、正粘液病毒科(orthomyxoviridae)、布尼安病毒科(bunyaviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、光滑噬菌体科(leviviridae)、小RNA病毒科(picornaviridae)、伴生病毒科(sequiviridae)、豇豆花叶病毒科(comoviridae)、马铃薯Y病毒科(potyviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、星状病毒科(astroviridae)、野田病毒科(nodaviridae)、四病毒科(tetraviridae)、番茄丛矮病毒科(tombusviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(glaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)和杆状RNA病毒科(barnaviridae)家族中成员的溶瘤病毒。其它溶瘤病毒的免疫保护或重配病毒也包括在所提供的方法中。此外，至少两种溶瘤病毒的组合也同样可以用于实施所提供的方法。少数溶瘤蛋白在后面有所讨论，在本领域中的普通技术人员也可以根据此处公开的和本领域已知的知识使用其它的溶瘤病毒实施本发明。

通常，当病毒进入细胞，双链RNA激酶(PKR)被激活并阻断蛋白合成，病毒不能够在此细胞中进行复制。一些病毒已经生成了一种系统来抑制PKR，从而有助于病毒蛋白合成和病毒复制。例如，腺病毒产生大量的小RNA，VA1 RNA。VA1 RNA具有广泛的二级结构，与通常情况下激活PKR的双链RNA(dsRNA)相竞争结合PKR。由于需要最小长度的dsRNA来激活PKR，因此VA1 RNA不能够激活PKR。相反，VA1 RNA能够依赖其量多的特征来隔离PKR。因此，蛋白合成不会被阻断，腺病毒可以在细胞内进行复制。

Ras激活的瘤细胞不会由于PKR而受到蛋白合成的抑制，因为ras使PKR失活。因此这些细胞容易被病毒感染，即使病毒不具有PKR-抑制系统。因此，如果在腺病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒或副痘病毒属羊口疮病毒(parapoxvirus orf virus)中PKR抑制剂突变，以至于再也不能够阻断PKR的功能，那么因此得到的病毒就会由于PKR抑制蛋白合成而不能够感染正常细胞，但是它们可以在缺乏PKR活性的ras-激活的瘤细胞中进行复制。

因此，经过修饰和突变而不能抑制PKR功能的病毒选择性地在ra激活的瘤细胞中进行复制，而正常细胞是抵抗性的。优选地，病毒为在VA1区域有突变的腺病毒、在K3L和/或E3L区域有突变的牛痘病毒、在OV20.0L基因中有突变的副痘病毒属羊口疮病毒，或在NS-1基因中有突变的流感病毒。病毒优选不是在γ134.5基因中有突变的疱疹病毒。

根据已知的病毒PKR抑制剂的结构-功能关系，病毒可以被修饰或突变。例如，由于E3蛋白的氨基酸末端区域与PKR的羧基-末端区域的结构域相互作用，因此这个结构域的缺失或点突变能够阻止抗PKR功能(Chang et al.，1992，1993，1995；Sharp et al.，1998；Romano et al.，1998)。牛痘病毒的K3L基因编码pK3，pK3是PKR的伪底物(pseudosubstrate)。在K3L内存在功能缺失突变。与eIF-2的79至83残基同源的K3L蛋白的C-末端部分的截短或点突变破坏了PKR的抑制性活性(Kawagishi-Kobayashi et al.，1997)。

另一个例子是Delta24病毒，它是在E1A区域携带24个碱基对的缺失(Fueyo et al.，2000)的突变腺病毒。这个区域负责与细胞的肿瘤抑制剂Rb结合以及抑制Rb功能，从而允许细胞的增殖机能以及病毒的复制而以非控制的形式进行。Delta24在Rb结合区域有缺失，不能与Rb相结合。因此，在正常细胞内，突变病毒的复制被Rb抑制。但是，如果Rb失活并且细胞变成瘤细胞的时候，Delta24将不再被抑制。相反，突变病毒可以高效地进行复制以及溶解Rb缺陷性细胞。

此外，水泡性口炎病毒(VSV)选择性地杀死瘤细胞(并且可选地加入干扰素)。据显示，核糖核苷酸还原酶表达有缺陷的单纯疱疹病毒1(HSV-1)的突变株hrR3在结肠癌细胞中进行复制，但是不能在正常的肝细胞内进行复制(Yoon et al.，2000)。新城疫病毒(NDV)优选在恶性细胞内进行复制，最常使用的株为73-T(Reichard et al.，1992；Zornet al.，1994；Bar-Eli et al.，1996)。牛痘病毒在一些恶性肿瘤细胞系中可以进行传播。据显示，脑炎病毒在小鼠肉瘤肿瘤中具有溶瘤作用，但是为了减少其在正常细胞中的传染性，要求减少其剂量。已经描述了在感染带状疱疹、肝炎病毒、流感、水痘和麻疹病毒的肿瘤病人中出现肿瘤的退化(评论请见Nemunaitis，1999)。

辛德毕斯病毒(SIN)可被用于此处描述的方法之中。辛德毕斯病毒是披衣病毒科(togaviridae)家族中的阿尔法病毒属(alphavirus genus)中的成员。辛德毕斯病毒基因组为11703个核苷的单链RNA，在5’末端带帽，在3’-末端多聚腺苷酸化。基因组包括49S不翻译区(UT)、非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4，然后是启动子。启动子之后是26SUT、结构蛋白C、E3、E2、6K和E1，最后是3’-UT和多聚腺苷酸化末端。染色体组49S RNA是正义的，有传染性的，在被感染的细胞内起mRNA作用。

辛德毕斯载体能够在体内系统地和特异性地感染/检测以及杀死转移性肿瘤，导致了对于肿瘤生长的显著抑制，并提高了存活机会(Hurtadoet al.，Rejuvenation Res.9(1):36-44(2006))。已知辛德毕斯病毒通过使用Mr 67,000昆布氨酸受体感染哺乳动物细胞，该受体水平在肿瘤中比在正常细胞有所提高，小干扰RNA所导致的昆布氨酸受体表达下调大大降低了辛德毕斯载体的感染性。肿瘤昆布氨酸受体的过表达可以解释辛德毕斯载体在体内对于肿瘤细胞所展示的特异性和有效性。辛德毕斯不一定需要经过遗传处理来靶向癌细胞或被直接注射到肿瘤中。辛德毕斯可以被注射到受试体的任何地方，并通过血流到达靶点区域(Tseng et al.，Cancer Res.64(18):6684-92(2004))。辛德毕斯还可以被遗传改造从而携带一种或多种能够抑制针对病毒的免疫应答的基因，和/或能够促进针对肿瘤的免疫响答的基因，例如抗肿瘤细胞因子基因，例如白细胞间介素-12和白细胞间介素-15基因。

溶瘤病毒可以是天然产生的或经修饰的。在给予到瘤细胞之前，病毒可以经过化学或生物化学的预处理(例如使用蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶进行处理)。使用蛋白酶进行预处理除去病毒的外层或衣壳，可以增加病毒的感染性。病毒可以被包裹在脂质体或微团中，以降低或防止来自已针对该病毒产生了免疫性的哺乳动物的免疫应答(Chandron和Nibert，1998)。例如，在存在能够形成微团的浓度的烷基硫酸盐去垢剂时使用胰凝乳蛋白酶处理病毒粒子，从而产生新的传染性亚病毒颗粒(ISVP)。溶瘤病毒还可以为重配的病毒或ISVP。

优选地，病毒并不是输送用于基因治疗目的基因的媒介物。例如，病毒已经被改造以用于输送腺病毒的E1A基因、p53肿瘤抑制基因、前药编码基因(Chmura et al.，1999；2001)或辐射可诱导启动子下的基因。事实上这些病毒经常不能够优选地在瘤细胞内进行复制，因此并不是溶瘤病毒。同样优选地，病毒不是改造的腺病毒或疱疹病毒，或表达功能性E1A蛋白的病毒。

本领域普通技术人员能够根据在此公开的和本领域已有的知识通过使用任何一种溶瘤病毒来实施本方法。溶瘤病毒可以是天然产生的或经修饰的。当溶瘤病毒可以从天然来源中被分离出来并且没有被人类在实验室有意进行修饰过的时候，其是“天然产生的”。例如，溶瘤病毒可以来源于“野生来源”，即来源于被溶瘤病毒感染的人类。

溶瘤病毒可以是通过对来自两种或多种遗传上不同的溶瘤病毒的基因组节段重组/重配而形成的重组溶瘤病毒。溶瘤病毒基因组节段的重组/重配可以自然发生，发生在宿主生物体被至少两种遗传上不同的溶瘤病毒感染之后。重组病毒粒子还可以在细胞培养液中产生，例如，通过以遗传上不同的溶瘤病毒同时感染宿主细胞。本发明进一步考虑使用通过对来自两种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段重配而形成的重组呼肠孤病毒，其中至少一种亲本病毒是遗传上改造的，包括一个或多个化学合成的染色体组节段，经化学或物理诱变剂处理过，或者本身是重组事件的结果。本发明进一步考虑使用在化学诱变剂的存在下、或者在物理诱导剂的存在下发生重组的重组溶瘤病毒，该化学诱变剂包括但是不限于硫酸二甲酯和溴化乙锭，该物理诱导剂包括但不限于紫外线光和其它形式的辐射。

本发明进一步考虑使用这样的重组溶瘤病毒，其在一个或多个基因组节段中包括缺失或复制，包括由于与宿主细胞基因组发生重组所得的额外遗传信息，或包括合成的基因，例如编码抑制抗病毒免疫应答的试剂。

可以通过例如向病毒粒子外层衣壳引入突变的外壳蛋白对溶瘤病毒进行修饰。蛋白可以通过替换、插入或删除进行突变。替换包括插入不同的氨基酸代替天然的氨基酸。插入包括在蛋白中的一个或多个位点插入额外的氨基酸残基。缺失包括在蛋白中一个或多个氨基酸残基的缺失。这样的突变可以通过本领域已知的方法产生。例如，编码外壳蛋白之一的基因的寡核苷酸定点突变可能会导致产生希望的突变外壳蛋白。在溶瘤病毒感染的哺乳动物细胞例如COS 1细胞中，突变蛋白的体外表达可能会导致将突变蛋白引入溶瘤病毒的病毒粒子颗粒中。

在所提供的方法中，以最终能够接触靶点肿瘤或肿瘤细胞的方式给予溶瘤病毒。一方面，给予溶瘤病毒并不是系统进行的。给予病毒的途径，以及制剂、载体或媒介物，依赖于靶点细胞的位点以及类型。可以使用多种给予途径。例如，对于可到达的实体肿瘤，可以将溶瘤病毒直接注射到肿瘤中。例如，对于造血系统肿瘤，溶瘤病毒可以通过静脉或血管内给药。对于那些在体内不容易到达的肿瘤，例如转移性肿瘤，溶瘤病毒可以以这样一种方式给予，即溶瘤病毒可以系统性地在哺乳动物体内转移从而到达肿瘤(例如静脉或肌肉内)。另一种选择是，溶瘤病毒可以直接给予到单一实体肿瘤中，然后在体内再被系统性地转运到所述转移处。溶瘤病毒还可以经皮下、腹膜内、鞘内(例如用于脑肿瘤)、局部(例如用于黑素瘤)、口服(例如用于口或食道癌)、直肠内(例如用于结肠直肠癌)、阴道内(例如用于子宫颈或阴道癌)、鼻内给药或通过吸入喷雾剂(例如用于肺癌)。

因此此处所提供的病毒可以在药物可接受的载体中在体外或体内给药。药物可以接受的是指材料并不是在生物学上或其它情况下所不希望的，即该材料可以被给予受试体而不会引起任何不希望的生物学效果，或不会与其所包含于药物组合物中的任何其它成分以有害的方式相互作用。正如本领域技术人员所熟知，载体将会被自然地进行选择以最小化活性成分的降解，并最小化受试体的任何不良副作用。

因此，该发明还包括包含溶瘤病毒和/或其它活性试剂(例如，希望的化学治疗剂)的药物组合物。在制造药物组合物过程中，试剂经常与赋形剂相混合，经赋形剂稀释或包含在为胶囊、香袋(sachet)、纸或其它容器形式的这样的载体中。当药物可以接受的赋形剂作为稀释剂使用时，其可以为固体、半固体，或液体物质，并充当活性成分的媒介物、载体或介质。因此，该组合物可以为片剂、丸剂、粉末、锭剂、香袋、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、例如包含最多10％重量活性化合物的药膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射用溶液、和无菌密封粉末的形式。

适合的赋形剂的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄耆胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。制剂还另外包括:润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁，和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如甲基和丙基羟基苯甲酸酯；甜味剂；和调味剂。该发明中的组合物可以被配制为使得通过本领域已知的程序对受试体给药后，能够提供迅速的、持续的或延长的有效成分释放。

当制备如片剂的固体组合物时，有效成分与药物赋形剂混合以形成含有均匀混合的活性成分的固体配制前组合物(preformulationcomposition)。当提及配制前组合物为均匀的，意味着活性成分在组合物中是均匀分布的，使得组合物可以容易地细分为效用相等的单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊。

本发明的片剂或丸剂可以被包裹或混合起来以获得延长作用时间好处的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量成分，后者以外壳的形式包裹前者。两种成分可以通过肠溶衣层分开，肠溶衣在胃部可以抵抗瓦解，使得内部组分可以完整地进入十二指肠或可以延缓其释放。可以使用不同的材料用于肠溶衣或包衣层(coatings)，这些材料包括许多聚合酸，以及聚合酸与诸如虫漆、十六烷醇和醋酸纤维素的这些材料的混合物。

用于口服或通过注射给药的所述组合物可以被并入的液体形式包括水溶液、适宜口味的糖浆、水性或油性悬浮剂、以及含有例如玉米油、棉花子油、芝麻油、椰子油或花生油的食用油的经调味乳剂、以及酏剂和类似的药物媒介物。

用于吸入或吹入的组合物包括在药物可以接受的水或有机溶剂或它们的混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可以包括适宜的药物可以接受的媒介物，如此处所描述的。优选地，组合物经过口服或鼻呼吸途径给药，用于局部或全身作用。优选地，药物可以接受的溶剂中的组合物可以通过使用惰性气体喷雾给药。喷雾溶液可以从喷雾装置直接吸入，或者喷雾装置可以与面罩吸入器(face mask tent)或间歇的正压呼吸机相连。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从能以适当方式输送制剂的装置优选地通过口或鼻给药。

另外一种在此提供的方法中使用的制剂使用了经皮输送装置(“贴剂”)。这种经皮贴剂可用于以可控量提供本发明呼肠孤病毒的连续或间断输注。用于输送药物试剂的经皮贴剂的构造和用途是本领域公知的。例如，参见U.S.Pat.No.5,023,252，在此通过引用方式加入本申请。这种贴剂可以被构建用于连续的、脉动的或按要求输送药物试剂。

本发明中使用的其它适宜的制剂能够在《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)中找到。

溶瘤病毒可以被包装在方便的试剂盒中，该试剂盒提供了装在适宜的容器内的必要材料。已经想到，该试剂盒还可以包括用于提高对于肿瘤的免疫应答的试剂、用于抑制对于溶瘤病毒的局部免疫应答的试剂、化学治疗试剂和/或其它希望的药物活性试剂。

以足以治疗肿瘤或瘤的剂量(例如“有效剂量”)给予溶瘤病毒。结果有可能导致瘤体积的减小，或者瘤的完全清除。瘤体积的减小或瘤的消除通常是由于溶瘤病毒的溶解瘤细胞(“溶瘤作用”)导致的。优选地，有效剂量为大约1.0pfu/kg体重至大约10¹⁵pfu/kg体重，更优选地为大约10²pfu/kg体重至大约10¹³pfu/kg体重。例如，对于治疗受试体，可以根据肿瘤所呈现的类型、体积和数量，使用大约10²至10¹⁷空斑形成单位(PFU)的病毒。根据个体并至少部分地基于对溶瘤病毒类型的考虑；选择的给药途径；个体的大小、年龄、性别；病人症状的严重性；瘤的体积和其它特征等来决定有效剂量。治疗过程可以持续几天到几个月，或者直到实现了疾病的减轻。

可以通过单剂量或多剂量(即多于一次剂量)给予溶瘤病毒。多剂量被同时或连续性地(例如在几天或几周的时间段内)给予。还可以在同一受试体的多个瘤上给予溶瘤病毒。可以在给予免疫抑制剂之前、同时或之后给予溶瘤病毒。溶瘤病毒可以通过不同的给予途径例如IV、IP等(连续地或伴随地)被输送。给予病毒和/或免疫抑制剂的过程可以为一次或多次。

优选地，溶瘤病毒被配制为单位剂量形式，每一剂量包括大约10²pfus到大约10¹⁷pfus的呼肠孤病毒。术语“单位剂量形式”是指物理上不连续的单位，作为单元剂量用于受试体，每个单位包括与适宜的药物赋形剂结合的、为了产生希望的治疗作用而计算出的溶瘤病毒的预定量。

组合物的有效剂量取决于多种因素，因此可能随受试体而有某种程度的变化。有效剂量和给予组合物的时间表可以通过经验决定，决定方式在本领域是已知的。所需的确切剂量将随受试体变化，其取决于物种、年龄、体重和受试体的总体情况、接受治疗的疾病的严重性、使用的特定病毒或载体以及其给药方式。因此，不可能为每种组合物指定确切剂量。但是，仅仅通过此处所提供的指导来使用日常实验，本领域普通技术人员就可决定合适剂量。

用于给予组合物的剂量范围大到足以提供所希望的效果，使得疾病的症状受到影响。剂量不应该大到会引发不良副作用，例如不希望的交叉反应和过敏性反应。如果发生任何禁忌症时，剂量可以由个人医师进行调节。

此处所描述的溶瘤病毒可以被用于多种用途。它们可被用于治疗哺乳动物ras介导的增殖失调的方法中。病毒可用于减小或消除瘤。它们可以被用在治疗转移的方法中。

已经想到，所提供的方法可以与其它肿瘤治疗例如化学治疗、放射性治疗、手术、激素治疗和/或免疫治疗相结合。因此，溶瘤病毒的给药可以与手术或去除瘤联合。因此，此处提供了用于治疗实体瘤的方法，包括瘤的手术去除和在瘤位点或其附近给予溶瘤病毒。

还考虑，溶瘤病毒可以与已知的抗癌化合物或化学治疗试剂联合给予或在其基础上附加给予。化学治疗试剂为可以抑制肿瘤生长的化合物。这些试剂包括但不限于五氟脲嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、氮烯唑胺、米托蒽醌、蒽环类(表柔比星和多柔比星)、受体抗体例如赫赛汀、依托泊苷、pregnasome、铂化合物例如卡铂和顺铂、紫杉烷类例如紫杉醇和多烯紫杉醇、激素治疗剂如他莫西芬和抗雌激素、干扰素、芳香酶抑制剂、促孕剂和LHRH类似物。

许多本发明的实施方案已经被描述。然而，可以理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以做出各种修改。本发明的其它的特征、目标和优点由于说明书和权利要求书而显而易见。

实施例

实施例1.体外和体内辐射提高呼肠孤病毒的细胞毒性

Ras信号途径决定肿瘤细胞的辐射敏感性。ras激活促进了暴露于辐射后肿瘤细胞的存活。Ras激活与体外和体内增加的辐射抵抗力相关。为了决定呼肠孤病毒是否在体外增强呼肠孤病毒的细胞毒性，将细胞铺板，然后使用5戈瑞进行处理或假处理。4小时后，血清型3呼肠孤病毒(Dearing株)被给予细胞。使用结晶紫量化细胞的存活。图1显示仅仅5Gy的辐射增强了呼肠孤病毒的细胞毒性。

为了决定体内的辐射和呼肠孤病毒作用，分段的放射性治疗和呼肠孤病毒(鞘内给药)被给予小鼠HCT116异种移植肿瘤(图2A)或B16同基因肿瘤(图2B)中。图2显示，在免疫缺陷和免疫活性动物模型中，对于给予辐射和呼肠孤病毒后在体内减小肿瘤体积而言，比仅使用呼肠孤病毒或辐射效果好。

这些结果显示出，呼肠孤病毒不会因为临床相关剂量的γ射线辐射而失活，辐射增强了呼肠孤病毒的细胞毒性。这些结果还显示出，被观察到的增强的细胞毒性不依赖于辐射的时间安排。呼肠孤病毒和辐射可以单独诱导细胞阻滞在G2/M期，同时使用可以增加细胞凋亡的水平。

实施例2.呼肠孤病毒和放射性治疗对人类的效果

确定呼肠孤病毒和放射性治疗对人类效果的研究设计如表1所示。

表1.研究设计

 

阶段	病人x群	Reolysin的剂量(TCID50)	RT(Gy)	病毒的剂量	病毒给药日
						Ia	3	1 x 108	20Gy，5F	2	2，4
Ia	3	1 x 109	20Gy，5F	2	2，4

根据可测量的病变(靶病变)、表明的缓和性RT、PS(ECOG)≤2、足够的血液学、肾脏和肝功能将病人包括进来。排除病变已经过辐射的病人或接受免疫抑制治疗的病人或已知感染HIV、Hep B或C的病人。

Reolysin的量取决于病变的靶体积。肿瘤体积根据测量三个正交直径(D1、D2和D3)并采用V＝π/6 x D1 x D2 x D3方程计算。肿瘤接受2至10毫升的注射体积。

根据肿瘤总体积，辐射通过电子或中电压X射线传送。肿瘤总体积通过临床和/或放射性检查进行三维描绘。加入了1厘米的环周切缘，以包括计划的靶体积。

剂量限制性毒性(DLT)如下确定:ANC<0.5 x 10⁹持续多于五天或ANC<0.5 x 10⁹并具有脓毒病；血小板计数<25 x 10⁹/L；2级神经毒性或心脏毒性；或任何其它药物相关的非血液学3/4级毒性，除在没有给予适当的预防和治疗措施时的流感样症状、恶心和呕吐以外。

病人摘要如表2所示。

表2.病人摘要

 

肿瘤类型	年龄	性别	靶损伤	呼肠孤病毒剂量(TCID50)	辐射剂量
						食管	56	M	锁骨上淋巴结	1 x 108	20Gy
黑素瘤	58	M	腹股沟节结	1 x 108	20Gy
						胰腺	67	M	腹壁肿块	1 x 108	20Gy
卵巢*	58	F	背部节结	1 x 109	20Gy
						未知原发性鳞状细胞	41	F	锁骨节结	1 x 109	20Gy
头皮鳞状细胞	71	M	左腮腺	1 x 109	20Gy
						小细胞肺癌	70	M	臂部节结	1 x 109	20Gy

^*病人仅接收了一个剂量的呼肠孤病毒。

为了测量呼肠孤病毒的排泄，在治疗之前和之后采集受试体的样品。从血液、尿液、粪便和唾液中提取RNA。RT-PCR分析显示在任何剂量水平下这些受试体中没有检测到病毒的排出。

为了确定辐射是否抑制局部免疫响应，中和抗病毒抗体的水平被检验。表3示出了辐射防止了对中和抗肿瘤抗体的诱导。

表3示出了在靶病变内呼肠孤病毒和辐射的抗肿瘤活性。

表3.在靶病变内的抗肿瘤活性

 

肿瘤类型	靶点损伤	1个月的反应	2个月的反应	3个月的反应
					食管	锁骨上淋巴结	PR	PR	PR
黑素瘤	腹股沟节结	SD	-	-
					胰腺	腹壁肿块	PD	-	-
未知原发性鳞状细胞	锁骨节结	PR	PR	PR
					头皮鳞状细胞	左腮腺	SD	SD	pPR

PR-部分应答；SD-稳定疾病；PD-进行性疾病；pPR-病理性部分应答。

这些结果显示:肿瘤内呼肠孤病毒和辐射的联合使用被很好地耐受。此外，没有观察到DLT、病毒排出或中和抗呼肠孤病毒抗体。

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在本申请上文中或其它地方所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式引入本文，其程度相当于每个单独的出版物、专利申请或专利的公开内容都被具体地和逐一地表明通过引用方式将其全部内容引入本文。

Claims (17)

1.治疗或改善受试体中的实体肿瘤的方法，包括：

(a)向所述实体肿瘤或其附近注射有效量的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒能够选择性地杀死所述实体肿瘤的细胞；以及

(b)抑制所述实体肿瘤处或其附近的局部免疫应答。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)通过用有效量的辐射试剂照射所述实体肿瘤来进行。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述辐射试剂选自由电子、X射线和γ射线构成的组。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述辐射试剂的量为50Gy或更少。

5.如权利要求2或3所述的方法，其中所述辐射试剂的量为30Gy或更少。

6.如权利要求2或3所述的方法，其中所述辐射试剂的量为大约1Gy至大约30Gy。

7.如权利要求2或3所述的方法，其中所述辐射试剂的量为5Gy。

8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述辐射试剂以多剂量给予。

9.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)通过向所述实体肿瘤或其附近给予免疫抑制试剂来进行。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述免疫抑制试剂以多剂量给药。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒选自由呼肠孤病毒、辛德毕斯病毒、具有突变或缺失而不抑制双链RNA激活蛋白激酶(PKR)的病毒、Delta24、水泡性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、牛痘病毒、脑炎病毒、带状疱疹病毒、肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒和麻疹病毒构成的组。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒或人类呼肠孤病毒。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒选自由血清型1呼肠孤病毒、血清型2呼肠孤病毒和血清型3呼肠孤病毒构成的组。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒是血清型3呼肠孤病毒。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述受试体选自由狗、猫、啮齿动物、绵羊、山羊、牛、马、猪、人类和非人类灵长类构成的组。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒不是系统性给药的。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中(a)步骤在(b)步骤之前进行。

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